ANALISIS PCR-RFLP GEN 16S rRNA BAKTERI

LAPORAN

Disusun Oleh :
Firafsi Laluwia S 140210150039
Liana Cinthya 140210150041
Andhika Putra Pratama 140210150043
Nadhifa Raihanah 140210150075
Ghina Uli Felicia 140210150095

UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
DEPARTEMEN KIMIA
PROGRAM STUDI S1 KIMIA
JATINANGOR
2017
 ABSTRAK

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan teknik perbanyakan

(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro. Percobaan ini bertujuan untuk
mengisolasi DNA bakteri dengan cara lisis sel, memperbanyak (amplifikasi)
daerah D-loop DNA mitokondria secara in vitro dengan teknik PCR,
mengkarakterisasi fragmen DNA hasil PCR dengan elektroforesis gel
agarosa, memurnikan hasil amplifikasi dengan metode presipitasi alkohol,
dan menganalisis retriksi produk PCR menggunakan enzim HinF1. Pada
percobaan ini dilakukan amplifikasi fragmen gen 16S rDNA dari bakteri
hasil lisis cepat menggunakan teknik PCR. Proses perbanyakan
(amplifikasi) dengan teknik PCR dilakukakan dengan penambahan master
mix dan melalui 3 tahap utama yaitu denaturasi, annealing (penempelan),
dan elongasi (perpanjangan) yang dilakukan sebanyak 24 siklus.
Karakterisasi fragmen DNA mitokondria hasil PCR dilakukan dengan
metode elektroforesis agarosa, dengan cara menambahkan loading buffer,
pergerakan DNA dapat dilihat dibawah sinar UV-Vis. Produk hasil PCR
dimurnikan dengan teknik presipitasi alkohol (etanol). Konsentrasi fragmen
DNA hasil PCR dianalisis dengan biofotometer UV. Fragmen DNA hasil
PCR kemudian dipotong dengan menggunakan enzim retriksi HinF1. Pada
percobaan ini adalah fragmen DNA pada bakteri tidak berhasil diisolasi
ditunjukan dengan pita pada elektroforegram gel agarosa tidak nampak.
Kata kunci : Elektroforesis gel agarosa, gen 16S rDNA , PCR-RFLP.

i
 ABSTRACT

PCR (Polymerase Chain Reaction) is a technique of amplifying DNA pieces

in vitro. DNA (deoxyribonucleic acid) is a nucleic acid, usually in the form
of a double helix and contains genetic information that determines the
biological development of all cell life forms. This experiment was aimed at
isolating bacterial DNA by cell lysis, reproducing mitochondrial D-loop
DNA region in vitro by PCR technique, characterizing PCR DNA fragments
by agarose gel electrophoresis, purifying the amplification results by
alcohol precipitation method, and analyzing PCR product retictions using
HinF1 enzyme. In this experiment, amplification of 16S rDNA gene
fragment from fast lysis bacteria using PCR technique was performed. The
amplification process with PCR technique is done with the addition of
master mix and through 3 main stages of denaturation, annealing, and
Characterization of PCR mitochondrial DNA fragments was performed by
agarose electrophoresis method, by adding loading buffer. The product of
PCR is purified by alcohol precipitation technique (ethanol).PCR DNA
fragments were then truncated using the HinF 1 retriction enzyme. In this
experiment the DNA fragments in the bacteria were not isolated were shown
with the bands on the agarose gel electrophores.

Keywords : Gel agarose electrophores, PCR-RFLP, 16S rDNA gene.

ii
 KATA PENGANTAR

Puji serta syukur marilah kita panjatkan kepada kehadirat Allah

SWT yang telah memberikan begitu banyak nikmat yang mana makhluk-
Nya pun tidak akan menyadari begitu banyak nikmat yang telah didapatkan
dari Allah SWT.
Dengan nikmat dan hidayah-Nya pula penyusun dapat
menyelesaikan laporan praktikum yang berjudul “Analisis PCR-RFLP
Gen 16s rRNA Bakteri”.
Atas segala karunia Allah, sehingga kami dapat melaksanakan
Praktikum Biokimia dan menyelesaikannya dengan baik meski jauh dari
kata sempurna. Laporan Praktikum ini dibuat dari percobaan untuk
mengisolasi DNA bakteri dengan cara lisis sel, mengamplifikasi daerah D-
loop DNA mitokondria in vitro dengan teknik PCR, mengkarakterisasi
fragmen DNA hasil PCR dengan metode elektroforesis gel agarosa,
Memurnikan hasil amplifikasi dengan metode presipitasi etanol dan
menganalisis hasil restriksi produk PCR menggunakan enzim HinF1. Kami
pun berterima kasih kepada semua pihak yang terlibat dalam penyusunan
laporan praktikum Biokimia ini.

Demikianlah laporan ini dibuat, mudah-mudahan bermanfaat bagi

kita semua. Laporan ini sangat jauh dari kesempurnaan. Kami mohon maaf
apabila masih ada banyak kekurangan. Semoga laporan praktikum Biokimia
yang telah kami buat dapat bermanfat bagi semua pihak.

Jatinangor, 29 Desember 2017

Penyusun

iii
 DAFTAR ISI

ABSTRAK ...................................................................................................... i
ABSTRACT ..................................................................................................... ii
KATA PENGANTAR .................................................................................. iii
DAFTAR ISI ................................................................................................. iv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................... vi
BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1
1.1. Latar Belakang ................................................................................ 1
1.2. Identifikasi Masalah ........................................................................ 3
1.3. Maksud dan Tujuan ......................................................................... 4
1.4. Manfaat Penelitian ........................................................................... 5
1.5. Metodologi Percobaan ..................................................................... 5
1.6. Waktu dan Penelitian....................................................................... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA.................................................................... 6
BAB III METODE PERCOBAAN .............................................................. 14
3.1. Alat dan Bahan .............................................................................. 14
3.1.1. Alat .............................................................................................. 14
3.1.2. Bahan ........................................................................................... 14
3.2. Prosedur ......................................................................................... 15
3.2.1. Lisis Sel ....................................................................................... 15
3.2.2. PCR ............................................................................................. 15
3.2.3. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Agarosa .................... 16
3.2.4. Pemurnian dengan Presipitasi Etanol .......................................... 17
3.2.5. Pemotongan menggunakan enzim HinF1 ................................... 18
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 19
4.1. Tabel Hasil Pengamatan ................................................................. 19
4.1.1. Lisis Sel ....................................................................................... 19
4.1.2. PCR ............................................................................................. 20
4.1.3. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Agarosa .................... 21
4.1.4. Pemurnian dengan Presipitasi Etanol .......................................... 22

iv
 4.1.5. Pemotongan menggunakan enzim HinF1 .................................... 24
4.2 Perhitungan ...................................................................................... 24
4.3. Pembahasan ..................................................................................... 26
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 49
5.1 Kesimpulan ...................................................................................... 49
5.2 Saran ................................................................................................ 49
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 50

v
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2. 1 Basics of PCR Cycling. ........................................................... 10

Gambar 4. 1 Bakteri Escherichia coli...........................................................27
Gambar 4. 2 Struktur Gel Agarosa ............................................................... 40
Gambar 4. 3 Elektroforesis Hasil amplifikasi PCR ..................................... 45
Gambar 4. 4 Hasil Elektroforesis DNA yang telah direstriksi ..................... 48

vi
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Ilmu pengetahuan dan teknologi berkembang semakin pesat. Salah satu

perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan adalah

bioteknologi. Bioteknologi merupakan pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah dan

rekayasa terhadap organisme, sistem, atau proses biologis untuk menghasilkan

atau meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa

bagi kepentingan hidup manusia. Secara umum bioteknologi dikelompokkan

menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional dan bioteknologi modern. Dengan

ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan tentang

DNA, muncullah istilah bioteknologi modern (Herman, R.F and N. Pack,

1978).

Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada

manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi

DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya

pada organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Produk

1
dari bioteknologi modern, misalnya insulin, kloning domba Dolly, antibodi

monoklonal (Toha, A.H, 2005).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA

terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Ada perbedaan di antara ketiga

lokasi DNA ini, yaitu: DNA nukleus berbentuk linear dan berhubungan sangat

erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas

berbentuk sirkular dan tidak berhubungan dengan protein histon. DNA

memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung komponen-komponen

gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Satu sel memiliki

DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada keturunannya

(McKee, T and J.R McKee, 1999).

DNA dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. Isolasi DNA

merupakan langkah tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu :

a. Sentrifugasi Merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan

berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar

akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada

bagian atas tabung. Tehnik sentrifugasi dilakukan oleh mesin yaitu mesin

sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan

menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan di bagian atas

dan pelet di bagian bawah. b. Presipitasi Merupakan langkah yang dilakukan

2
untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Langkah-langkah isolasi

DNA: a. Pengumpulan sel-sel, b. Pemecahan sel (lisis sel) dan pencernaan

protein, c. Pengendapan DNA (Page, D.S, 1997).

