PERCOBAAN 1

HIDROLISA PATI DAN AKTIVITAS PTHIALIN DALAM SALIVA

1. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk mengindetifikasi hasil – hasil hidrolisa
pati (amilum ) dan untuk mengetahui aktivitas pthialin yang terdapat dalam
saliva terhadap pati.

2. Dasar Teori
Pati terdiri atas dua macam pilosakarida yang kedua – duanya adalah
polimer dari glukosa yaitu amilosa ( kira – kira 20 – 28 % ) dan sisanya
amilopektin. Amilosa terdiri atas 250 – 300 unit D–glukosa yang terikat dengan
ɑ–1,4 glikosidik, jadi molekulnya merupakan rantai lurus. Amilopektin juga
terdiri atas molekul D–glukosa dengan sebagian besar ɑ–1,4 glikosidik dan
sebagian lagi ikatan ɑ–1,6 glikosidik ini menyebabkan terjadinya cabang,
sehingga molekulnya amilopekyin berbentuk rantai lurus dan bercabang.
Sebagian dari struktur amilosa digambarkan sebagai berikut :

Molekul amilopektin lebih besar dari pada molekul amilosa, karena

terdiri atas lebh dari 1000 unit glkosa. Butir – butir pati tidak larut dalam air
dingin, tetapi apabiila suspense dalam air dipanaska maka akan terjadi suatu
larutan koloid yang kental. larutan koloid ini apabila diberi larutan iodine akan
berwarna biru. Warna biru dengan iodine disebabkan oleh molekul amilosa

Penuntun Praktikum Biokimia 1

 yang membentuk senyawa kompleks. amilopektin dengan iodine akan
memberikan warna ungu atau merah lembayung.
Amilum dapat dihidrolisis sempurna dengan menggunakan asam
sehingga menghasilkan glukosa. Hidrolisa juga dapat dilakukan dengan
bantuan enzim amylase. Dalam cairan ludah yang dikeluarkan oleh pankreas
terdapat amilase yang berkerja terhadap amilum yang terdapat dalam makanan
kita. Oleh enzim amilase diubah menjadi maltose dalam bentuk ɑ–maltose.

Amilopektin
Enzim merupakan katalis organik yang dihasilkan oleh organisme-
organisme hidup. Sebagian besar reaksi – reaksi sel hidup akan berlangsung
sangat lambat bila reaksi tersebut tidak dikatalis oleh enzim. enzim mempunyai
aktivitas katalis tertentu dan reaksi yang spesifik dengan subtract tertentu pula.
Konsentrasi enzim pada umumnya bukan dimasukkan sebagai berapa
banyak kuantitas enzim yang ada, melainkan sebagai aktivitasnya pada suatu
subtrat dan dinotasikan sebagai UNIT. Harga/besarnya 1 (satu) unit adalah
sejumlah enzim yang dapat mengkatalisa 1 mikromol subtract dalam satuan
waktu pada kondisi reaksi tertentu. Kondisi reaksi tersebut adalah pada
temoeratur reaksi arten.

Penuntun Praktikum Biokimia 2

 Saliva mengandung 99,24% air dan 0,58% zat padat. 2/3 bagian dari zat
padat ini merupakan zat organic , terutama pthialin dan micin. 13 bagian intinya
adalah ion – ion anorganik seperti Ca2+, SO42-, PO43-, dan lain – lain.
Pthialin dari saliva ( amilase ) dapat menghidrolisa pati, dekstrin dan
glikogen didalam mulut. Enzim amilase dapat menyerang ikatan 1,4 glikosidik
dari amilosa dan amilopektin.
Aktivitas amilase ditentuka dengan mengukur hasil degrasi pati.
Hilangnya subtrat dapat diukur dengan pengurangan derajat pewarnan iodine
terhadap subtrat.

3. Bahan Dan Alat

A. Hidrolisa Pati
– Larutan pati 1% – Tabung reaksi 10 buah
– Hcl pekat – Rak tabung reaksi
– Pereaksi fehling – Pipet tees
– Pereaksi iodine – Kompor
– Gelas kimia – Penangas air
– Gelas ukur 50 mL – Stop watch
B. Aktivitas Pthalain dalam saliva
– Gelas piala 250 mL – Serbuk pati ( amilum )
– Gelas ukur 25 mL – Larutan iodine 0,01 M
– Batang pengaduk – Larutan fehling
– Larutan saliva

4. Cara Kerja
A. Hidrolisa Pati
1. Buat larutan pati 1% sebanyak 100 mL dalam gelas kimia.
2. Tambahkan HCL pekat 3 mL dan didihkan.
3. Selang 2 menit ambil 3 mL campuran dan tambahakan 3 tetes iodine.
4. Pada waktu yang sama, ambil 3 mL campuran, tambahkan 5 mL
pereaksi fehling dalam tabung reaksi. Langkah ke 3 dan 4 ini

Penuntun Praktikum Biokimia 3

 dilakuan sampai menit ke 10. Jadi ada pada 10 tabung berisi iodine
dan fehling.
5. Tabung – tabung yang berisi pereaksi fehling tersebut diletakkan
dalam air mendidih. Lalu dinginkan.
6. Amati derajat reduksi dan bandngkan dengan uji iodine.

