Mikrobiologi Dasar 2013 20

1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat –zat hara yang
berguna untuk membiakkan mikroba dengan menggunakan bermacam – macam
media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian, sifat fisiologis dan
perhitungan jumlah mikroba (Sutedjo et al, 1991)
Menurut Murachman et al,(1995), macam – macam media yaitu sebagai
berikut :
1. Media cair (liquid media) yaitu media yang berbentuk cair.
2. Media padat (solid media) yaitu media yang berbentuk padat. Media dapat
berupa bahan organik alamiah misalnya media wortel, media kentang atau
anorganik (silika gel).
3. Media padat yang dapat dicairkan (semi solid) yaitu media yang dalam
keadaan panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk
padat, misalnya mengandung agar atau gelatin.
Media biakan yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri terdapat dalam
bentuk padat,semi padat dan cair. Media padat diperoleh dengan menambahkan
agar. Agar berasal dari ganggang merah. Agar digunakan sebagai bahan
pemadat karena tidak diuraikan oleh mikroorganisme,dan membeku pada suhu
diatas 45ºC kandungan agar berbagai bahan pemadat dalam media adalah
1,5-2% (Lay,1994).
Media merupakan suatu tempat yang digunakan untuk perkembangbiakan
mikroorganisme.Media dapat dibagi menjadi 3 yaitu media padat,media semi
padat dan media cair.Media harus berisi zat hara yang penting untuk
pertumbuhan mikroorganisme.

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 21

1.2 Maksud dan Tujuan

Maksud dari Praktikum Mikrobiologi Dasar materi Pembuatan Media,
Pengenceran dan Penanaman adalah agar praktikan dapat mengetahui dan
memahami cara pembuatan media, pengenceran dan penanaman bakteri dan
jamur.
Tujuan dari praktikum Mikrobiologi Dasar materi Pembuatan Media,
Pengenceran dan Penanaman adalah untuk mengetahui dan memahami cara
pembuatan media, pengenceran dan penanaman bakteri dan jamur.

1.3 Waktu dan Tempat

Praktikum Mikrobiologi Dasar materi materi Pembuatan Media,
Pengenceran dan Penanaman dilaksanakan pada hari Selasa, tanggal 26 Maret
2013 pukul 15.00 WIB – 18.00 WIB di Laboratorium Mikrobilogi, Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya Malang.

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 22

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian dan Fungsi Media

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat –zat hara
(nutrien) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan
bermacam – macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat
– sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Sutedjo, et al., 1991)
Menurut Hadioetomo (1985), medium ialah bahan yang digunakan untuk
menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya. Untuk dapat
menumbuhkan mikroorganisme dengan sebaik –sebaiknya. Pertama – pertama
harus dapat memahami kebutuhan dasarnya, Lalu mencoba memformulakan
meskipun persyaratan nutrien mikroorganisme amat beragam, namun sebagai
makhluk hidup, mereka mempunyai kebutuhan dasar yang sama yaitu meliputi
air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh.
Menurut Suriawiria (1995), untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroba diperlukan suatu substrat yang disebut media. Sedang media itu sendiri
sebelum dipergunakan harus dalam keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh
mikroba lain yang tidak diharapkan.

2.2 Macam – Macam Media

Menurut Sutedjoet al., (1991), media dapat digolongkan berdasarkan atas
susunan, sifat wujudnya dan fungsinya. Penggolongan media berdasarkan
susunan kimia :
1. Media Anorganik, yaitu media yang tersusun dari bahan – bahan
anorganik.
2. Media Organik, yaitu media yang susunannya terdiri dari bahan - bahan
organik.
3. Media Sintetik, yaitu media yang susunannyan kimianya diketahui dengan
pasti, umumnya digunakan untuk mempelajari makanan suatu mikroba.
4. Media Non Sintetik, yaitu media yang susunan kimianya tidak diketahui
dengan pasti, umumnya digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari
taksonomi mikroba.

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 23

Penggolongan media berdasarkan sifat wujudnya :.