PCR merupakan suatu teknik sangat kuat dan sangat sensitif dan dapat

diaplikasikan dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler, genetika

populasi, dan analisis forensik. Teknik DNA rekombinan telah memberikan

perubahan secara signifikan dalam ilmu genetika karena memungkinkan

terjadinya isolasi dan karakteristik gen-gen, mempelajari secara rinci fungsi dan

ekspresi selama proses perkembangan terjadi, sebagai respon terhadap

lingkungan. Mengingat pentingnya peranan teknik PCR ini terhadap

perkembangan ilmu pengetahuan kedepan, maka dalam makalah ini akan

dibahas tentang teknik PCR, prinsip-prinsip PCR, pertimbangan penggunaan

PCR, dan manfaat PCR (Poedjiadi, A, 1994).

1.2. Identifikasi Masalah

Berdasarkan latar belakang percobaan, maka dapat dikemukakan

identifikasi masalah percobaan sebagai berikut:

1. Apakah DNA bakteri dapat diisolasi dengan cara lisis sel?

2. Apakah DNA bakteri dapat diperbanyak secara in vitro dengan teknik

PCR?

3
 3. Apakah fragmen DNA hasil PCR dapat dianalisis dengan metode

elektroforesis gel agarosa?

4. Apakah fragmen DNA hasil PCR dapat dimurnikan dengan presipitasi

etanol?

5. Apakah hasil restriksi produk PCR dapat dianalisis dengan enzim

Hinf1?

1.3. Maksud dan Tujuan

Percobaan ini dimaksudkan untuk memperoleh data dan informasi yang

berkaitan dengan analisis PCR-RFLP pada gen 16S rDNA untuk menyusun

laporan percobaan sebagai tugas laporan akhir laboratorium biokimia.

Percobaan ini bertujuan untuk :

1. Mengisolasi DNA bakteri dengan cara lisis sel.

2. Mengamplifikasi daerah D-loop DNA mitokondria in vitro dengan

teknik PCR.

3. Mengkarakterisasi fragmen DNA hasil PCR dengan metode

elektroforesis gel agarosa.

4. Memurnikan hasil amplifikasi dengan metode presipitasi etanol.

5. Menganalisis hasil restriksi produk PCR menggunakan enzim HinF1.

4
 1.4. Manfaat Penelitian

Hasil dari percobaan ini diharapkan dapat :

1. Memberikan gambaran mengenai isolasi DNA bakteri,

amplifikasinya dengan PCR-RFLP, analisis fragmen DNA dengan

elektroforesis, dan pemurniannya dengan presipitasi etanol.

2. Memberikan sumbangan ilmu yang bermanfaat dalam perkembangan

ilmu pengetahuan dalam bidang kimia khususnya biokimia.

1.5. Metodologi Percobaan

Metode yang digunakan dalam percobaaan ini adalah :

1. Mengisolasi DNA bakteri dengan cara melisis sampel.

2. Menggunakan teknik PCR untuk memperbanyak DNA bakteri.

3. Hasil dari PCR di analisis dengan elektroforesis agarosa.

4. Pemurnian fragmen DNA dari hasil PCR dengan presipitasi.

5. Pemotongan produk PCR dengan menggunakan enzim HinF1.

1.6. Waktu dan Penelitian

Percobaan ini dilakukan di Laboratorium Biomolekular Kesehatan dan

Pangan, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Padjadjaran yang dilaksanakan pada hari Kamis,8 Desember 2017,

15 Desember 2017, dan 22 Desember 2017.

5
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan.

DNA terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Ada perbedaan di

antara ketiga lokasi DNA ini, yaitu: DNA nukleus berbentuk linear dan

berhubungan sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria

dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berhubungan dengan protein

histon. DNA memiliki struktur helix untai ganda, yang mengandung

komponen-komponen gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan

basa nitrogen. Satu sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan

akan diturunkan pada keturunannya (McKee & McKee, 1999).

DNA dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. Isolasi

DNA merupakan langkah tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua,

yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk

memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul

6
 yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung

dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Teknik sentrifugasi

dilakukan oleh mesin yaitu mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang

bervariasi. Sentrifugasi akan menghasilkan dua macam fraksi yang terpisah,

yaitu supernatan di bagian atas dan pelet di bagian bawah. Presipitasi

merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen

dari campuran. Langkah-langkah isolasi DNA, yaitu pengumpulan sel-sel,

pemecahan sel (lisis sel) dan pencernaan protein, serta mengendapan DNA

(Page, 1997).

Prinsip dasar PCR itu sederhana. Sesuai namanya, ini adalah reaksi

berantai: Satu molekul DNA digunakan untuk menghasilkan dua eksemplar,

kemudian empat, kemudian delapan, dan seterusnya. Penggandaan terus

menerus ini dilakukan oleh protein spesifik yang dikenal sebagai polimerase,

enzim yang mampu menyatukan blok DNA individu untuk membentuk untaian

molekul yang panjang. Untuk melakukan pekerjaan mereka polimerase

memerlukan pasokan blok bangunan DNA, yaitu nukleotida yang terdiri dari

empat macam basa, seperti adenin (A), timin (T), sitosin (C) dan guanin (G).

Mereka juga membutuhkan fragmen kecil DNA, yang dikenal sebagai primer,

yang dengannya mereka memasang blok bangunan serta molekul DNA yang

lebih panjang untuk dijadikan templat untuk membangun untai baru. Jika ketiga

bahan ini dipasok, enzim akan membuat salinan template yang pasti. PCR

7
adalah metode yang digunakan untuk memperoleh banyak salinan untai tertentu

dari asam nukleat. Ini adalah sarana untuk secara selektif memperkuat segmen

DNA tertentu. Segmen ini mungkin mewakili sebagian kecil dari campuran

DNA yang besar dan kompleks mis. ekson tertentu dari gen manusia. Hal ini

dapat dianggap sebagai mesin fotokopi molekuler. DNA beruntai ganda

dipisahkan menjadi dua untaian DNA tunggal dengan memanaskannya sampai

96 °C. Pada suhu ini, DNA polimerase E.Coli hancur, sehingga enzim harus

diisi ulang dengan enzim segar baru setelah tahap pemanasan setiap siklus

(Joshi & Deshpande, 2011).

PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah metode revolusioner yang

dikembangkan oleh Kary B Mullis (dianugerahi hadiah Nobel dalam bidang

kimia pada tahun 1993). PCR didasarkan pada kemampuan DNA polimerase

untuk menyintesis untai DNA baru yang melengkapi templat dari DNA. Teknik

ini berdampak pada banyak area kloning molekuler, genetika, biologi molekular

DNA rekombinan, analisis forensik, biologi evolusioner, dan diagnostik

mensintesis untai DNA baru yang melengkapi templat dari DNA. Teknik ini

berdampak pada banyak area kloning molekuler, genetika, biologi molekular

DNA rekombinan, analisis forensik, biologi evolusioner, dan diagnostik medis

(Kavya, 2015).

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk mereplikasi

DNA, membuat banyak salinan dari segmen DNA tertentu dengan cepat dan

8
akurat [1]. Ia mampu mengambil sejumlah kecil DNA atau bahkan molekul

tunggal dan memperkuat wilayah tertentu secara eksponensial sehingga setelah

reaksi selesai, mungkin ada 230 salinan dari setiap molekul DNA awal.

Sebelum pengembangan PCR, metode yang digunakan untuk memperkuat, atau

menghasilkan salinan fragmen DNA rekombinan memakan waktu dan padat

karya. Tapi reaksi PCR dapat menyelesaikan banyak putaran replikasi dan

menghasilkan miliaran salinan fragmen DNA hanya dalam beberapa jam. Basa

(pelengkap template) digabungkan ke primer pada sisi 3 '(polimerase

menambahkan dNTP dari 5' ke 3'side, membaca templat dari sisi 3 'ke 5', basa

ditambahkan pelengkap pada templat) (Kavya, 2015).

9
 Gambar 2. 1 Basics of PCR Cycling.
Teknik PCR didasarkan pada proses sebuah sel yang digunakan untuk

mereplikasi untai DNA baru. Komponen integral adalah DNA template (berisi

wilayah yang akan disalin). Bahkan molekul DNA tunggal pun bisa dijadikan

template. Fragmen yang dibutuhkan agar bisa direplikasi adalah urutan dua

daerah nukleotida pendek di kedua ujung kawasan yang diminati. Kedua urutan

template pendek harus diketahui maka dua primer (peregangan pendek

nukleotida) yang sesuai dengan urutan tempelan dapat disintesis. Primer

menempel pada template di situs pelengkap mereka dan bertindak sebagai titik

10
awal untuk menyalin. Sintesis DNA pada satu primer diarahkan ke arah yang

lain sehingga menghasilkan replikasi urutan yang diinginkan. Juga diperlukan

nukleotida bebas yang digunakan untuk membangun untai DNA baru dan

polimerase DNA melakukan bangunan dengan menambahkan nukleotida bebas

secara berurutan sesuai dengan instruksi dari templat (Kavya, 2015).