B. Aktivitas Pthilain dalam salvia

1. Campurkan fehling A dengan fehling B dalam volume yang sama
2. Suspensikan 0,5 gram pati dengan 5 mL air dalam gelas piala 250
mL.
3. Tambahkan sedikit demi sedikit denagn air yangsedang mendidih
sebanyak 50 mL, sambil diaduk selama 30 detik.
4. Didinginkan pada temperature kamar

5. Ambil 25 mL larutan pati, tambahkan 10 tetes saliva, aduk sampai

homogeny.
6. Dalam waktu 2menit, ambil 1 mL larutan ini ( sebanyak 2 buah
tabung reaksi ), lalu pada tabung pertma ditest terhadap larutan
fehling.
7. Lakukan percobaan diatas sampai 10 meit.
8. Amati perubahan warna untuk setiap menitnya. perubahan warna
untuk tabung yang berisi iodine adalah dari biru–tidak berwarna.
Sedangakan untuk test fehling harus dipanaskan diatas penangas air.
9. Jika tidak terbentuk warna pada perobaan diatas dalam waktu 5
menit, ulangi percobaan menggunakan 20 tetes larutan saliva.

5. Lembaran Pengamatan
A. Hidrolisa Pati

Penuntun Praktikum Biokimia 4

 Tabung ke– Waktu ( Warna dengan Warna dengan
menit ) iodine fehling
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10

B. Aktivitas Pthalain dalam saliva

Tabung ke– Waktu ( Warna dengan Warna dengan
menit ) iodine fehling
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10

6. Pertanyaan / Tugas
1. Apa yang dimaksud dengan amilum ( pati )?
2. Terangkanlah pembagian karbohidrat berdasarkan jumlah unit gulanya
dan berikan contoh – contohnya !
3. Bagaimana perubahan warna pada pati yang dihidrolisa setelah waktu
2,4,6.8.10 menit terhadap uji iodine dan fehling
4. Terangkan prinsip pengujian pati dengan reagen iodine dan hasil
hidrolisa pati dengan reagen fehling !
5. Mengapa enzim dapat bersifat biokatalis ?
6. Tergolong kelompok apakah enzim pthialin pada saliva? terangkan !
7. Pada percobaan diatas , pati berfungsi sebagai subtract. apakah yang
dimaksud dengan subtract ?
8. Terangkanlah hiotesis lock and key serta hipotesa induced-fit dalam
mekanisme molekuler reaksi antara enzim dan subtract!

Penuntun Praktikum Biokimia 5

 PERCOBAAN II
REAKSI UMUM KARBOHIDRAT

I. TUJUAN
Mempelajari reaksi identifikasi dan reaksi umum karbohidrat

II. LANDASAN TEORI

Karbohidrat merupakan persenyawaan antara karbon, hidrogen, dan
oksigen yang terdapat di alam dengan rumus empiris Cn(H2O)n. Melihat rumus
empiris tersebut, maka senyawa ini pernah diduga sebagai ”hidrat dari karbon”,
sehingga disebut sebagai karbohidrat. Sejak tahun 1880 telah disadari bahwa
gagasan ”hidrat dari karbon” merupakan gagasan yang tidak benar. Hal ini
karena ada beberapa senyawa yang mempunyai rumus empiris seperti
karbohidrat tetapi bukan karbohidrat.
Asam asetat misalnya dapat ditulis (C2(H2O)2 dan formaldehid dengan
rumus CH2O atau HCHO. Dengan demikian suatu senyawa termasuk
karbohidrat tidak hanya ditinjau dari rumus empirisnya saja, tetapi yang paling
penting ialah rumus strukturnya.
Dari rumus struktur akan terlihat bahwa ada gugus fungsi penting yang terdapat
pada molekul karbohidrat yaitu gugus fungsi karbonil(aldehid dan keton).
Gugus-gugus fungsi itulah yang menentukan sifat senyawa tersebut.
Berdasarkan gugus yang ada pada molekul karbohidrat dapat didefinisikan
sebagai polihidroksialdehida dan polihidroksiketon atau senyawa yang
menghasilkannya pada proses hidrolisis.
Karbohidrat yang penting dalam ilmu gizi dibagi dalam dua golongan, yaitu
karbohidrat sederhana dan karbohidrat kompleks. Sesungguhnya semua jenis
karbohidrat terdiri atas karbohidrat sederhana atau gula sederhana; karbohidrat
kompleks mempunyai lebih dari dua unit gula sederhana dalam satu molekul
(Almatsier, 2010). Karbohidrat sederhana terdiri atas (Almatsier, 2010) :

Penuntun Praktikum Biokimia 6

 1. Monosakarida yang terdiri atas jumlah atom C yang sama dengan molekul
air, yaitu [C6(H2O)6] dan [C5(H2O)5];
2. Disakarida yang terdiri atas ikatan 2 monosakarida di mana untuk tiap 12
atom C ada 11 molekul air [C12(H2O)11];
3. Gula alkohol merupakan bentuk alkohol dari monosakarida
4. Oligosakarida adalah gula rantai pendek yang dibentuk oleh galaktosa,
glukosa, dan fruktosa.