1. Media cair, yaitu media yang berbentuk cair.
2. Media padat, yaitu media yang berbentuk padat, dapat berupa bahan
organik alamiah atau dapat juga berupa bahan anorganik.
3. Media padat yang dicairkan (semikoloid).
Menurut Suriawira (1995), macam bentuk media dibedakan menjadi 3
yaitu :
1. Media padat, umumnya dipergunakan untuk bakteri, ragi, jamur, dan
kadang – kadang juga mikroba.
2. Media air, dipergunakan untuk pembiakan mikroalga tetapi juga mikroba
lain terutama bakteri dan ragi.
3. Media semi padat dan semi cair, umunya digunakan untuk pertumbuhan
mikroba yang memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik atau
fermentatif.

2.3 Media NA, PDA dan TCBS beserta komposisinya

Menurut Murachman et al., (1991), pembuatan medium potato dektrosa
agar (PDA) kentang sudah ditimbang dan direbus dengan ukuran kentang 50,31
gram dan agar 40,3 gram. Disini digunakan agar untuk mengentalkan medium.
Media PDA (Potato Dekstro Agar) diperoleh dari laboratorium kesehatan
medan sebanyak 39 gram. Media PDA selanjutnya ditambahkan dengan 500 ml
aquadest. Kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf bersama dengan alat – alat
yang akan digunakan dalam penanaman kapang dengan temperatur 1210 C
selama 15 menit. Didinginkan hingga suhu 400 C - 500 C. Setelah itu media
dituangkan ke dalam masing – masing cawan sebanyak 20 ml (Restuati,2008).
Menurut Dwijoseputro (1978), NA, PDA, TCBS beserta komposisinya
adalah sebagai berikut:
a. NA : digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri, komposisinya
terdiri dari ekstrak beef segar, pepton 3 gram, NaCl 2,5 gram dan aquades
1L
b. PDA : digunakan sebagai media penanaman bakteri dan jamur,
komposisinya adalah agar 5 gram, ekstrak yeast 2,5 gram, pepton 5 gram,
dan glukosa 1 gram

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 24

c. TCBS: digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri yang dikehendaki,

komposisinya adalah agar, tiosulfat, sitrat, bile, garam dan sukrosa

2.4 Pembuatan Media NA dan PDA

Media PDA steril yang telah dicairkan dan didinginkan pada temperatur 400
C ditambahkan kloramfenitol 1ml/L dan dituang ke dalam piring petri hingga
membeku sebanyak 1 ml suspensi hasil pengenceran sampel dituang pada
permukaan media PDA yang telah beku dalam piring petri yang mengandung
kloramfenitol dan diratakan spreaser glass (Pratiwi,2005).
Menurut Amelia,et al., (2005), pembuatan median NA (Nutrient Agar)
adalah dengan melarutkan 25 gram agar batang yang sudah dipotong kecil –
kecil dalam 1000 mL aquades di dalam microwave untuk mempermudah larutnya
agar. Lalu disaring dengan menggunakan kain kassa agar kotorannya terbuang,
selanjutnya ke dalam larutan tersebut ditambahkan 3 gram ekstrak yeast dan 5
gram bacto pepton, diaduk sampai rata. Kemudian media ini disterilkan dalam
otoklaf.Setelah agak dingin, media dituang ke dalam cawan petri yang sudah
disterilisasi kira – kira 20 mL.setelah dingin dan beku cawan yang telah diisi
media disimpan di dalam plastic dengan posisi terbalik.
Menurut Stanieret al., (1984), pembuatan TCBS dimulai dengan
menimbang Tiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose Agar (TCBS) sebanyak yang
dibutuhkan dan dimasukkan Erlenmeyer. Diukur aquades sebanyak yang
diperlukan diaduk dengan spatula agar homogen.Lalu lubang Erlenmeyer ditutup
dengan kapas, dibungkus Koran dan kemudian diikat tali.Rebus selama 15 menit
dan tunggu sampai hangat.Dan kemudian baru digunakan untuk penanaman
bakteri vibrio.