Molekul DNA serta banyak senyawa biologis lainnya seperti protein

membawa muatan listrik. Muatan listrik DNA adalah negatif, sehingga jika

molekul DNA ditempatkan pada medan listrik, DNA akan bermigrasi ke kutub

positif. Kecepatan migrasi molekil DNA pada proses elektroforesis suatu gel

tertentu tergantung pada bentuk dan ukurannya. Gel-gel ini biasanya terbuat

dari agarosa atau poliakrilamida yang membentuk pori-pori yang kompleks

untuk dilalui molekul DNA (Maksum et al., )

Bentuk molekul DNA akan mempengaruhi keadaan konformasi struktur

DNA, seperti bentuk sirkuler menghasilkan beberapa konformasi dengan

keadaan kecepatan mingrasi yang berbeda, sedangkan pada DNA dengan

bentuk molekul linier hanya dalam satu bentuk konformasi. Dalam bentuk yang

sama, makin kecil ukuran DNA maka makin cepat migrasinya. Untuk

mempermudah analisis, molekul DNA yang akan dielektrofresis harus dalam

keadaan linier. Proses PCR menghasilkan DNA linier. Daya pisah ukuran

molekul DNA juga ditentukan oleh komposisi gel (prosentase agarosa dan

poliakrilamida) dan tebal lempeng gel tersebut. Presentase agarosa atau

11
poliakrilamida semakin tinggi, maka semakin tinggi daya pisah gel hingga

mencapai molekul DNA yang kecil (Maksum et al., ).

Untuk melihat pergerakan molekul DNA selama proses elektroforesis,

DNA harus ditambahkan bromfenol biru, sedangkan untuk membuat DNA

dalam keadaan di bawah sumur harus ditambahkan sukrosa. Kedua senyawa

kimia ini dibuat dalam satu kondisi pereaksi, yaitu loading buffer pH 8,0.

karakterisasi DNA hasil elektroforesis dapat dilakukan dengan cara pengecatan

gel dengan senyawa yang dapat menyebabkan DNA dapat dilihat seperti

etidium bromida (EtBr). Pita-pita yang menunjukkan posisi fragmen DNA

dengan ukuran yang berbeda dapat dilihat dengan jelas di bwah penyinaran

ultraviolet setelah penambahan EtBr, hali ini karena EtBr dapat berinterkalasi

dengan DNA dan berfluorosensi di bawah penyinaran ultraviolet. Ukuran

fragmen DNA dapat ditentukan dengan membandingkan posisi pita fragmen

DNA tersebut dengan posisi pita dari fragmen-fragmen DNA standar (Maksum

et al., ).

Bakteri adalah organisme golongan prokariotik. Berbeda dengan organisme

eukarotik manusia, organisme ini tidak memiliki membran inti sehingga

informasi genetik berupa DNA yang dimiliki, tidak terlokalisasi dalam tempat

khusus (nukleus). DNA pada bakteri berbentuk sirkuler, panjang dan biasa

disebut nukleoid. Bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal berbentuk

kecil dan sirkuler yang tergabung menjadi plasmid (Al Hanif, 2009).

12
 Dinding sel sangat berguna bagi bakteri dalam pertumbuhan dan

pembelahannya. Bakteri mempunyai dinding sel yang tersusun dari

peptidoglikan, yaitu gabungan protein dan polisakarida. Peptidoglikan

merupakan polimer yang terdiri dari tiga macam pembangun : (1) N-

asetilglukosamin (NAG), (2) asam N-asetilmuramat (NAM), dan (3) suatu

peptida yang terdiri dari empat atau lima asam amino, yaitu L-alanin, D-alanin,

asam glutamat, dan lisin atau asam diaminopimelat (Lestari & Hartati, 2017).

Berdasarkan perbedaan ketebalan lapisan peptidoglikan pada dinding

selnya, bakteri dibedakan menjadi dua macam, yaitu bakteri gram positif dan

bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif memperlihatkan tiga lapis

pembungkus sel, yaitu membran luar, lapisan tengah yang merupakan dinding

sel atau lapisan murein, dan membran plasma dalam sehingga dapat

disimpulkan peptidoglikan merupalan komponen utama dari bakteri gram

positif sedangkan lipid merupakan komponen terbesar penyusun bakteri gram

negatif (Lestari & Hartati, 2017).

Bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi [ada

dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Contoh

bakteri gram negatif, yaitu Escherichia coli, Streptococcus mutans, dan

Staphylococcus aureus (Lestari & Hartati, 2017).

13
 BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1. Alat dan Bahan

3.1.1. Alat

Alat-alat yang digunakan adalah elektroforesis horizontal

misisubTMDNA, freezer, gel tray, labu erlenmeyer, lampu UV seri 9814-

312 nm, mesin PCR, microwave, mikropipet, mikrosentrifugasi, tabung 1,5

mL steril, tabung master mix, tabung mikro 0,5 mL, dan waterbath.

3.1.2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah akuades, buffer lisis, buffer

PCR, bahan elektroforesis DNA, bahan elektroforesis gel agarosa, cuplikan

hasil lisis, cuplikan hasil reaksi PCR, dNTP, enzim 100 DNA polymerase

37,5 unit, etanol p.a ± 100 mL, etanol 70% ± 400 mL, natrium asetat 3M

pH 5,2 8µL, primer, proteinase K, standar DNA PUC/HinF1 1300 mg,

standar templat MT DNA (kontrol +).

14
3.2. Prosedur

3.2.1. Lisis Sel

Isolat bakteri E. coli ditumbuhkan terlebih dahulu pada media

yang cair di kondisi yang optimum yaitu dengan diinkubasi pada suhu

37ᴼC selama semalam. Isolat bakteri dipipet sebanyak 200 L ke dalam

tabung 1,5 L dengan memakai mikropipet. Selanjutnya, bakteri

disentrifugasi dengan memakai mikrosentrifugasi selama 10 detik pada

7000 rpm. Terbentuk endapan dan supernatan. Supernatan dibuang dan

endapan ditambahkan dengan 20 L buffer lisis 10x, 10

L proteokinase K dan 170 L NFW. Kemudian, campuran diinkubasi

selama 1 jam pada suhu 50ᴼC- 55ᴼC dan dilakukan inaktivasi pada suhu

95ᴼC selama 10 menit. Lalu, sampel disentrifugasi kembali selama selama

3 menit dengan kecepatan 13000 rpm. Hasil lisis didapatkan.

3.2.2. PCR

Pertama, disediakan 3 tabung yang berisi sampel hasil lisis, kontrol

positif, dan kontrol negatif. Ketiga sampel ini ditambahkan dengan master

mix 13 µL yang terdiri dari campuran primer UniB1 20 µM dan BactF1 20

µM dengan volume masing-masing 1,0 µL, dNTP 10mM 1,0 µL, Taq

polymerase 5U/µL 0,25 µL, buffer PCR 10X 5,0 µL, MgCl2 25mM 2,5

µL. Kemudian setiap tabung ditambahkan 29 µL NFW dan ditambahkan

templat sebanyak 10 µL. Setelah larutan ditambahkan semua, dispin

15
selama 1-3 detik. Kemudian, ketiga tabung dimasukkan ke dalam mesin

PCR yang sudah diset. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan tahapan

pra-denaturasi templat DNA pada suhu 94℃ selama 1 menit, denaturasi

pada 94℃ selama 1 menit, annealing atau penempelan primer pada suhu

50℃ selama 1 menit, elongasi pada suhu 72℃ selama satu menit,

pemantapan (post-extension) pada suhu 72℃ selama 4 menit. Kemudian,

reaksi PCR dilakukan selama 3 jam.

3.2.3. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Agarosa

Pertama, gel agarosa ditimbang sebanyak 0,6 g yang dilarutkan

dengan 10 mL buffer TAE 1 kali pada erlenmeyer 100 mL. Kemudian,

larutan dipanaskan selama 70 detik sampai komponen agarosa larut

sempurna. Setelah larutan agarosa larut, didinginkan hingga suhu 50 - 60

ᴼC. Larutan dari gel agarosa yang telah dingin dituangkan ke dalam gel

tray dan didiamkan selama ± 30 menit dan ditutup bagian atasnya dengan

memakai tisu. Setelah gel agarosa mengeras dibuka pembentuk sumur dan

penyumbatnya secara hati-hati. Lalu,gel tray dimasukan kedalam chamber

elektroforesis yang telah berisi buffer TAE dan dalam keadaan yang

terendam. Setelah gel agarosa siap, sampel dibuat dari 10 L produk PCR

(3 tabung) dan 2 L loading dye dan 2L gel red. Dan marker dibuat dari

5 L marker dan 1 L gel red. Kemudian, sampel disentrifugasi selama 1

menit dengan kecepatan 7000 rpm. Selanjutnya sumur –sumur diisi, yaitu

16
sumur 1 berisi marker, sumur 2 berisi kontrol +, sumur 3 berisi DNA

sampel dan sumur 4 berisi kontrol negatif. Lalu, penutup chamber dipasang

dan proses elektroforesis dilakukan dengan tegangan 80 v selama 45 menit

1400 mA. Lalu, hasil dari tahap ini disinari dengan sinar UV seri 9814-

312 nm. Hasilnya dibandigkan dengan kontrol positif, kontrol negatif dan

marker.