Monosakrida adalah karbohidrat yang tidak dapat dihidrolisis menjadi

karbohidrat yang lebih sederhana. Monosakarida ini dapat diklasifikasikan
sebagai triosa, tetrosa, pentosa, heksosa, atau heptosa, bergantung pada jumlah
atom karbon; dan sebagai aldosa atau ketosa bergantung pada gugus aldehida
atau keton yang dimilki senyawa tersebut (Murray dkk, 2009).
Gliseraldehid adalah aldosa yang paling sederhana, dan
dihidroksiasetan adalah ketosa yang paling sederhana pula. Aldosa atau ketosa
lainnya dapat diturunkan dari gliseraldehida atau dihidroksiaseton dengan cara
menambahkan atom karbon, masing-masing membawa gugus hidroksil.
Sebagian besar monosakarida dikenal sebagai heksosa, karena terdiri atas 6-
rantai atau cincin karbon. Atom-atom hidrogen dan oksigen terikat pada rantai
atau cincin ini secara terpisah atau sebagai gugus hidroksil (OH). Ada tiga jenis
heksosa yang penting dalam ilmu gizi, yaitu glukosa, fruktosa, dan galaktosa.
Ketiga macam monosakarida ini mengandung jenis dan jumlah atom yang
sama, yaitu 6 atom karbon, 12 atom hidrogen, dan 6 atom oksigen.
Perbedaannya hanya terletak pada cara penyusunan atom-atom hidrogen dan
oksigen di sekitar atom-atom karbon. Perbedaan dalam susunan atom inilah
yang menyebabkan perbedaan dalam tingkat kemanisan, daya larut, dan sifat
lain ketiga monosakarida tersebut (Almatsier, 2010).
Disakarida adalah produk kondensasi dua unit monosakarida. Ada
empat jenis disakarida yaitu sukrosa atau sakarosa, maltosa, laktosa, dan
trehalosa. Trehalosa tidak begitu penting dalam ilmu gizi. Kedua monosakarida
yang saling mengikat berupa ikatan glikosidik melalui satu atom oksigen.
Ikatan glikosidik ini biasanya terjadi antara atom C nomor 1 dengan atom C

Penuntun Praktikum Biokimia 7

 nomor 4 dan membentuk ikatan alfa, dengan melepaskan satu molekul. Hanya
karbohidrat yang unit monosakaridanya terikat dalam bentuk alfa dapat
dicernakan. Disakarida dapat dipecah kembali menjadi dua molekul
monosakarida melalui hidrolisis. Glukosa terdapat pada empat jenis disakarida;
monosakarida lainnya adalah fruktosa dan galaktosa (Almatsier, 2010).
Pada umumnya, karbohidrat berupa serbuk putih yang mempunyai sifat
sukar larut dalam pelarut nonpolar, tetapi mudah larut dalam air. Kecuali
polisakarida bersifat tidak larut dalam air. Amilum dengan air dingin akan
membentuk suspensi dan bila dipanaskan akan terbentuk pembesaran berupa
pasta dan bila didinginkan akan membentuk koloid yang kental semacam gel
(Sirajuddin dan Najamuddin, 2011)

III. ALAT DAN BAHAN

Alat :
1. Tabung reaksi
2. Penjepit
3. Kaki tiga
4. Bunsen
Bahan :
1. Amilum 1%
2. Desktrin 1%
3. Sukrosa 1%
4. Maltosa 1%
5. Galaktosa 1%
6. Fruktosa 1%
7. Glukosa 1%
8. Arabinosa 1%
9. Reagent molisch, Barfoed, Seliwanoff
10. H2SO4 pekat
11. Larutan iodium
12. HNO3 pekat

Penuntun Praktikum Biokimia 8

 13. HCl 2 N, HCl pekat
14. NaOH 2%

IV. LANGKAH KERJA

1. Uji Molisch
1. Dua tetes larutan uji, dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
2. Kemudian ditambahkan 3 tetes pereaksi molisch. Dan dicampur
dengan baik.
3. Tabung reaksi dimiringkan, kemudian dialirkan dengan hati-hati 1 ml
H2SO4 pekat melalui dinding tabung agar tidak bercampur.
2. Uji Iodium
1. 2 ml larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau porselin tetes.
2. Kemudian ditambahkan dua tetes larutan iodium.
3. Kemudian warna spesifik yang tebentuk diamati.

3. Uji Benedict
1. 5 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan 15 tetes pereaksi benedict. Campurlah dengan baik.
2. Didihkan di atas api kecil selama dua menit atau dimasukkan ke dalam
pengagas air mendidih selama 5 menit.
3. Didinginkan perlahan-lahan.
4. Diperhatikan warna atau endapan yang terbentuk.
4. Uji Barfoed
1. 10 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian
ditambahkan 10 tetes pereaksi berford. Campurkan dengan baik.
2. Kemudian dipanaskan di atas api kecil sampai mendidih selama satu
menit atau dimasukkan ke dalam penangas air mendidih selama 5
menit.
3. Diperhatikan warna atau endapan yang terbentuk.
5. Uji Seliwanoff

Penuntun Praktikum Biokimia 9

 1. 5 tetes larutan uji dan 15 tetes pereaksi seliwanoff dimasukkan ke
dalam tabung reaksi.
2. Kemudian dididihkan di atas api kecil selama 30 detik atau dalam
penangas air mendidih selama 1 menit.
3. Hasil positif ditandai terbentuknya larutan berwarna merah orange.
6. Uji Osazon
1. 2 ml larutan uji dimasukkan kedalam tabung reaksi.
2. Kemudian ditambahkan seujung spatel fenihidrasin-hidroklorida dan
kristal natrium asetat.
3. Lalu dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 20 menit.
4. Kemudian didinginkan perlahan-lahan di bawah air kran.
5. Diperhatikan kristal yang dibentuk kemudian diidentifikasi di bawah
mikroskop.

