Tugas Imunoblotting

Kelompok 3
 Indah Widyaningrum 155130100111031 2015C
 Fakhira Rahmadiani 155130100111034 2015C
 Anugrah Natalia Putri Talenta 155130100111035 2015C
 Rifen Prabawan K.T.W 155130100111036 2015C
 Husayn Satria N 155130100111037 2015C

MACAM – MACAM TEKNIK STAINING IMUNOBLOTTING

Blotting adalah suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi

keberadaan protein dalam suatu sampel. Metode ini menggunakan elektroforesis
gel untuk memisahkan protein berdasarkan bobot molekulnya. Protein tersebut
kemudian ditransfer dari gel hasil elektroforesis ke dalam suatu membran
nitroselulosa, yang akan diuji menggunakan antibodi yang spesifik terhadap
protein tersebut. Blotting digunakan secara luas untuk menentukan ukuran antigen
dan antibodi yang diketahui, serta untuk identifikasi dan pencirian antigen dari
campuran antigen yang tidak diketahui, serta uji alergi (Anggraeni, 2007).
Ada beberapa teknik staining blotting yang dapat digunakan yakni adalah
southern blot, northern blot, eastern blot dan western blot. Berikut adalah
perbedaan diantaranya ketiganya:
 WESTERN-BLOT / IMMUNOBLOTTING
Teknik ini menggunakan proses transfer protein dari matriks gel ke
membran nitroselulosa dan proses deteksinya secara imunologi (Anggraeni,
2007).
Menurut Fatchiyah (2012) western bloting atau imunobloting adalah
istilah yang dipakai untuk proses transfer dan imunodeteksi protein pada gel
yang bertujuan untuk:
1. Mengetahui keberadaan dan berat molekul protein sampel dalam
suatu campuran
2. Membandingkan reaksi silang antar protein
3. Mempelajari modifikasi protein selama sintesis
Dengan cara ini protein dalam hitungan nanogram dapat terdeteksi.
 Imunodeteksi tidak dilakukan langsung pada gel karena sifat gel yang
rapuh untuk dapat melalui proses inkubasi yang lama dan pencucian yang
berulang kali. Untuk mengatasi hal itu, maka protein terlebih dahulu
ditransfer dari gel ke membran nitro-cellulose (NC) atau membran PVDF
(polyvinylidene difluoride). Membran dipakai sebagai tempat melekatnya
protein yang diuji karena :
1. Mudah manipulasinya
2. Mengurangi lama inkubasi dan pencucian
3. Hasil protein yang ditransfer (hasil blot) dapat dipakai lagi untuk
imunodeteksi protein yang lain (sesudah diinkubasi dengan detergen
untuk menghilangkan probing reagent)
4. Blot dapat disimpan sampai 1 bulan
5. Blot sesuai untuk berbagai prosedur deteksi
Prosedur Western bloting diawali dibagi menjadi 6 tahapan yaitu :

1. Preparasi sample (bertindak sebagai antigen)

2. Separasi protein pada gel elektroforesis
3. Transfer proten dari gel elektroforesis ke membran PVDF atau NC
4. Bloking nonspecific binding sites pada membran
5. Penambahan antibodi primer, antibodi sekunder
6. Deteksi atau visualisasi pengikatan antigen-antibodi
(Fatchiyah, 2012)