3.2.4. Pemurnian dengan Presipitasi Etanol

Hasil PCR dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 µL dan

ditambahkan etanol p.a sebanyak 2 kali produk PCR 0.1 kali volume

natrium asetat 3M pH 7, lalu diinkubasi pada suhu -20oC selama 1

malam. Setelah di inkubasi, disentrifugasi pada suhu 4oC dengan

kecepatan ~ 12.000 rpm selama 30 menit. Lalu, tabung mikro yang

berisi endapan dan supernatan diinkubasi kembali. Supernatan

didekantasi dan endapannya dicuci dengan etanol 70% dingin sebanyak

lima kali volume. Kemudian, disentrifugasi kembali pada suhu 4oC

dengan kecepatan ~ 12.000 rpm selama 10 menit sehingga

menghasilkan endapan dan supernatan. Supernatan dibuang dengan cara

didekantasi dan pelet dikeringkan pada udara terbuka agar semua etanol

menguap. Setelah pelet kering, pelet tambahkan 20µL NFW. Setelah itu,

ditentukan konsentrasi fragmen DNA dengan biofotometer UV untuk

mendapatkan konsentrasi fragmen DNA.

17
3.2.5. Pemotongan menggunakan enzim HinF1

Fragmen DNA PCR dipipet sebanyak 16 µL masukkan ke

dalam tabung 1,5 µL. Kemudian ditambahkan dengan buffer restriksi

sebanyak 2 µL dan ditambahkan kpn 1 (10 µ/ µL) sebanyak 1 µL. NFW

ditambahkan juga hingga volume total 20 µL dan dispin dengan

mikrosentrifugasi. Lalu, diinkubasi pada master cyder selama dua jam

pada suhu 37oC dan dianalisis kembali dengan elektroforesis agorasa.

Hasil elektroforesis agarosa disinari dengan sinar UV dan dibandingkan

dengan sampel yang tidak dipotong.

18
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Tabel Hasil Pengamatan

4.1.1. Lisis Sel

Zat Perlakuan Hasil

Isolat Bakteri - dipipet sebanyak 200 L ke dalam

tabung 1,5 L dengan memakai

mikropipet

- dipipet sebanyak 200 L ke dalam

tabung 1,5 L dengan memakai

mikropipet

- disentrifugasi dengan memakai terdapat endapan dan

mikrosentrifugasi selama 10 detik pada supernatant

7000 rpm

Endapan - ditambahkan dengan 20L buffer lisis

10x, 10 L proteokinase K dan 170

L NFW

- diinkubasi selama 1 jam pada suhu

19
 50ᴼC- 55ᴼC

- diinaktivasi pada suhu 95ᴼC selama

10 menit

- , sampel disentrifugasi kembali

selama selama 3 menit dengan Hasil Lisis

kecepatan 13000 rpm

4.1.2. PCR

Zat Perlakuan Hasil

3 tabung berisi hasil - ditambahkan master mix yang terdiri

lisis, kontrol positif dari campuran primer UniB1 20 µM

dan kontrol negatif dan BactF1 20 µMdNTP 10mM, Taq

polymerase 5U/µL, buffer PCR 10X,

MgCl2 25mM sebanyak 13 µL

- ditambahkan 29 µL NFW

- ditambahkan templat sebanyak 10 µL

- dispin selama 1-3 detik Larutan tercampur

- dimasukkan ke dalam mesin PCR

yang sudah diset

- dilakukan selama 3 jam atau 30 siklus Hasil PCR

20
 4.1.3. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Agarosa

Zat Perlakuan Hasil

Agarosa - ditimbang sebanyak 0,6 g

- dilarutkan dengan 10 mL buffer TAE Larutan agarosa

1 kali pada erlenmeyer 100 mL

Larutan Agarosa - dipanaskan selama 70 detik dalam Larutan agarosa larut

oven sempurna

- didinginkan hingga suhu 50 -60 ᴼC

- dituangkan ke dalam gel tray

- didiamkan selama± 30 menit

- ditutup bagian atasnya dengan Gel agarosa terbentuk

memakai tisu

Gel Agarosa - dibuka pembentuk sumur dan

penyumbatnya secara hati-hati

- dimasukan kedalam chamber

elektroforesis yang telah berisi buffer

TAE dan dalam keadaan yang

terendam Gel agarosa siap

Hasil PCR - dipipet 10 L

- ditambahkan 2 L loading dye

- ditambahkan 2L gel red

21
 - disentrifugasi selama 1 menit dengan Larutan tercampur

kecepatan 7000 rpm

Marker - dipipet 5 L

- ditambahkan 1 L gel red

- disentrifugasi selama 1 menit dengan Marker tercampur

kecepatan 7000 rpm

- diisi sumur 1 dengan marker, sumur 2

Sumur Gel Agarosa (kontrol +), sumur 3(kontrol-) dan

sumur 4 (DNA sampel)

- dielektroforesis dengan tegangan 80

v selama 45 menit 1400 mA

- disinari dengan sinar UV seri 9814-

312 nm

- dilihat pitanya

Tidak terdapat pita

4.1.4. Pemurnian dengan Presipitasi Etanol

Zat Perlakuan Hasil

Hasil PCR - dimasukkan ke dalam tabung

mikro 1,5 µL

- ditambahkan etanol p.a

22
 sebanyak 2 kali produk PCR 0.1

kali volume natrium asetat 3M

pH 7

- diinkubasi pada suhu -20oC

selama 1 malam Terdapat endapan dan

- disentrifugasi pada suhu 4oC supernatan

dengan kecepatan ~ 12.000 rpm

selama 30 menit

Endapan - dicuci dengan etanol 70%

dingin sebanyak lima kali

volume Terdapat endapan dan

- disentrifugasi kembali pada supernatan

suhu 4oC dengan kecepatan ~

Pelet 12.000 rpm selama 10 menit Etanol menguap

- dikeringkan pada udara terbuka

- ditambahkan 20µL NFW Hasil PCR murni

- ditentukan konsentrasi fragmen

DNA dengan biofotometer UV

23
 4.1.5. Pemotongan menggunakan enzim HinF1

Zat Perlakuan Hasil

Fragmen DNA - dipipet sebanyak 16 µL

PCR - dimasukkan ke dalam tabung 1,5

µL

- ditambahkan dengan buffer

restriksi sebanyak 2 µL

- ditambahkan kpn 1 (10 µ/ µL)

sebanyak 1 µL

- ditambahkan NFW hingga

volume total 20 µL

- dispin dengan mikrosentrifugasi

- diinkubasi pada master cyder

selama dua jam pada suhu 37oC

- dianalisis kembali dengan

elektroforesis agorasa

- disinari dengan sinar UV Tidak terdapat pita

4.2 Perhitungan
4.2.1 Penentuan Konsentrasi Awal

- Kecerahan pita berada pada konsentrasi marker 70ng.

- Loading bufer yang dimasukkan = 5 mikro liter

24
 70 𝑛𝑔
- Konsentrasi = 5 𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜 𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟 = 14 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝐿𝑖𝑡𝑒𝑟

- Kecerahan pita = 1 kali kecerahan marker, maka konsentrasi

pada 1500pb adalah :
14 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟𝑥 0.5 = 7 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟

4.2.2 Penentuan Konsentrasi Fragmen 480pb

- Kecerahan pita berada pada konsentrasi marker 70ng.

- Loading bufer yang dimasukkan = 10 mikro liter

70 𝑛𝑔
- Konsentrasi = 10 𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜 𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟 = 7 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝐿𝑖𝑡𝑒𝑟

- Kecerahan pita = 1 kali kecerahan marker, maka konsentrasi

pada 480pb adalah :
7 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟𝑥 1 = 7 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟

4.2.3 Penentuan Konsentrasi Fragmen 240pb

Kecerahan pita berada pada konsentrasi marker 70ng.

- Loading bufer yang dimasukkan = 10 mikro liter

70 𝑛𝑔
- Konsentrasi = 10 𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜 𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟 = 7 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝐿𝑖𝑡𝑒𝑟

- Kecerahan pita = 1 kali kecerahan marker, maka konsentrasi

pada 240pb adalah :
7 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟𝑥 1 = 7 𝑛𝑔/𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑒𝑟

25
 4.3. Pembahasan

Percobaan ini berjudul Analisis PCR-RFLP Gen 16s rDNA Bakteri.

Tujuan percobaan ini adalah mengisolasi DNA bakteri dengan cara lisis sel,

memperbanyak (amplifikasi) DNA bakteri daerah D-Loop mitokondria secara

in vitro dengan teknik PCR, menganalisis fragmen DNA hasil PCR dengan

metode elektroforesis gel agarosa, memurnikan hasil amplifikasi dengan

metode presipitasi alkohol, dan menganalisis hasil rektriksi produk PCR dengan

enzim HinF1. Jenis bakteri yang digunakan pada percobaan ini adalah bakteri

Escherichia Coli Top 10.