2.5 Pengertian dan Tujuan Pengenceran

Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000
dan seterusnya. Pengenceran memudahkan dalam perhitungan koloni,
sedangkan pengenceran yang bukan desimal, misal 1:5, 1:25 dan seterusnya
jarang dilakukan karena tidak praktis dalam perhitungan (Fardiaz, 1993).
Media PDA perlu dilakukan pengenceran terlebih dahulu dari agar miring
ke dalam air steril, yaitu sebanyak 2 kali pengenceran.Hal ini dilakukan dengan

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 25

dipindahkan satu fase biakan dari agar miring ke dalam air steril lainnya
sebanyak 1 ml divortex lagi (Amelia,2005).

2.6 Macam Metode Penanaman beserta Kelebihan dan Kekurangannya

Menurut Hadioetomo (1990), macam penanaman beserta kelebihan dan
kekurangannya adalah sebagai berikut :
1. Metode Cawan Gores
Kelebihan dari metode cawan gores adalah :
a. Hanya spesies tertentu yang dapat tumbuh pada media sehingga
memudahkan piaraan bakteri murni.
b. Pengamatan morfologi koloni lebih baik.
Kekurangan dari metode cawan gores adalah :
a. Bentuk koloni sulit diamati karena adanya permukaan yang sempit,
terutama pada bagian atas.
b. Bakteri anaerob tidak dapat tumbuh.

2. Metode Cawan Tuang

Kelebihan dari metode cawan tuang adalah :
a. Kemungkinan terjadinya kontaminasi kecil.
b. Bakteri anaerob dapat tumbuh.
c. Dapat mengamati bentuk koloni yang ada pada bagian atas.
Kekurangan dari metode cawan tuang adalah :
a. Koloni dan beberapa spesies tidak dapat memberikan penangkap yang
sama.
b. Sulit memindahkan koloni apabila ingin dipelajari lebih lanjut.
c. Memboroskan bahan dan waktu tidak memerlukan keterampilan yang
terlampau tinggi.
Menurut Lay (1994), cara mendapatkan biakan murni yaitu:
1. Teknik penggoresan agar, kelebihan dari teknik pengembangbiakan ini
adalah memerlukan biaya yang lebih murah dan tidak memakan waktu
yang lama, namun memerlukan memerlukan keterampilan peneliti karena
pada prinsipnya menggores media pada cawan petri , apabila penggoresan
tidak sempurna akan menumbuhkan koloni yang terpisah

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 26

2. Teknik agar tuang, kelebihan dari teknik ini adalah tidak memerlukan
keterampilan khusus, sedangkan kekurangannya adalah boros bahan dan
waktu
3. Teknik agar sebar, kelebihan dari teknik ini adalah lebih mudah ditangkap
koloninya dan butuh keterampilan
4. Teknik pemindahan biakan

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 27

3. METODOLOGI

3.1 Alat dan Fungsi

Pada praktikum Mikrobiologi Dasar mengenai Pembuatan Media,
Pengenceran dan Penanaman, alat-alat yang digunakan antara lain:
- Kompor : sebagai sumber panas
- Panci : tempat perebusan
- Timbangan : untuk mengukur massa bahan/sampel
- Tabung reaksi : untuk mereaksikan zat dalam jumlah kecil
- Autoklaf : untuk alat sterilisasi basah
- Cawan petri : tempat media biakan
- Erlenmeyer : tempat pembuatan media NA dan PDA
- Rak tabung reaksi : tempat meletakkan tabung reaksi
- Bunsen : tempat meletakkan tabung reaksi
- Gelas ukur : untuk mengukur volume aquades
- Pipet volume : untuk mengambil larutan dengan volume 1-10 ml
- Pipet serologis : untuk mengambil larutan dengan volume 0,1-1 ml
- Etalase bakteri : untuk inkubasi pada suhu kamar (250-270 C)
- Timbangan digital : untuk mengukur massa bahan dengan ketelitian
0,01 gram.