7. Uji Hidrolisis Pati

1. Amilum dengan volume 5 ml 1% dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
kemudian ditambahkan 2,5 ml HCl 2 N.
2. Kemudian dicampurkan dengan baik, lalu dimasukkan ke dalam
penangas air mendidih.
3. Setelah 3 menit, diuji dengan iodium dengan mengambil 2 tetes
larutan dalam porselin tetes. Kemudian dicatat perubahan warna yang
terjadi.
4. Selanjutnya, dilakukan uji iodium setiap 3menit sampai hasilnya
berwarna kuning pucat.
5. Lalu dilanjutkan hidrolisis selama 5 menit lagi.
6. Setelah didinginkan, diambil 2 ml larutan hidrolisis, dan dinetralkan
dengan NaOH 2%. Diuji dengan kertas lakmus.
7. Selanjutnya, diuji dengan benedict (15 tetes benedict dan 5 tetes
larutan)
8. Terakhir, hasil eksperimen hidrolisis pati disimpulkan.
8. Uji Hidrolisis Sukrosa

Penuntun Praktikum Biokimia 10

 1. Sukrosa dengan volume 5 ml sukrosa 1 % kedalam tabung reaksi dan
ditambahkan 5 tetes HCl pekat.
2. Dicampur dengan baik, lalu dipanaskan dengan penangas air
mendidih selama 30 menit.
3. Setelah didinginkan, dinetralkan dengan NaOH 2 % dan diuji dengan
kertas lakmus.
4. Selanjutnya, diuji dengan benedict, seliwanoff, dan berfoed.
5. Terakhir, disimpulkan hasil dari eksperimen hidrolisis sukrosa.

V. HASIL PENGAMATAN
1. Uji Molisch
NO. ZAT UJI HASIL UJI MOLISCH KARBOHIDRAT (+/-)
1. Amilum 1%
2. Dekstrin 1%
3. Sukrosa 1%
4. Maltosa 1%
5. Galaktosa 1%
6. Fruktosa 1%
7. Glukosa 1%
8. Arabinosa 1%

2. Uji Iodium
NO. ZAT UJI HASIL UJI IODIUM POLISAKARIDA (+/-)
1. Amilum 1%
2. Dekstrin 1%
3. Sukrosa 1%
4. Maltosa 1%
5. Galaktosa 1%
6. Fruktosa 1%
7. Glukosa 1%

Penuntun Praktikum Biokimia 11

 8. Arabinosa 1%

3. Uji Benedict
NO ZAT UJI HASIL UJI BENEDICT GULA REDUKSI (+/-)
1. Amilum 1%
2. Dekstrin 1%
3. Sukrosa 1%
4. Maltosa 1%
5. Galaktosa 1%
6. Fruktosa 1%
7. Glukosa 1%
8. Arabinosa 1%

4. Uji Barfoed
NO. ZAT UJI HASIL UJI BARFOED MONOSAKARIDA (+/-)
1. Sukrosa 1%
2. Maltosa 1%
3. Galaktosa 1%
4. Fruktosa 1%
5. Glukosa 1%
6. Arabinosa 1%

5. Uji Seliwanoff
HASIL UJI
NO. ZAT UJI KETOSA (+/-)
SELIWANOFF
1. Sukrosa 1%
2. Galaktosa 1%
3. Fruktosa 1%
4. Glukosa 1%
5. Arabinosa 1%

Penuntun Praktikum Biokimia 12

6. Uji Osazon

NO ZAT UJI HASIL UJI OSAZON GAMBAR

1. Sukrosa

2. Maltosa

3. Galaktosa

4. Glukosa

7. Hidrolisis Pati
HIDROLISIS
NO HASIL UJI IODIUM HASIL
(MENIT)
1. 3
2. 6
3. 9
4. 12
Hasil akhir dengan uji Benedict : Terbentuk endapan merah bata
8. Hidrolisis Sukrosa
PERLAKUAN UJI HASIL UJI
5 tetes larutan Benedict (dipanaskan)
5 tetes larutan Seliwanoff
5 tetes larutan Barfoed (dipanaskan)

Penuntun Praktikum Biokimia 13

 PERCOBAAN III

PENENTUAN KADAR CASEIN

I. TUJUAN PERCOBAAN
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan kadar kasein yang
terdapat dalam susu cair “Indomilk” dan susu bubuk “Dancow”.

II. DASAR TEORI

Kasein merupakan protein penyusun susu terbesar. Di dalamnya tidak
hanya terdiri dari zat-zat organik, melainkan mengandung juga zat-zat
anorganik seperti kalsium, phosphor, dan magnesium. Kasein yang merupakan
partikel yang besar dan senyawa yang kompleks tersebut dinamakan juga kasein
misel (casein micell). Kasein misel tersebut besarnya tidak seragam, berkisar
antara 30 – 300 mµ. Kasein juga mengandung sulfur (S) yang terdapat pada
metionin (0,69%) dan sistin (0,09%). Kasein adalah protein yang khusus
terdapat dalam susu. Dalam keadaan murni, kasein berwarna putih seperti salju,
tidak berbau dan tidak mempunyai rasa yang khas. Kasein dapat diendapkan
oleh asam, enzim rennet dan alkohol. Oleh karena itu kasein dalam susu dapat
dikoagulasikan atau digumpalkan oleh asam yang terbentuk di dalam susu
sebagai aktivitas dari mikrobia.

Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik

seperti lemak susu, kasein (protein susu, dan laktosa (karbohidrat susu). Seperti
halnya asam amino, protein susu (kasein) juga bersifat amfoter. Protein dalam
susu mencapai 3,25%. Struktur primer terdiri dari rantai polipeptida dari asam-
asam amino yang disatukan ikatan-ikatan peptida (peptida linkages). Protein
juga memiliki pH isoelektrik tertentu. pH isoelektrik merupakan suati nilai pH
dimana jumlah muatan listrik positif sama dengan muatan negatifnya. Pada pH
tersebut, protein tidak bermuatan positif maupun negatif, sehingga dapat
membentuk agregat (gumpalan-gumpalan yang keruh) dan mengendap, karena
sebagian protein menunjukkan kelarutan yang minimal pada pH isolektriknya.

Penuntun Praktikum Biokimia 14

 Sifat inilah yang akan digunakan untuk memisahkan atau mengisolasi kasein
dari susu.

Pada prinsipnya ada dua proses yang mendukung reaksi penggumpalan

protein susu yaitu hidrolisis enzimatik k-kasein dan proses non enzimatik
berupa aglomerisasi misel kasein. Kombinasi kedua proses tersebut
menyebabkan perubahan fisik susu yang disebut penggumpalan. Selama proses
penggumpalan berlangsung, terjadi penjeratan lemak melalui pembentukan
ikatan silang atau maktriks gel. Reaksi umum yang dikatalisis oleh enzim
proteolitik adalah hidrolisa ikatan peptide pada protein. Kinetika reaksi proses
pengumpalan protein susu oleh enzim proteolitik dibagi menjadi 3 tahap yaitu:

1. Hidrolisa enzimatis pada k-kasein

2. Flokulasi misel kasein
3.Pembentukan dan perkembangan ikatan silang gel susu.

Kadar kasein pada protein susu mencapai 80%. Kasein terdiri atas
beberapa fraksi seperti alpha-casein, betha-casein, dan kappa-casein. Kasein
merupakan salah satu komponen organik yang berlimpah dalam susu bersama
dengan lemak dan laktosa. Kasein penting dikonsumsi karena mengandung
komposisi asam amino yang dibutuhkan tubuh. Dalam kondisi asam (pH
rendah), kasein akan mengendap karena memiliki kelarutan (solubility) rendah
pada kondisi asam. Susu adalah bahan makanan penting, karena mengandung
kasein yang merupakan protein berkualitas juga mudah dicerna (digestible)
saluran pencernaan.

Kasein dapat diendapapkan oleh asam, enzim rennet, dan alkohol.

Selain penambahan asam, pengendapan kasein susu juga dilakukan dengan
penambahan renin, yaitu suatu enzim proteolitik yang diperoleh dari induk sapi
betina. oleh karena itu, susu dapat dikoagulasikan (digumpalkan) oleh asam
yang terbentuk di dalam susu sebagai aktivitas dari mikroba.
kzasein digunakan untuk sumber protein dalam tubuh. Sebagai suplai asam-

Penuntun Praktikum Biokimia 15

 asam amino essential.Secara komersial digunakan untuk bahan perekat,
pelindung lapisan kertas, dan plastik kasein (Pratama, 2013).

Protein susu dapat dikoagulasikan dengan asam (asam organik). Asam

yang sering digunakan dalam pembuatan beberapa varietas adalah asam laktat
dan asam asetat. Pengaruh utama pengasaman adalah penurunan pH susu yang
menyebabkan lepasnya ion kalsium dari kalsium kaseinat karena tersedianya
ion H+ yang semakin meningkat sehingga dapat memecah senyawa kalsium
fosfat sebagai berikut:

Ca3(PO4)2 + 3 H+  3 Ca2+ + HPO42- + H2SO4

Pecahnya senyawa kalsium fosfat menyebabkan stabilitas kasein goyah

sehingga terjadi koagulasi. Koagulasi kasein disebut sempurna apabila titik
isoelektris tercapai pada pH 4,6-4,7.

III. ALAT DAN BAHAN

A. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah gelas beker, penangas
air, pengaduk, corong, kertas saring, dan buret.
B. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah asam asetat 1 N
dan 0,25 N, NaOH 0,1 N, formaldehida 40%, fenolftalein, susu, dan akuades.

IV. PROSEDUR PERCOBAAN

1. Memasukkan 10 ml sampel dalam gelas beker, memanaskan di penangas air
pda suhu 40 0C. Mengencerkan bila digunakan sampel susu kental dengan
akuades 1:2 dan menambahkan susu bubuk dengan akuades 1:9
2. Menambahkan 1 ml asam asetat 1 N, mengaduk homogen dan mendiamkan
selama 10 menit. Menambahkan lagi 4,5 ml asam asetat 0,25 N (untuk
mencapai pH isoelektrik dari casein) mengaduk dan mendiamkan selama 10
menit.

Penuntun Praktikum Biokimia 16

 3. Mendekanter ke dalam corong dengan kertas saring. Mencuci endapan
dengan akuades sampai air cucian bersifat netral
4. Kemudian memasukkan kertas saring dan endapan ke dalam beaker semula
dan menambahkan akuades hingga volume ± 20 ml
5. Menambahkan 2 ml larutan NaOH 0,1 M, memanaskan diatas penangas air
0
sampai larut seperti susu dan dinginkan sampai suhu 21-24 C,
menambahkan 3 tetes fenolftalein.
6. Menambahkan 2 ml formaldehyde 40% (warna rose hilang), mentitrasi
dengan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna rose kembali.