PCR (Polimerase Chain Reaction) merupakan teknik untuk amplifikasi

dari produk fragmen DNA dalam jumlah banyak dari sumber DNA yang

jumlahnya sangat kecil, yang tanpa proses ini akan sulit diidentifikasi.

Prinsip dari PCR perbanyakan (amplifikasi) fragmen DNA di daerah

spesifik secara in vitro yang dibatasi oleh dua buah oligonukleotida (primer).

Sumber DNA yang digunakan untuk PCR adalah berasal dari bakteri E.

coli. Pada percobaan ini fragmen DNA mitokondria yang digunakan adalah 16S

rRNA. 16S rRNA merupakan bagian subunit terkecil dari ribosom prokariot.

rRNA prokariot yang berukuran besar mengandung beberapa bagian yang

urutannya sangat lestari (conserved) dan urutan yang bervariasi di daerah lain di

antara jarak filogenetik yang luas sehingga dapat digunakan untuk identifikasi

26
dan penentuan hubungan evolusi, maka daari itu dipilih 16sRNA sebagai

fragmen DNA yang akan diperbanyak.

Klasifikasi bakteri Escherichia coli

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Familia : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Gambar 4. 1 Bakteri Escherichia coli

E. coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 μm

dan berdiamater 0.5 μm. Volume sel E. coli berkisar 0.6-0.7 μm3. Bakteri ini
umumnya hidup pada suhu 20-400C, optimum pada 37oC. Top 10 E. coli adalah
strain E. coli ekspresi non-T7 yang banyak digunakan dan cocok untuk

27
transformasi dan ekspresi protein. Strain ini tidak mengekspresikan T7 RNA
polimerase. Top 10 tidak membawa gen untuk RNA polimerase T7 dan hanya
sesuai untuk ekspresi dari promotor yang dikenali oleh RNA polimerase E.coli,
misalnya lac, tac, trc, ParaBAD, PrhaBAD dan juga promotor T5.

Langkah pertama yang dilakukan adalah isolasi DNA dari bakteri E.coli.

Strategi untuk melakukan lisis sel, yaitu pahami organisasi sel organisme

sumber DNA, pahami struktur dan komposisi membran sel dan dinding sel,

pahami cara memecahkan yang efektif dan aman untuk reaksi selanjutnya,

lindungi DNA hasil lisis dari aktivitas nuklease selama proses lisis, dan

hilangkan kemungkinan adanya inhibitor untuk reaksi PCR pada sumber DNA.

Bakteri gram negatif mengandung lebih banyak lipid dibandingkan

peptidoglikan untuk itu buffer lisis yang digunakan juga harus tepat agar efektif

dan cepat untuk melisis dan aman untuk reaksi PCR. Nuklease dapat

menfragmentasi DNA sehingga menghasilkan PCR yang multifragmen, untuk

itu aktivitasnya harus dilindungi dengan penambahan EDTA. Kita harus

mengetahui apakah sumber DNA yang kita gunakan mengandung inhibitor

yang dapat menginhibisi DNA polimerase, jika ada harus dihilangi dengan cara

pencucian, jika masih terdapat inhibitor DNA polimerase, maka proses replikasi

tidak dapat dilakukan.

Langkah pertama yang dilakukan untuk lisis sampel DNA bakteri, yaitu

isolat bakteri Top 10 yang sudah ditumbuhkan pada media padat pada kondisi

28
optimum dipipet sebanyak 200 μL, pengambilan DNA bakteri dilakukan

dengan menggunakan mikropipet karena volume yang digunakan dalam

ukuran mikro dan agar pengambilan akurat, kemudian dimasukkan ke dalam

tabung mikro 1,5mL steril. Selanjutnya disentrifugasi selama 1 menit, lalu

diambil endapannya dan dibuang supernatannya dengan menggunakan

mikropipet. Setelah itu ditambahkan20 L buffer lisis, 10L proteinase K dan

170L NFW (nuclease free water). Buffer lisis yang digunakan adalah

campuran dari Tris HCL 0,5 M pH 8,5; EDTA 0,01M ; 5% Tween 20; dan

ddH2O. Tris HCl pH 8,0 merupakan buffer untuk mempertahankan pH pada

daerah 8,5 agar aktivitas enzim proteinase K optimum karena setiap enzim

memilih pH spesifik dimana akan bekerja optimum. Di bawah atau diatas pH

optimum, enzim akan dapat kehilangan aktivitasnya (terdenaturasi).

EDTA digunakan sebagai pengkhelat kofaktor Mg2+ enzim nuklease.

Nuklease yang terdapat dalam sel pada bagian lisosom ketika membran sel

dan membran organel-organel lainnya dipecah termasuk lisosom maka semua

enzim yang terdapat pada lisosom akan keluar termasuk nuklease. Nuklease

bila dibiarkan saja dapat menfragmentasi molekul DNA dengan memecah

ikatan fosfodiester antar nukleotida penyusun DNA sehingga dihasilkan

fragmen-fragmen kecil. EDTA menginhibisi pengaktifan nuklease dengan

cara membentuk khelat dengan Mg2+, Mg2+ merupakan pusat aktif enzim

nukelase. Jika nuklease tidak dihambat maka nuklease akan menfragmentasi

29
DNA hasil lisis sehingga menghasilkan produk PCR yang multifragmen.

Dengan adanya EDTA maka enzim nuklease akan terdefragmentasi.

Penambahan EDTA tidak boleh berlebihan, jika terlalu banyak maka

dapat mengganggu reaksi PCR karena dapat mengganggu kestabilan kofaktor

Mg2+ pada enzim DNA polimerase. Jadi, EDTA yang terkandung dalam

buffer lisis merupakan jumlah yang sesuai.

Enzim proteinase K dapat memutuskan ikatan peptida antar asam-asam

amino dari protein penyusun membran sehingga lapisan membran rusak.

Enzim ini bekerja spesifik pada substrat berupa asam amino yang bermuatan

positif, bermolekul besar, dan mempunyai gugus oil seperti tirosin. Enzim

protenase K akan memecah ikatan peptida pada protein yang terdapat dalam

membran sel, baik membran plasma, membran mitokondria, maupun

membran oganel sel lainnya. Enzim akan memecah langsung protein sel,

tetapi akan memecah protein intrinsik atau intregritas apabila protein ini telah

terpisahkan dari struktur membran (karena adanya penambahan deterjen).

Pada saat seluruh buffer lisis bekerja, Tween 20 akan merusak integritas

fosfolipid dan protein hidrofobik, selain itu Tween-20 juga akan merusak lem

fosfolipid bilayer. Tween 20 berfungsi untuk merusak integrasi fosfolipid dan

protein hidrofobik dengan merusak sistem bilayer fosfolipid. Tween-20

merupakan surfaktan nonionik yang memiliki gugus hidrofobik dan hidrofilik.

Gugus hidrofilik akan menghadap air, sedangkan gugus hidrofobik

berinteraksi dengan lipid sehingga sistem bilayer fosfolipid terfragmentasi.

30
Potongan-potongan protein periferal dan integral serta Tween-20 yang

mengikat lipid pada gugus hidrofobiknya akan membentuk emulsi. Emulsi ini

merupakan koloid hidrofob tidak memiliki sistem lapisan rangkap listirk

(electric double layer). Adanya larutan elektrolit menyebabkan emulsi ini

kehilangan kesetabilannya dan akhirnya mengendap. Pemilihan surfaktan juga

harus diperhatikan, surfaktan yang digunakan harus tidak boleh merusak DNA

atau enzim pada proses PCR selanjutnya. SDS merupakan surfaktan yang

efektif untuk melisis lipid, tetapi tidak aman untuk proses PCR selanjutnya,

maka dari itu digunakan Tween-20 yang efektif dan aman.

Setelah itu diinkubasi pada suhu 50-55°C di water bath. Suhu ini

digunakan karena merupakan suhu optimum bagi aktifitas enzim proteinase K.

Inkubasi ini bertujuan agar membran sel dan membran mitokondria yang telah

dipecah, serta DNA mitokondria dapat diisolasi. Setelah diinkubasi sampel

dimasukkan dalam penangas air mendidih bersuhu sekitar 950C selama 10

menit untuk mendeaktivasi enzim proteinase K. Pada suhu tinggi apoenzim

mengalami “unfolding” dan kehilangan aktivitas biologisnya. Enzim

proteinase K harus dideaktivasi karena bila tidak dideaktivasi dan masuk

dalam reaksi PCR maka enzim proteinase K dapat menginhibisi aktivitas

enzim taq DNA polimerase lebih lanjut. tag DNA polimerase yang berfungsi

untuk membantu proses elongasi primer sepanjang templat DNA juga

mengandung apoenzim, maka enzim proteinase K yang belum terdeaktivasi

31
tadi akan memotong-motong ikatan peptida asam-asam amino apoenzim DNA

polimerase. Adanya pemanasan ini hanya mendenaturasi protein.

NFW (nuclease free water) merupakan pelarut untuk melarutkan DNA.

DNA akan larut pada air karena memiliki gugus fosfat yang menyebabkan

DNA larut dengan baik dalam air.