3.2 Bahan dan Fungsi

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum Mikrobiologi Dasar
mengenai Pembuatan Media, Pengenceran, dan Penanaman antara lain:
- Daging sapi 0,5 kg : bahan pembuatan media kaldu
- Air destilata 250 ml: untuk merendam daging
- Kain blancu : untuk menyaring endapan lemak
- Pepton 5 gr : sebagai nutrisi dalam media
- Agar 7,5 gr : bahan media biakan
- PDA : bahan pembuatan media PDA
- NA : bahan pembuatan media NA
- Aquades : sebagai pelarut
- Sampel ikan asin : bahan yang dibuat sampel jamur
- Sampel ikan nila : sebagai bahan yang dibuat sampel bakteri

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 28

- Tali : untuk mengikat cawan petri dan pipet serologis

dalam koran
- Kapas : untuk menyumbat ujung pipet serologis
- Kertas Koran : untuk membungkus cawan petri dan pipet
serologis saat sterilisasi basah
- Kertas label : untuk menandai

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 29

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Pembuatan Media Kaldu

Daging sapi

Dibuang lemak

Dipotong kecil-kecil

direndam aquadest 250 ml

Disimpan dalam kulkas 24 jam

Dibuang lemak mengapung

Disaring dengan kain blancu

ditambah aquadest s/d 250 mL

ditambah pepton 1,25 gr

Dtambah agar 1,87 gram

Direbus 15 menit

Disterilisasi

Hasil
Gambar 2. Skema Kerja Pembuatan Media Kaldu

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 30

3.3.2 Pembuatan Media NA

NA

ditimbang sebanyak 4,6 gr

dimasukkan erlenmenyer
250ml

dihomogenkan

ditutup kapas

Dibungkus dengan koran

Diikat dengan tali

Direbus dalam panci ± 20 menit

disterilisasikan dalam autoklaf

Hasil

Gambar 3. Skema Kerja Pembuatan Media NA

Rumus : 20
NA = x ∑Cawan Petri x 20 ml
1000

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 31

3.3.3 Pembuatan Media PDA

PDA

ditimbang sebanyak 3,12 gr

dimasukkan erlenmenyer
250ml

ditambah aquadest sebanyak 80 mL

dihomogenkan

ditutup kapas

dibungkus koran

diikat tali

direbus dengan menggunakan panci 15 menit

disterilisasi menggunakan autoklaf

PDA steril

Hasil

Gambar 4. Skema Kerja Pembuatan Media PDA

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 32

3.3.4 Pembuatan Media NaFis

NaCl

ditimbang NaCl sebanyak 0,72 gram

ditambah aquadest 80 ml

dihomogenkan

Didapat Nafis 0,9%

Diambil Nafis @ 9 mL

Dimasukkan dalam tabung reaksi

Ditutup kapas

Dibungkus koran

disterilisasi

Hasil

Gambar 5. Skema Kerja Pembuatan Media NaFis

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 33

3.3.5 Penanaman Bakteri

Cawan Petri

Dimasukkan dalam sampel 1 ml

Dimasukkan media NA sebanyak 15-20 ml

Didinginkan sampai beku, lalu cawan petri dibalik

Dibungkus koran dan diikat tali

Diinkubasi di dalam etalase bakteri selama 24 jam

Hasil

Gambar 6. Skema Kerja Penanaman Bakteri

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 34

3.3.6 Pengenceran

Sampel Ikan

Ditimbang 1 gram

Dimasukkan dalam tabung reaksi yang sudah berisi

Nafis dan diberi nama 10-1

Diambil 1 ml dari tabung reaksi 10-1

Dimasukkan kedalam tabung reaksi 10-2

Dilakukan hal yang sama sampai 10-5

Hasil

Sampel Jamur

Ditimbang 1 gram

Dimasukkan dalam tabung reaksi yang sudah berisi

Nafis dan diberi nama 10-1