V. HASIL PERCOBAAN
A. Hasil Pengamatan
No. LangkahPercobaan Pengamatan

Penuntun Praktikum Biokimia 17

 BAB IV

PENENTUAN KADAR GLUKOSA

1. Tujuan Percobaan
Percobaan bertujuan untuk menentukan kadar Glukosa dalam darah

2. Teori Percobaan
Sebagian besar monosakarida setelah melalui proses penyerapan
melalui dinding usus halus dibawa oleh aliran darah kehati. Di dalam hati,
monosakarida mengalami proses sintesis menghasilkan glikogen,oksidasi,
CO2 dan H2O atau dilepaskan untuk dibawa dengan aliran darah kebagian
tubuh yang memerlukannya. Sebagian lain monosakarida dibawa langsung
ke sel jaringan organ tertentu mengalami proses metabolism lebih lanjut.
Karena berbagai pengaruh factor dan hormon insulin yang dihasilkan oleh
kelenjar pangkreas, hati dapat mengatur glukosa dalam darah. Bila kadar
glukosa dalam darah meningkat sebagai akibat naiknya proses pencernaan
dan penyerapan karbohidrat. Sintesis glikogen oleh hati akan naik.
Sebaliknya nilai kadar glukosa menurun, umpamanya akibat latihan
olahraga, glikogen diuraikan menjadi glukosa selanjutnya mengalami
proses katabolisme menghasilkan energi ( dalam bentuk energy kimia , ATP
) yang dibutuhkan oleh kegiatan olahraga tersebut.
Kadar glukosa dalam darah merupakan faktor yang sangat penting
untuk kelancaran kerja tubuh. Kadar normal glukosa dalam darah adalah 70-
90 mg / 100 mL. keadaan dimana kadar glukosa dibawah 70-90 mg / mL
disebut hipoglisemia,sedangkan diatas 90 mg/100 mL disebut
hiperglisemia.
Hasil reduksi ion kupri oleh glukosa dalam suasana basa dengan
arsenmonolibdat memberikan warna biru( molybdenum blue ) yang
kekuatan intensitasnya sesuai dengan konsentrasi glukosa. Absorban dari
larutan ini diukur pada panjang gelombang tertentu( 600 nm ) dengan

Penuntun Praktikum Biokimia 18

 spektrofotometer. Dengan menggunakan hukum Lambert-Beer ,dapat
dihitung kosentrasi zat yang dicari .

3 .Percobaan

A. Pembuatan Filtrat Dara Bebas Protein

1. Ambil 0,1 ml Darah, masukan kedalam tabung sentratifus yang telah
berisi 1,90 ml aquades , aduk dengan baik.
2. Kedalam tabung tersebutditambahkan 1,5 ml, Ba(OH)2 0,3 N, aduk
hingga merata
3. Tambahkan lagi 1,5 ml ZnSO4 50 % ,campur baik-baik dan diamkan
selama 5 menit
4. Sentrifus selama 30 menit
5. Dekantasi cairan bening , hasil inilah filtrate darah yang bebas protein (
beberapa kali pengenceran dalam cara ini )

B. Penentuan Kadar Glukosa dalam Darah

1. Pipet 1 ml darah bebas protein , masukan kedalam tabung reaksi ,
tambahkan 1 ml reagensia alkalis
2. Masukan kedalam air mendidih tepat 20 menit diangkat dan masukan
kedalam air dingin
3. Tambahkan 1 ml reagen warna Arsenmonolibdat. Aduk baik-baik
sampai merata
4. Tambahkan lagi 7 ml H2O aduk dengan baik
5. Baca absorbennya dengan menggunakan alat spektrofotometer dengan
panjang gelombang 660 nm
6. Penentuan blanko,sampel,dan standar dilakukan serempak masing-
masing berisi 0,02 , 0,03 dan 0,05 mg Glukosa per ml
Kurva Kalibrasi Glukosa Darah

Penuntun Praktikum Biokimia 19

(A)

( Konsentrasi ) mg per mL

Penuntun Praktikum Biokimia 20

 PERCOBAAN V
ISOLASI ASAM LEMAK DAN PENETAPAN ANGKA PENYABUNAN

1. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk mengisolasi asam emak dari berbagai
jenis sabun dan menentukan besar angka penyabunan dalam lemak minyak.

2. Dasar teori.
Asam lemak yang ditemukan di alam biasanya merupakan asam – asam
monokarboksilat dengan rantai yang tidak bercabang dan mempunyai jumlah
atom karbon genap. Asam –asam lemak yang ditemukan dialam dapat dibagi
menjadi dua golongan yaitu asam lemak jenuh dan asam lemak tak jenuh.
Asam lemak mempunyai jumlah atom C genap dari C2 sampai C10 dan dalam
bentuk bebas atau ester dengan gliserol. Asam lemak dengan atom C lebih dari
12 tidak larut dalam air dingin maupun air panas.
Garam dari asam lemak berantai panjang disebut sabun. sabun dapat
dihidrolisis oleh asam, dan melepaskan kembali asam lemaknya.