Larutan yang telah didenaturasi kemudian disentifugasi pada kecepatan

14.000 rpm, pada suhu 40C selama 3 menit untuk memisahkan supernatan

yang mengandung DNA mitokrondria dengan komponen lainnya. Sentrifugasi

merupakan metode pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan sedimentasi

dalam suatu medan sentrifugal.

Setelah tahap lisis bakteri selesai maka akan diperoleh template DNA

bakteri, yang kemudian digunakan dalam reaksi PCR untuk amplifikasi

fragmen DNA. Pada tahap ini digunakan tiga jenis sampel pada tabung yang

berbeda, yaitu: sampel hasil lisis sel bakteri E. Coli TOP 10F’, kontrol positif

(templat DNA E. Coli TOP 10F’), dan kontrol negatif (nuclear free water).

Kontrol positif digunakan untuk meyakinkan pita-pita yang ditunjukkan oleh

DNA sehingga hasilnya harus positif (terbentuknya pita) setelah diamplifikasi,

dikarakterisasi dengan elektroforesis, dan divisualisasi dengan sinar UV.

Sedangkan kontrol negatif digunakan sebagai blanko yang menunjukkan

bahwa reagen-reagen yang digunakan dengan perlakuan yang sama terhadap

32
sampel tidak mengandung DNA atau pengotor lainnya sehingga akan

menunjukkan hasil yang negatif dengan tidak terbentuknya pita. Sampel

dalam ketiga tabung ini berfungsi sebagai templat DNA yang akan

diamplifikasi selama proses PCR.

Pada percobaan ini primer yang digunakan yaitu primer UniB1 dan

BactF1 dengan konsentrasi masing-masing 20 µM. Primer merupakan

oligonukleotida pendek yang komplemen dengan fragmen DNA berfungsi

untuk membatasi bagian DNA yang akan diamplifikasi dan memiliki gugus

hidroksi (-OH) bebas pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses elongasi

DNA. Primer ini akan menempel secara spesifik dengan templat DNA yang

komplemen dengannya secara antiparalel. Primer baiknya mengandung

banyak urutan GC (GC rich). Suatu primer dapat didesain secara manual

ataupun menggunakan softwarekhusus dan pembuatannya dilakukan dengan

cara sintesis dari monomernya. Primer BactF1merupakan primer maju

(forward) serta memiliki urutan 5’-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3’.

Sedangkan primer UniB1merupakan primer balik (reverse) dengan urutan 5’-

GGTTAC(G/C)TTTGTTACGACTT-3’. Bagian DNA yang akan

diamplifikasi sebesar (1492 – 8 + 1 = 1485pb). Pada proses pemasangan

primer perlu digunakan suhu yang cukup tinggi agar meminimalisir terjadinya

33
misspriming yakni kesalahan penempelan primer pada fragmen DNA yang

komplemen dan mencegah dimerisasi yakni interaksi antara primer dengan

dirinya sendiri membentuk suatu dimer.

Untuk enzim DNA polimerase yang digunakan adalah Taq Polimerase.

Enzim ini merupakan hasil pemurnian dari baketri termofil ekstrim Thermus

aquaticus. Suhu optimum dari enzim ini adalah 80°C sehingga relatif

termostabil dan tidak rentan terhadap denaturasi. Jumlah enzim yang

digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi.

Untuk panjang fragmen DNA < 2 kb diperlukan 1,25 – 2 unit/ 50μL campuran

reaksi, sedangkan untuk fragmen DNA > 2kb diperlukan 3 unit/50μL. Pada

percobaan ini jumlah DNA polimerasi yang digunakan adalah 2 unit/50μL

karena panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi adalah 1485 pb

(1.4kb). Enzim Taq polimerase tidak memiliki aktivitas proofreading

eksonuklease 3’ ke 5’ sehingga menjadikan salah satu kelemahannya yakni

ketelitiannya yang rendah sehingga menghasilkan fragmen DNA dengan

kesalahan pasangan nukleotida yang cukup banyak.

Komponen mastermix selanjutnya adalah buffer PCR 10x. Buffer pH

berfungsi untuk mempertahankan pH 9 karena pada pH ini enzim DNA

34
polimerase bekerja maksimal. Kation Mg2+ bertindak sebagai kofaktor yang

berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase untuk memulai proses

elongasi dengan cara menstabilkan kompleks yang terbentuk menyebabkan

gugus fosfat pada dNTP bersifat lebih positif dan gugus hidroksil pada ujung

3’ akan lebih mudah menyerang gugus fosfat pada dNTP dan terbentuk ikatan

fosfodiester dengan melepaskan pirofosfat. Dengan adanya MgCl2 ini akan

meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk kompleks

larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl 2

berpengaruh pada spesifitas dan perolehan proses. Konsentrsi MgCl2 yang

terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR. Sedangkan konsentrasi yang

terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk nontarget yang disebabkan

oleh terjadinya mispriming.

Kemudian master mix yang sudah berisi komponen PCR dalam tabung

1,5 mL kecuali templat DNA disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan

7000 rpm pada suhu 4°C agar semua komponen tercampur dengan merata.

Master mix yang sudah disentrifugasi kemudian dimasukkan ke dalam 3

tabung berbeda yakni tabung 1 untuk sampel hasil lisis, tabung 2 untuk

kontrol positif, dan tabung 3 untuk kontrol negatif masing-masing 11 . Setelah

itu dimasukan templat DNA hasil lisis pada tabung 1, DNA E. coli TOP10F’

pada tabung 2, dan nuclear free water (NFW) pada tabung 3. Volume pada

35
tiap-tiap tabung harus sebanyak 50 maka dari itu ditambahkan 29 nuclear free

water (NFW) agar campuran komponen tidak terlalu pekat.

Berikutnya dilakukan set-up PCR bertujuan untuk mengatur suhu pada

tiap tahapan replikasi DNA. Suhu tiap tahapan diatur sedemikan rupa sebagai

berikut:

a. Tahap denaturasi, 94℃selama 1 menit.

b. Tahap annealing, 50℃selama 1 menit.

c. Tahap elongasi, 72℃ selama 1 menit.

d. Elongasi akhir, 72℃ selama 1 menit.

Replikasi yang dilakukan adalah sebanyak 25 siklus dengan maksud

agar jumlah fragmen DNA hasil PCR cukup untuk dianalisis pada tahap

berikutnya. Maka dari itu siklus PCR diatur sebanyak 25 siklusdan proses

PCR dilakukan kurang lebih selama 3 jam. Setelah set-up selesai ketiga

tabung tadi dimasukan ke dalam mesin PCR dan proses PCR dimulai. Berikut

adalah penjelasan yang terjadi ketika proses berlangsung:

a. Tahap denaturasi pada 94℃ selama 1 menit.

Pada tahap ini DNA untai ganda berubah menjadi DNA untai tunggal

akibat putusnya ikatan hidrogen pasangan basa DNA.Suhu denaturasi

bergantung pada komposisi templat.Jika mengandung banyak nukleotida GC,

maka suhu yang diperlukan untuk denaturasi lebih tinggi dan waktu yang

36
dibutuhkan lebih lama akibat kuatnya ikatan hidrogen yang mengikat kedua

pasangan basa ini. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi dan waktu yang terlalu

lama akan menurunkan aktivitas DNA polimerase yang akan berdampak pada

efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat. Sedangkan suhu

yang terlalu rendah dan waktu yang terlalu singkat dapat menyebabkan proses

denaturasi DNA templat tidak sempurna.

b. Annealing atau penempelan primer pada suhu 50℃ selama 1 menit.

Pada tahap ini primer akan menempel secara spesifik pada templat DNA

yang komplemen secara antiparalel. Termal melting (Tm) adalah suhu dimana

jumlah DNA yang terdenaturasi sebanyak 50%. Proses annealing dilakukan

pada suhu 30-60oC selama 30 detik sampai 1 menit. Terdapat suatu formula

untuk memperoleh suatu perkiraan dari Tm (melting temperature) dari

oligonukleotida dengan panjang basa 17 sampai 25.

Tm (dalam oC) = 4(G+C) +2(A+T)

Suhu annealing adalah 5oC lebih rendah dari Tm. Suhu annealing ini

harus benar-benar diperhatikan agar primer dapat menempel dengan benar

pada ujung 3' DNA template sehingga proses selanjutnya dapat berjalan.

c. Tahap elongasi pada suhu 72℃ selama satu menit.

Pada tahap ini terjadi perpanjangan primer sehingga terbentuk DNA

untai ganda yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase dan dibantu oleh

dNTP secara spesifik. DNA untai ganda ini kemudian akan mengalami

37
denaturasi, penempelan primer, dan elongasi sehingga terbentuk kembali

DNA untai ganda yang baru. Begitu seterusnya hingga amplikon yang

dihasilkan sebanyak (2^n-2n)x, dengan n adalah jumlah siklus dan x adalah

jumlah templat awal. Berdasarkan rumus tersebut dapat disimpulkan bahwa

fragmen DNA yang akan diamplifikasi akan meningkat secara eksponensial

setelah siklus keempat dan DNA nontarget (long product) akan meningkat

secara linier. Suhu yang digunakan pada tahap elongasi berada sedikit di

bawah suhu optimum bagi enzim Taq DNA polimerase.Suhu optimum bagi

enzim ini adalah 80℃.