Diambil 1 ml dari tabung reaksi 10-1 dimasukkan kedalam

tabung reaksi 10-2

Dilakukan hal yang sama samapai 10-3

Hasil

Gambar 7. Skema Kerja Pengenceran

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 35

3.3.7 Penanaman
a. Metode Tuang

Sampel

Diambil 1 ml

Dimasukkan dalam cawan petri

Dimasukkan media

Digoyang cawan petri membentuk angka 8

Dilakukan hal yang sama sampai 10-5

Hasil

b. Metode Sebar

Sampel Ikan

Ditimbang 1 gram

Dimasukkan dalam tabung reaksi yang sudah berisi

Nafis dan diberi nama 10-1

Diambil 1 ml dari tabung reaksi 10-1

Dimasukkan kedalam tabung reaksi 10-2

Dilakukan hal yang sama sampai 10-5

Hasil
Gambar 8. Skema Kerja Penanaman

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 36

4. PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Pada pratikum Mikrobiologi Dasar materi Pembuatan Media, Pengenceran
dan Penanaman. Langkah pertama yang dilakukan adalah disiapkan alat dan
bahan . Alat-alat yang digunakan adalah kompor sebagai sumber panas, panci
sebagai tempat daging, tabung reaksi tempat mereaksikan larutan, autoklaf
sebagai sterilisasi basah, cawan petri untuk tempat melakukan penanaman,
erlenmeyer untuk tempat menghomogenkan larutan, rak tabung reaksi sebagai
tempat tabung reaksi, bunsen untuk pengkondisian aseptis, gelas ukur untuk
mengukur volume larutan, pipet volume untukmemindahkan larutan dalam skala
1-10 ml, pipet serologis untuk memindahkan larutan dengan ukuran 0,1- 1ml,
etalase bakteri untuki menginkubasi media pada suhu kamar, timbangan digital
untuk menimbang massa/berat dengan ketelitian 10−2.Alu dan mortar untuk
membantu menghaluskan sampel daging.
Bahan-bahan yang digunakan adalah daging 125 gram sebagai media
kaldu, air destilasi untuk campuran atau pelarut dalam pembuatan media, kain
blancu untuk menyaring lemak, pepton 1,25 gr sebagai bahan pembuatan media
kaldu, agar 1,87 gr sebagai bahan pengental pada pembuatan media kaldu, PDA
sebagai media pertumbuhan jamur, NA sebagai media pertumbuhan bakteri,
aquadest untuk melarutkan sampel, tali untuk mengikat bungkusan koran, kapas
untuk mengatur laju larutan, koran untuk membungkus cawan petri, dan kertas
label untuk memberi tanda.

4.1.1 Pembuatan Media Kaldu

Pertama yang harus dilakukan dalam pembuatan media kaldu adalah
daging ditimbang seberat 125 gram kemudian dicuci dengan air dan dibuang
lemaknya,dipotong kecil-kecil menggunakan pisau tujuannya adalah agar daging
mudah hancur pada saat disterilisasi.Lalu diberi aquades 250ml dan dimasukkan
kedalam beaker glass.Disimpan 24 jam dalam kulkas.Tujuannya agar tidak
terkontaminasi dengan bakteri dan supaya kaldu cepat terbentuk.Setelah itu
ditambah aquades hingga volume 1000ml lalu ditambahkan pepton sebanyak
1,875 gram untuk mengentalkan media.Kaldu direbus dalam panci selama 15-20
menit.Hal ini bertujuan agar media kaldu lebih homogen sehingga didapat media

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 37

kaldu yang diinginkan.Selain itu supaya mikroba-mikroba yang terdapat dalam

kaldu cepat mati.Kemudian dimasukkan dalam autoclaf untuk distrerilisasi pada
suhu 121º dan tekanan 1 atm selama 20 menit.Hal ini bertujuan agar mematikan
semua mikroba.Kemudian kaldu didinginkan pada waterbath dan didapatkan
hasil.