 SOUTHERN BLOT
Teknik ini merupakan metode pemindahan ruas DNA dari matriks gel ke
penunjang padat, yaitu lembar nitroselulosa (Anggraeni, 2007).
 Dinamai setelah penemunya, biologi Edwin Southern, Southern Blot
adalah metode untuk menyelidiki keberadaan sekuens DNA tertentu dalam
sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi
dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran
dengan blotting melalui aksi kapiler. Membran tersebut kemudian terkena
probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan
DNA pada bunga. Kebanyakan protokol asli yang digunakan label
radioaktif, namun non-radioaktif alternatif yang sekarang tersedia. Southern
blotting kurang umum digunakan dalam ilmu laboratorium karena kapasitas
teknik lain, seperti PCR, untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dari sampel
DNA. Bercak ini masih digunakan untuk beberapa aplikasi, bagaimanapun,
seperti mengukur jumlah
salinan transgen pada tikus
transgenik, atau rekayasa
gen sel induk garis KO
embrio (Brown, 2007).
Teknik ini mentransfer
DNA ke kertas NC dengan
menggunakan prosedur
aliran pelarut. Caranya yaitu
dengan menempatkan gel
elektroforesis ke kertas
matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang
telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan
ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan
mengalir pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel yang
membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap oleh
kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan
pelacak.Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa
ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida.Lokasi sinyal yang terlihat
setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen
DNA tersebut (Brown, 2007).
 Di bawah kondisi-kondisi optimal, Southern blot mendeteksi ~ 0.1 pg
DNA yang menarik. Blot teknik digunakan untuk memindahkan protein
DNA dan RNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan, dan sering
juga diikuti penggunaan suatu gel ectrophoresis. Southern blot digunakan
untuk memindahkan DNA. Digunakan biologi molekular untuk melihat
kemungkinan kehadiran suatu urutan DNA dalam suatu sample DNA.
Southern blot Southern berkombinasi gel agarose electrophoresis untuk
separasi ukuran DNA dengan metoda untuk memindahkan DNA ke suatu
membran filter untuk pemeriksaan hybridisasi. Metoda lain adalah Western
blot dan Northern blot memiliki prinsip kerja yang sama tetapi
menggunakan RNA dan protein (Brown, 2007).
Setelah electrophoresis, gel tersebut diperlakukan dengan suatu alkali
yang menyebabkan DNA terdenaturasi dan terpisah menjadi rantai
tunggal.Suatu membran seperti selaput ditempatkan pada gel dan diberi
tekanan melalui pengisapan atau metoda mundane dalam kertas handuk
(paper towels) dengan suatu berat.DNA berpindah tempat ke membran dan
stick.Membran DNA-impregnanted dibakar atau menyebar secara permanen
dengan menyertakan DNA tersebut. Molekul yang kemudian diperlakukan
dengan suatu pemeriksaan hybridisasi yang mana hanya suatu molekul
DNA dengan urutan dikenali yang akan dipasangkan dengan urutan DNA
yang telah ditandai (diblot). Pemeriksaan DNA berlabel dengan fluorescents
atau chromogenic berpijar sehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian
pola dari hybridisasi dengan sinar X atau Autoradiografi, peneliti dapat
menentukan fragmen yang berisi DNA sequence spesifik atau gen (Brown,
2007).
Southern blots digunakan dalam penemuan gen dan pemetaan, evolusi
dan studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik
untuk memodifikasi pada organisme, Southern blot digunakan sebagai test
untuk memastikan bahwa bagian DNA tertentu mengenal urutan gen.
Southern blot analysis untuk menandai karakter transforman.Southern blot
analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan
memasukkan atau menyisipkan jumlah copy dan untuk mendeteksi gross
 DNA penyusunan kembali yang mungkin telah terjadi perubahan. Jika kamu
sedang menganalisis ß – galactosidase dengan memasukkan atau
menyisipkan dan dipotong – potong dengan EcoRV maka akan dihasilkan
potongan sekitar 1kb dari atas dan bawah dari urutan persandian ß –
galactosidase dimulai. Pemecahan oleh enzim restriksi, Analisis Gel, dan
bloting (Brown, 2007).

 NORTHERN BLOT
Ini adalah proses transfer yang identik tetapi dengan maksud mentransfer
RNA dari gel ke nitroselulosa (Anggraeni, 2007).

Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan

terdeteksi pada membran menggunakan probe hibridisasi dengan urutan
basa komplementer untuk semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target.
Tahapan-tahapan umum northern blot menurut Anggraeni (2007) adalah
sebagai berikut:
1. Isolasi RNA (total atau poli (A) RNA)
Dalam beberapa kasus, langkah terpisah untuk isolasi mRNA dari
RNA total dapat dimasukkan dengan poly (A) selection, hal ini
akan meningkatkan sensitivitas. Isolasi mRNA dari total RNA
menggunakan poli-A. Prosedur seleksi +, yang melibatkan kolom
oligo-T, atau beads primed oligo-T, untuk mengikat ekor poli-A +
mRNA. RNA diekstraksi spesies, apakah RNA total atau poli-A +
 yang dipilih, kemudian dipisahkan berdasarkan ukuran molekul
dengan elektroforesis agarosa-gel.
2. Generasi Probe
Dapat menggunakan radioaktif atau nonisotopically label, RNA,
DNA atau probe oligodeoxynucleotide. RNA Probe dapat
diproduksi secara in vitro melalui reaksi transkripsi menggunakan
Ambion yang MAXIscript Kit. Nukleotida berlabel isotop atau
nonisotopic dapat dimasukkan langsung selama sintesis dengan kit
ini, atau RNA dapat disintesis unlabeled dan kemudian ditambah
Psoralen-Biotin untuk menghasilkan probe terbiotinilasi untuk
hybridizations blot.
3. Denaturasi dan elektroforesis gel agarosa
Formaldehida biasa digunakan secara tradisional sebagai
denaturan, meskipun sistem glyoxal memiliki beberapa keunggulan
dibandingkan formaldehida.
4. Transfer ke support solid dan imobilisasi
RNA ditransfer ke membran nilon bermuatan positif dan kemudian
bergerak selama hibridisasi berikutnya. Digunakan metode
berteknologi rendah untuk transfer agarosa dengan elusi, pasif
sedikit basa, dan ke bawah. Atau dapat digunakan cara transfer
yang tersedia secara komersial aktif (electroblotter, semidry
electroblotter, vakum tinta, tinta tekanan, dll). Setelah RNA
ditransfer, membran harus segera disiapkan untuk Crosslink RNA.
Hal ini dapat dilakukan oleh sinar ultraviolet (metode yang
disukai) atau dengan dipanggang.
5. Prehybridization dan hibridisasi dengan prob
Prehybridisasi atau memblokir, diperlukan sebelum menyelidiki
hibridisasi untuk mencegah probe dari lapisan membran. Blocking
yang baik diperlukan untuk meminimalkan masalah back ground.
Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe ini
melengkapi semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target.
Secara umum, ukuran minimum untuk probe untuk memastikan
 spesifisitas adalah sekitar dua puluh lima basa, memberikan bahwa
ada kecocokan lengkap antara urutan probe dan urutan dari mRNA
target, Ada dua bentuk utama probe hibridisasi, pendekatan
tradisional yang menggunakan DNA komplementer (cDNA). Atau,
anti-sense oligonukleotida (umumnya 30-40 basa) dapat dirancang
dari data urutan dan disintesis. Oligonukleotida, seperti cDNA,
adalah molekul DNA yang tetapi riboprobes basa RNA nya dapat
digunakan.Riboprobes dapat meningkatkan sensitivitas
dibandingkan dengan probe DNA, tetapi kurang stabil dan dapat
menjadi subyek dengan kerusakan oleh RNases.
6. Pencucian
Setelah hibridisasi, unhibridisasi probe dihilangkan dengan
mencuci dengan buffer. Mencuci strigensi rendah (misalnya,
dengan 2X SSC atau SSPE) menghilangkan larutan hibridisasi dan
probe unhibridisasi. Mencuci strigenci tinggi (misalnya, dengan
0.1X SSC atau SSPE) menghilangkan sebagian molekul
hibridisasi.
7. Deteksi
Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot dapat dibungkus
dalam bungkus plastik agar tidak kering dan kemudian segera
menggunakan film untuk autoradiografi. Jika menggunakan probe
nonisotopic, blot harus diperlakukan dengan reagen deteksi
nonisotopic sebelum terkena film. Deteksi dicapai baik dengan
radioaktivitas atau dengan non-radioaktif. Dengan radioaktivitas,
probe ditandai dengan 32P (atau 33P). Dengan non-radioaktiv,
deteksi dilakukan dengan pewarnaan. Salah satunya dengan teknik
chemiluminescence, deteksi juga mungkin didasarkan pada
fluoresensi, tapi ini memerlukan substansial investasi dalam
instrumentasi khusus.
8. Pengupasan dan reprobing (opsional)
  EASTERN BLOT
Eastern blot ditemukan oleh Bogdanov. Metode ini digunakan untuk
mengidentifikasi epitop karbohidrat termasuk glikokonjugat dan lipid.
Sebagian besar protein yang telah dihapus setelah dipindahkan ke membran
dianalisis untuk PTM dengan menggunakan probe untuk mengidentifikasi
karbohidrat dan lipid (Tomar, 2016).
Adapun langkah-langkah yang dapat dilakukan menurut Tomar (2016)
adalah sebagai berikut:
1. Pertama, molekul yang ditargetkan dipisahkan secara vertikal
dengan menggunakan elektroforesis gel
2. Kemudian, molekul-molekul yang dipisahkan ini dipindahkan
secara horisontal pada membran nitroselulosa
3. Setelah itu antibodi primer ditambahkan ke larutan, antibodi ini
bertanggung jawab untuk mengenali urutan asam amino tertentu.
Kemudian cuci untuk menghilangkan antibodi primer yang tidak
terikat dan tambahkan antibodi sekunder berlabel
4. Probe berlabel ini mengkonfirmasi molekul yang diminati.
i) Deteksi modifikasi protein.
ii) Digunakan untuk mengikat berbagai ligan
iii) Digunakan untuk memurnikan berbagai fosfolipid

Referensi :
Anggraeni, Rani. 2007. Elektroforesis SDS-PAGE, Immunoblotting, dan
Penentuan Asam Amino Antigen dari Sarung Tangan Lateks Karet Alam.
Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Brown, Terence A. 2007. Southern Blotting and Relatde DNA Detection
Techniques. Oxford: Oxford University Press.
Fatchiyah. 2012. Teknik Analisis Biologi Molekuler. Malang; Universitas
Brawijaya.
Tomar, Manu. 2016. Types of Blotting. Journal of Pharmaceutics and
Nanotechnology.Volume 4:147-153.