Prosedur selanjutnya adalah elektroforesis agarosa untuk analisis hasil

amplifikasi PCR yang dihasilkan. Elektroforesis adalah teknik pemisahan

komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat

migrasinya dalam medan listrik. Prinsip dasar elektroforesis adalah DNA

memiliki muatan listrik negatif akan ditempatkan pada medan listrik kutub

negatif, sehingga DNA akan bermigrasi ke kutub positif dibawah medan

listrik. Kecepatan migrasi molekul DNA pada proses elektroforesis gel

tergantung pada bentuk dan ukurannya. Makin besar ukuran molekulnya,

makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat

diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA standar yang telah diketahui ukurannya. Lalu

visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet.

38
 Elektroforesis gel terdiri dari elektroforesis gel agarosa dan

poliakrilamid. Elektroforesis agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen

DNA antara 100bp - 50000bp yang dijalankan secara horizontal.

Elektroforesis ini hanya dapat digunakan dalam keadaan DNA linear.

Kemampuan pemisahan ukuran molekul DNA dipengaruhi oleh komposisi gel

dan tebal lempeng gel. Semakin tinggi konsentrasi agarosa yang digunakan,

maka kemampuan pemisahan gel semakin besar sehingga dapat melakukan

pemisahan hingga molekul DNA yang berukuran kecil., sedangkan

elektroforesis poliakrilamid digunakan untuk memisahkan DNA yang

berukuran lebih rendah dari 100bp dan dijalankan secara vertikal.

Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan

DNA dan panjang molekul DNA.

Pada percobaan ini gel agarosa digunakan sebagai medium karena

warnanya transparan dan sampel yang digunakan memiliki skala resolusi

fragmen DNA diantara 100bp - 2000bp. Pertama-tama, serbuk putih agarosa

ditimbang sebanyak 0,6071 gram dan dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer.

Lalu, ditambahkan buffer TAE 1x sebanyak 10 mL. Buffer TAE 1x terdiri

dari larutan buffer yang mengandung tris-asetat 0,04 M dan EDTA 0,001 M

pH 8,0. Tris-asetat 0,04 M berfungsi sebagai pemberi suasana asam dan untuk

menjaga pH agar sesuai dengan kondisi optimal. EDTA 0,001 M pH 8,0

berfungsi sebagai pelindung DNA dari aktivitas enzim nuklease yang dapat

39
 menyebabkan DNA mengalami lisis menjadi fragmen - fragmen dengan

membentuk khelat. Setelah dicampurkan, larutan dipanaskan dengan

microwave sampai agarosa larut sempurna. Larutan agarosa didiamkan hingga

agarosa hangat atau mencapai suhu larutan sekitar 50-60°C karena pada suhu

ini, masih dalam bentuk larutan dan tidak membentuk gel. Kemudian

dimasukkan 1 µL gel red, dihomogenkan, lalu dituang ke dalam tray dan

dimasukkan penyumbat dan pembentuk sumur gel. Gel red berfungsi untuk

mempermudah pergerakan molekul DNA pada gel agarosa. Kemudian

didiamkan selama 45 menit hingga terbentuk gel.

Gambar 4. 2 Struktur Gel Agarosa

Gel agarosa yang terbentuk (tray) dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis

yang telah berisi buffer TAE 1x sampai gel terendam seluruhnya agar

pergerakan partikel DNA berjalan dengan baik. Buffer TAE memiliki pH 8

40
yang berfungsi sebagai elektrolit yang memiliki ion - ion penghantar listrik

sehingga DNA akan bergerak dari arah negatif ke positif.

Selanjutnya dilakukan pembuatan marker, kontrol positif, sampel hasil

PCR, dan kontrol negatif yang akan dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa.

Sebanyak 5µL marker dan 1µL gel red dicampurkan dengan menggunakan

mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung mikro 1 yang berfungsi sebagai

marker atau standar dimana terdapat fragmen DNA yang ukurannya telah

diketahui, lalu ke dalam tabung 2 dimasukkan sebanyak 10 µL kontrol positif

produk hasil PCR, 2µL loading dye, dan 2µL gel red yang berfungsi sebagai

kontrol positif. Kemudian, ke dalam tabung 3 dimasukkan sebanyak 10 µL

produk hasil PCR, 2µL loading dye, dan 2µL gel red sebagai sampel yang akan

dianalisis pada proses elektroforesis, serta ke dalam tabung 4 dimasukkan

sebanyak 10µL kontrol negatif produk hasil PCR, 2µL loading dye, dan 2µL

gel red. Untuk pembuatan larutan sampel pada tabung 3, kontrol negatif, dan

kontrol positif disentrifugasi selama 1 menit agar campurannya merata.

Selanjutnya ke dalam sumur 1 dimasukkan marker sebanyak 2µL, ke

dalam sumur 2 dimasukkan kontrol positif sebanyak 14µL, ke dalam sumur 3

dimasukkan sampel atau produk hasil PCR sebanyak 14µL, dan ke dalam

sumur 7 dimasukkan 14µL kontrol negatif. Teknik memasukkannya harus

dengan tepat. Jika mikropipet terlalu dalam dapat merusak sumur gel dan

membuat sumur pecah, jika tidak terlalu dalam maka sampel sebagian akan

41
keluar dari sumur dan menganggu proses elektroforesis. Setelah itu, penutup

chamber dipasang dan alat di set up pada tegangan 80 volt selamat 45 menit.

Tegangan yang digunakan tidak boleh terlalu tinggi karena akan menurunkan

resolusi dan menghasilkan panas yang dapat merusak gel agarosa.

Marker digunakan sebagai penanda pita - pita DNA hasil elektroforesis

sehingga produk hasil PCR bisa dibandingkan. Marker DNA adalah segmen

DNA yang spesifik dan sudah diketahui ukurannya. Loading dye berfungsi

sebagai pemberat agar produr PCR tidak keluar dari sumur, memonitor

mobilitas elektroforesis, dan memberi warna pada pita DNA. Loading dye

terdiri dari bromfenol biru dan xylene sianol untuk visualisasi perpindahan

migrasi DNA. Adanya pewarna tersebut berfungsi sebagai indikator pada

proses elektroforesis. Gliserol untuk membuat DNA berada di bawah sumur

agar tidak keluar, dan EDTA untuk mengikat ion logam dan menghambat

logam yang berikatan dengan nukleat. Gel red berfungsi untuk mempermudah

migrasi fragmen - fragmen DNA selama proses elektroforesis. Gel red

merupakan penanda interkalat asam nukleat, secara struktur hampir mirip

dengan ethidium bromida dan juga merupakan fluoropore. Fluoresensi terjadi

karena adanya elektron yang tereksitasi ke tingkat energi lebih tinggi, namun

kondisi ini tidak stabil sehingga elektron akan kembali ke keadaan dasar yang

memiliki energi lebih rendah dan membebaskan sejumlah energi berupa sinar

tampak dengan panjang gelombang tertentu yang menghasilkan warna. Ketika

42
terkena sinar ultraviolet, gel red akan mengalami fluorosensi dengan warna

oranye jika terikat ke molekul DNA. Ada juga ethidium bromida yang memiliki

sifat yang sama dengan gel red tetapi memilki toksisitas tinggi. Selain itu, gel

red lebih sensitif daripada ethidium bromida. Kontrol positif digunakan untuk

melihat apakah kondisi elektroforesis berjalan. Jika tidak ada pita di kontrol

positif menunjukkan adanya kesalahan di master mix, konsentrasi MgCl2, suhu

primer annealing, dan waktu ekstensi. Kontrol negatif digunakan untuk melihat

apakah ada kontaminasi. Jika setelah elektroforesis terdapat pita di kontrol

negatif menunjukkan adanya kontaminasi, jika pita lebih kecil dari kontrol

positif atau sampel, kemungkinan terdapat kontaminasi primer dimer dan jika

pita lebih besar atau sama dengan kontrol positif atau sampel, kemungkinan

terdapat kontaminasi templat.

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur -

sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif yang

sudah direndam dengan buffer TAE 1x dan ketika dialiri arus listrik DNA

akan bergerak ke kutub positif. Laju migrasi DNA pada medan listrik

berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi ditentukan oleh ukuran

panjang dan berat DNA. Fragmen DNA berukuran kecil akan bermigrasi lebih

cepat dibandingkan ukuran yang lebih besar.

Setelah dielektroforesis, hasilnya divisualisasi dengan sinar UV unit

9184 pada panjang gelombang 312nm. Panjang gelombang 312nm digunakan

43
karena merupakan panjang gelombang ideal untuk melihat pita. DNA

memiliki bentuk planar dan mengandung ikatan hidrogen antar basa-basa

pengusunnya yaitu basa guanin dan sitosin serta basa adenin dan timin. Gel

red akan masuk pada sela-sela ikatan hidrogen melalui bagian atas dan bawah

untai DNA. Sehingga saat dipancarkan sinar UV akan memberikan pita yang

terlihat jelas. Pita ini menunjukkan ukuran posisi relatif DNA. Jika digunakan

sinar yang intensitasnya lebih tinggi dapat merusak DNA dan tidak akan

tampak pita yang terbentuk. Gel diletakkan di atas transluminator UV.