CH3(CH2)16COONA + HCL CH3(CH2)16COOH + NaCl

natrium stearat asam stearat

Analisis lipid memerlukan suatu prooses hidrolisa, isolasi dan

karakterisasi hasil – hasilnya. Penyabunana adalah hidrolisa lipid sederhana
dengan menggunakan alkali panas. Karena umumnya lipida tidak larut dalam
air, maka hidrolisa belangsung lambat. Ini bisa dipercepat dengan pelarut
organik yang sesuai seperti etanol. reaksi penyabunan adalah sebagai berikut:

Penuntun Praktikum Biokimia 21

 H2COCOR H2COH

HCOCOR + 3 KOH 3RCOOK + HCOH

H2COCOR H2COH
lemak/minyak akali sabun gliserol
Dari reaksi diatas dapat dilihat 1 mol alkali diperlukan untuk setiap
mol ester yang dihasilkan pada reaksi penyabunan. Jumlah alkali yang
diperlukan untuk menghidrolisis sempurna suatu lipida tergantung dari
jumlah ikatan ester yang terkandung dalam lipida tersebut.
Angka penyabunan didefenisikan sebagai mg KOH yang diperlukan
untuk menyabunkan 1 gram lemak/minyak. bilangan ini juga menyatakan
indeks berat molekul suatu minyak. jika asam lemak yang terdapat dalam
minyak mempunyai berat molekul yang rendah ( rantai pendek ) maka
jumlah gliseridanya semakin banyak. hal ini menyebabkan bilangan
penyabunan meningkat. hasil reaksi berupa campuran sabun dan gliserol,
mudah larut dalam air dan alkohol.

3. Bahan Dan Alat

a. Isolasi Asam Lemak
- gelas piala 500 mL , 100 - sabun ( bukan deterjen )
mL
- kertas lakmus / indicator - HCl pekat
- kompor / pemanas
b. Penetapa Angka Penyabunan
- lemak / minyak - penangas uap
- KOH Alkoholis 5,6% - pipet gondok
- HCl 0,5 N ( harus - buret lengkap
distandarisasi )

Penuntun Praktikum Biokimia 22

 - PP ( Fenolftalein ) 1% - timbangan
- Alat refluks - Erlenmeyer 250 mL

4. Cara Kerja
a. Isolasi Asam Lemak
1. Siapkan 20 mL berbagai larutan sabun ( bukan deterjen ) lakukan
sejenuh mungkin dalam gelas kimia 500 mL
2. Tambahkan HCl pekat sambil diaduk hingga larutan bersifat asam (
ph < 6 ). asam lemak akan terpisah kepermukaan.
3. Panaskan sampai timbul zat seperti minyak pada permukaan.
buang airnya sebagian .
4. Segera dinginkan dalam air, lapisan air asam lemak akan
menggumpal, pindahkan kedalam gelas kimia 100 mL yang berisi
air
5. Ulangi pemanasan dan pemisahan lapisan minyak seperti diatas,
akan menghasilkan asam lemak murni.
6. Keringkan asam lemak yang diperoleh diatas kertas saring dan
timbang beratnya
7. Usahakan untuk mendapatkan asam lemak, paling sedikitnya dari
dua macam sabun .
b. Penetapan Angka Penyabunan
1. Timbang 2,5 gram lemak/minyak dalam elenmeyer 250 mL
2. Tambahkan 50 mL KOH Alkoholis refluks selama 30 menit diatas
penangas uap ( jangan sekali kali menggunakan api bekas ) sampai
penyabunan sempurna
3. Ujilah penyabunan sempurna sebagai berikut :
Teteskan hasil refluks kedalam tabung berisi air, bila campuran ini
bening berarti hanya 1 fasa, maka penyabunan yang dilakukan tadi
sudah sempurna.
4. Buat blangko sebagai berikut :

Penuntun Praktikum Biokimia 23

 Refliks 25 mL KOH Alkoholis seperti cara diatas ( tapi tidak
ditambah lemak/minyak ), kemudian dinginkan
5. Ambil 5 mL dengan pipet gondok, titrasi dengan HCl 0,5 N dengan
menggunakan 3 tetes pp sebagai indikator
6. Lakukan percobaan diatas sebanyak 2 kali
7. Hitunglah angka penyabunan lemak/minyak tersebut dengan rumus

( b−c )X N HCl X BM KOH

𝑏𝑖𝑙. 𝑃𝑒𝑛𝑦𝑎𝑏𝑢𝑛𝑎𝑛 =
Berat cuplikan

b = ml hcl untuk menitrasi blangko

c = ml hcl untuk menitrasi cuplikan

5. Lembar Pengamatan

A. Isolasi Asam Lemak

No Langkah Kerja Pengamatan

Dst

Penuntun Praktikum Biokimia 24

 B. Penetapan Angka Penyabunan

Volume (mL) Volume HCl 0,5 terpakai Bilangan Penyabunan

untuk titrasi

Balanko 1.

2.

Blanko 1.

2.

6. Pertanyaan/Tugas

1. Terangkan tentang
a. Bilangan iodine
b. Bilangan asam
c. Bilangan peroksida
2. Jelaskan sifat sifat sisika dan kimia lipida!
3. Apa yang dimaksud denagn lipida tak tersabunkan ?
4. Carilah data tentang angka penyabuann beberaoa lemak dan minyak.
bandingkan hasilnya !

Penuntun Praktikum Biokimia 25

 PERCOBAAN VI

PENETUAN KADAR PROTEIN SECARA BIURET

1. Tujuan Percobaan
Untuk menentukan kadar protein metode biuret

2. Dasar Teori
Protein mengandung gugus CO (karboksilat) dan –NH ( amina) pada
rantai peptidanya. Dalam suasna basa gugus ini dapat membentuk kompleks
ion Cu²⁺dan memberikan warna violet. Intensitas warna larutan sesuai dengan
kadar protein yang membentuk kompleks.
Untuk menentukan kadar protein secara kuantitatif dilakukan dengan
pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang berwarna ungu
(violet)tersebut, hal ini dapat dibenarkan karena menurut hukum Lambeert-
Beer bahwa
A-ε.b.C
Dimana A= absorban( serapan cahaya ), ε=ekstinsi mola larutan ,
b=tebal kuvet ,C=konsentrasi
Menunjukkan serapan cahaya berbanding lurus dengan konsentrasi.
Pembentukan kompleks protein ini dapat dilakukan dengan dua metode
yaitu metode Biuret dan metode Lowry. Pada metode Biuret dikomplekskan
dengan Cu²⁺ alkalis saja, sedangkan metode Lowry, setelah terbentuk
kompleks seperti pada metode Biuret dilanjutkan dengan penambahan reagen
fosfomolibdat untuk memperkuat intensitas. Oleh karena itu metode Lowry
masih baik digunakan untuk menentukan kadar protein antara 5 sampai 100µg
per mL larutan.