Transluminator UV dinyalakan, lalu pita-pita DNA yang tervisualisasi

diamati. Di bawah sinar UV, kontrol positif memberikan hasil positif yang

ditandai dengan munculnya pita yang paling jelas dan pada kontrol negatif

menghasilkan hasil negatif dengan ditandai dengan tidak munculnya pita.

Penentuan konsentrasi DNA dilakukan dengan membandingkan ketebalan pita

pada sampel dengan marker.

44
 Gambar 4. 3 Elektroforesis Hasil amplifikasi PCR

Pada percobaan elektroforesis gel agarosa berikut didapat ukuran relatif

DNA berada pada 480 pb. Hal ini meunjukkan bahwa rDNA yang didapat

bukanlah rDNA 16S yang memiliki 1.400 pb. Hal-hal yang mempengaruhi

tidak terbentuknya pita adalah sebagai berikut:

 Saat proses lisis sel DNA tidak terisolasi dengan baik, sehingga

tidak terbentuk DNA templat dan primer.

 Pemipetan yang kurang akurat menggunakan mikro pipet,

sehingga komposisi pereaksi-pereaksi yang ditambahkan tidak

sesuai dan membuat proses PCR terganggu.

 Penggunaan enzim TAQ polymerase yang tidak memiliki

mekanisme proofreading, sehingga banyak dihasilkan produk

nonspesifik yang ukuran pasang basanya belum tentu memiliki

pasangan basa yang sesuai yaitu 1.200 pb

 Suhu annealing yang terlalu tinggi sehingga menyebabkan

denaturasi

 Siklus PCR tidak berjalan sempurna

Setelah elektroforesis, kemudian dilakukan pemurnian fragmen DNA hasil

PCR dengan presipitasi etanol. Hasil PCR dimasukkan ke dalam tabung mikro

45
1,5 µL. Etanol p.a ditambahkan ke dalam cuplikan hasil PCR sebanyak dua kali

produk PCR 0.1 kali volume natrium asetat 3M pH 7, kemudian di inkubasi

satu malam pada suhu -20oC. Setelah di inkubasi, kemudian di sentrifugasi pada

suhu 4oC dengan kecepatan ~ 12.000 rpm selama 30 menit. Sentrifugasi

dilakukan untuk memisahkan campuran sehingga terbentuk endapan yang

mengandung mitokondria. Lalu tabung mikro yang berisi endapan dan

supernatan diinkubasi agar pemisahannya sempurna. Supernatan di dekantasi

dan endapannya dicuci dengan etanol 70% dingin sebanyak lima kali volume.

Lalu disentrifugasi kembali pada suhu 4oC dengan kecepatan ~ 12.000 rpm

selama 10 menit sehingga menghasilkan endapan dan supernatan. Supernatan

dibuang dengan cara di dekantasi dan pelet dikeringkan pada udara terbuka agar

semua etanol menguap. Setelah pelet kering, lalu ditambahkan 20µL NFW.

Penggunaan etanol p.a pertama kali dimasukkan agar DNA mitokondria

mengendap dan terpisah dari molekul-molekul non DNA mitokondria.

Sedangkan penggunaan etanol 70% digunakan untuk mencuci DNA

mitokondria agar bersih dari pengotor.

Prosedur selanjutnya adalah pemotongan produk PCR hasil presipitasi

dengan enzim Hinf 1 untuk menganalisis hasil restriksi produk PCR. Produk

PCR hasil presipitasi ditambahkan buffer restriksi 2μL yang berfungsi untuk

mempertahankan pH dengan nilai tertentu agar enzim dapat bekerja pada pH

optimum dan DNA tidak terdegradasi dengan penambahan bahan lainnya.

46
Setelah itu, fragmen DNA ditambahkan enzim Hinf 1 sebanyak 2μL. Enzim

Hinf 1 merupakan enzim restriksi yang berfungsi untuk memotong DNA pada

urutan nukleotida spesifik. Enzim restriksi memotong untaian ganda DNA

dengan memutus ikatan kovalen di antara fosfat dari satu

deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan

dengannya. Enzim restriksi akan mengenali dan memotong DNA hanya pada

urutan nukleotida tertentu, biasanya sepanjang 4 hingga 6 pasang basa. Urutan

pengenal enzim Hinf 1 adalah GA↓NTC. Kemudian ditambahkan akuabidest

steril sampai volume 20μL sebagai pelarut fragmen DNA. Setelah itu,

campuran reaksi dispin dengan mikrosetrifugasi selama beberapa detik untuk

menurunkan framen DNA dan seluruh pelarut yang masih menempel pada

dinding tabung. Lalu, campuran diinkubasi pada alat master cycler selama 2

jam pada suhu 37°C agar enzim restriksi Hinf 1 dapat bekerja secara optimal.

Suhu 37°C merupakan suhu optimal bekerjanya suatu enzim. Setelah 2 jam,

produk DNA hasil restriksi dielektroforesis dengan gel agarosa, dimana

dilakukan perlakuan yang sama dengan elektroforesis hasil PCR.

Perbedaannya pada saat elektroforesis hasil PCR, produknya tidak dipotong

dengan enzim Hinf 1. Hasil elektroforesis dikarakterisasi dengan bantuan sinar

UV. Pada sumur 1 merupakan marker dengan ukuran DNA yang telah

diketahui. Pada tabung 2 merupakan hasil restriksi. Pada tabung 6 adalah

kontrol tanpa restriksi dari sampel yang terdapat hasil pita elektroforesis hasil

amplifikasi PCR.

47
 Marker yang digunakan pada percobaan ini adalah genaid 100pb DNA

Ladder. Marker ini memiliki 12 garis fragmen DNA untai ganda. Marker tipe

ini cocok untuk mengukur fragmen DNA dari 100-3000bp. Marker 100bp DNA

Ladder mempunyai kuantitas sebanyak 50µg/500µL. Syarat marker yang

digunakan harus memiliki fragmen DNA dengan beragam ukuran agar hasil

pita dapat dibandingkan.

Gambar 4. 4 Hasil Elektroforesis DNA yang telah direstriksi

Dari hasil elektroforesis dengan bantuan sinar UV, didapatkan hasil

bahwa terdapat 3 pita pada sampel. Ukuran pita DNA hasil restriksi sebanyak

2 pita karena terdapat pemotongan fragmen DNA oleh enzim restriksi pada

daerah D-loop (sisi restriksi) berbeda dengan hasil pcr biasa yang

menghasilkan 1 pita.

48
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

DNA bakteri E. coli dapat diisolasi dengan metode lisis sel. DNA

bakteri dapat diperbanyak (amplifikasi) secara in vitro dengan teknik PCR

(Polymerase Chain Reaction). Fragmen DNA hasil PCR dapat dianalisis

dengan metode elektroforesis gel agarosa. Fragmen DNA hasil PCR dapat

dimurnikan dengan presipitasi etanol. Hasil PCR berhasil dianalisis dengan

PCR-RFLP dengan menggunakan enzim HinF1

5.2 Saran

49
 Penggunaaan master mix seharusnya satu kelompok, satu master mix.

Bekerja dalam keadaan aseptis perlu dibiasakan untuk meminimalisir

kesalahan dalam percobaan dan terkontaminasinya hasil percobaan.

DAFTAR PUSTAKA

Al Hanif, M. Shiddiq. 2009. Pola Resistensi Bakteri dari Kultur Darah

Terhadap Golongan Penisilin di Laboratorium Mikrobiologi Klinik
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Tahun 2001-2006
(Skripsi). Fakultas kedokteran Universitas Indonesia: Jakarta.

Herman, R.F and N. Pack. 1978. Analytical Biochemistry. Second edition. John
wiley and sons. Newyork..

Joshi, M., Deshpande, J. D. 2011. Polymerase Chain Reaction : Methods,

Principles and Application. International Journal of Biomedical
Research.

Kavya, S. R,. 2015. PCR Technique with its Application. Research and
Reviews: Journal of Microbiology and Biotechnology.

Lestari, P.B & Hartati, T.W. 2017. Mikrobiologi Berbasis Inkuiry. Cetakan 1.
Penerbit Gunung Samudera. Malang.

Maksum, I.P., Sriwidodo., Gaffar, S., Hasan, K., Subroto, T., Soemitro, S.
Teknik Biologi Molekular.

McKee, T and J.R McKee. 1999. Biochemistry. Second edition. McGrow Hill.
Boston.

50
Page, D.S. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia. Diterjemahkan oleh soedana.
Erlangga. Jakarta.
Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta.
Toha, A.H.A. 2001. Deoxyribo Nucleac Acid : Keanekaragaman, Ekspresi,
Rekayasa dan Efek Pemanfaatannya. Alfabeta. Bandung.

51