Pada metode ini kadar ditentuan dengan cara bantuan kurva standar.
Kurva standar untuk masing-masing dibuat dengan menggunakan protein
murni.

Penuntun Praktikum Biokimia 26

3. Bahan dan Alat
- Reagen Biuret
Larutan 1,5 gram CuSO45H2O dan 6 gram natrium kalium tratat
(NaKC4O64H2O)ke dalam kira-kira 500 ml air dilabu takar 1000 ml.
Kemudian tambahkan 300 ml NaOH 10 % sambil dikocok –kocok.
Tahbahkan air sampai volume 1000ml.
- Larutan standar protein
Larutan serum albumin murni atau putih telur dalam air yang berkadar
10 mg per ml untuk memudahkan larutannya, tambahkan larutan
NaOH 3%
- Tabung reaksi 10 buah -labu ukur 10 ml ,100ml
- Pipet tetes - kertas label
- Spektronik 20 dan kuvet - pitih telur

4. Cara kerja
1. Pembuatan larutan standar
- Sediakan 5 tabung reaksi yang bersih kemudian 1 ml larutan protein
standar dengan kadar 1,2,3,5,7,mg per ml protein
- Tambahkan 4 ml reagen biuret kedalam masing-masing tabung
sambil dikocok
- Diamkan selama 30 menit pada suhu kamar
2. Pembuatan larutan blanko
- ambil 1 tabung reaksi yang bersih tambahkn 1 mL aquades,
tambahkan 40 mL reagen Biuret lalu kocok. Setelah otu diamkan
selama 30 menit.

3. Pembuatan sampel
- lakukan seperti pembuatan standar tetapi 1 ml protein standar diganti
dengan 1 mL sampel “unknown”

Penuntun Praktikum Biokimia 27

 - ukur absorban masig-masing larutan dalam tabung yang telah dibua
pada panjang gelombang maksimum yang telah diperolah pada
rentang 520 nm sampai 580 nm

5. Lembaran Pengamatan

Panjang Gelombang Absorben

520 nm
530 nm
540 nm
550 nm
560 nm
570 nm
580 nm
590 nm

Tabungke Konsentrasi ( mg/ ml ) ( X ) Absorben ( Y ) pada

1 Blanko : 0
2 1
3 2
4 3
5 5
6 7
7 Sampel 1
8 Sampel 2

6. Tugas
1. Buatlah kurva kalibrasi standar konsentrasi versus absorban dengan
mempergunakan persamaan regresi linear.

Penuntun Praktikum Biokimia 28

 1,4
4

(A )

0
1 2 3 4 5 6 7

( Konsentrasi ) mg/ ml

2. Dengan bantuan kurva standar diatas ditentukan kadar protein dalam

sampel ( X1dan X2 )

7 . Pertanyaan

a. Tuliskan reaksi pembentukan kompleks suatu protein dengan pereaksi

biuret!
b. Apa kegunaan dari larutan blanko ?Jelaskan !
c. Senyawa apa yang dapat mengganggu penetuan protein secara biuret ?

Penuntun Praktikum Biokimia 29

 PERCOBAAN VII

PRAKTIKUM MANDIRI

1. Pembuatan Tempe
2. PembuatanTapai ( UbidanBijiNangka )
3. PembuatanMinyakSecaraFermentasi

Penuntun Praktikum Biokimia 30

 DAFTAR PUSTAKA

Darwis,A. A, Sukara, E. 1990. Penuntun Praktikum Isolasi, PErifikasi dan

Karateristik Enzim. Bogor: Depdikbud, PAU Bioteknologi, IPB Bogor

Lehninger, A, L. 1998. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Erlangga : Jakarta

Maryami, T, Dasna, I. W, Rahayu, S. 1994. Buku Petunjuk Praktikum Biokimia

.Malang: Depdikbud, Jur. Kimia FMIPA IKIP Malang

Nur, M, A, dkk. 1983. Kimia Dasar II. Bagian Kimia. Bogor : IPB

Poedjiadi, A. 1994 . Dasar- Dasar Biokimia . Jakarta: UI Press

Purwo, Arbianto. 1996. Biokimia Konsep-Konsep Dasar. Bandung: Depdikbud

Soedigdo, P. 1980. Penuntun Praktikum Biokimia Dasar. Jurusan Kimia.

Bandung: ITB

Staff pengajar Biokimia Jurusan Kimia UNAND 1994. Penuntun Praktikum

Biokimia. FMIPA. Universitas Andalas

Staff pengajar Faperika UNRI 1992 . Penuntun Praktikum Biokimia. Faperika.

Universitas Riau. Pekanbaru

Winarno, F, G. 1986. Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia

Winarno, F, G. 1986. Enzim Pangandan Gizi. Jakarta: Gramedia

Wirahadikusuma, M. 1981. Biokimiaedisi 2. Jurusan Kimia, ITB, Bandung.

Penuntun Praktikum Biokimia 31