4.1.2 Pembuatan Media NA

Pertama ambil NA sebanyak yang dibutuhkan.Kemudian ditimbang
sebayak 3,6 gram kemudian NA dimasukkan kedalam erlenmeyer.Ditambahkan
aquades sebanyak 180 ml.Lalu homogenkan NA dan aquades dengan spatula
agar larutan menyatu.Lalu mulut erlenmeyer ditutup dengan menguunakan
kapas agar tidak terjadi kontaminasi dengan lingkungan luar.Setelah itu
dibungkus dengan koran agar dapat menyerap air.Kemudian diikat dengan tali
supaya tidak mudah lepas saat perebusan.Lalu direbus dalam panci selama 15-
20 menit.Hal ini bertujuan agar larutan tersebut menjadi homogen.Kemudian
distrerilisasi dengan autoclaf pada suhu 121º dan tekanan 1 atm selama 15-20
menit dan didapatkan NA steril.
20
gramNA = x ∑ cawan x 20 mL.
1000

4.1.3 Pembuatan Media PDA (Potatoes Dextrose Agar)

Pertama ambil PDA yang didbutuhkan, kemudian ditimbang sebanyak 3,2
gram kemudian PDA dimasukkan kedalam erlenmayer. Ditambahkan aquades
80 ml, tetapi dalam penuangannya masukkan aquades 40 ml lalu tambahkan 40
ml sisanya . Hal ini dilakukan agar bubuk PDA tidak merusak erlenmayer.
Homogenkan PDA dan aquades dengan spatula. Lalu tutup mulut erlenmayer
dengan menggunakan kapas agar tidak terkontaminasi. Kemudian diikat dengan
tali agar tidak mudah lepas saat perebusan maupun saat sterilisasi. Kemudian
direbus didalam panci selama 15 menit. Hal ini bertujuan agar larutan tersebut
menjadi lebih homogen. Setelah itu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121º
dan tekanan 1 atm selama 15-20 menit. Dan didapat PDA yang steril.
39
gram PDA = x ∑ cawan x 20 mL.
1000

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 38

4.1.4 Pembuatan Na Fis (Natrium Fisiologis)

Pertama ambil NaCl sebanyak yang dibutuhkan kemudian ditimbang
sebanyak 0,45 gram kemudian NaFis dimasukkan kedalam beaker glass 250 ml
ditambahkan aquades sebanyak 80 ml.Aquades dalam penuangannya
dimasukkan ke dalam beaker glass dan dihomogenkan dengan
spatula.Kemudian masukkan 9ml kedalam tabung reaksi , lalu ditutup dengan
kapas agar tidak terkontaminasi.Setelah itu dibungkus dengan koran dan diikat
dengan tali.Selanjutnya distrerilisasi dengan autoclaf pada suhu 121º dan
tekanan 1 atm selama 15-20 menit untuk membunuh mikroba patogen lalu
dihasilkan NaFis steril.
Rumus yang digunakan untuk mendapatkan NaFis yaitu :
0,9
NaFis = x ∑ tabung reaksi x 10 mL.
100

4.1.5 Pengenceran
Dalam praktikum media pengenceran yang dilakukan adalah pengenceran
bertingkat.Tujuan pengenceran bertingkat adalah memperkecil atau mengurangi
kepadatan mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Pengenceran untuk media
pertumbuhan bakteri pada NA akan membutuhkan 5 tabung reaksi dan 9 cawan
petri.Karena pengenceran dilakukan ditabung 10-1 sampai 10-5, sedangkan
penanaman dilakukan dari tabung 10-3 sampai 10-5. Karena pada tabung reaksi
tersebut kepadatan bakteri akan makin berkurang dan penanamannya secara
duplo.
Hal pertama yang harus dilakukan adalah menyemprot tangan dan meja
dengan alkohol 70% untuk pengondisian aseptis. Selanjutnya dari tabung
pertama atau 10-1 diambil sebanyak 1 ml menggunakan pipet serologis dan
dituangkan pada tabung reaksi 10-2 yang sudah berisi NaFis. Lakukan hal yang
sama hingga pengeceran 10-5 menggunakan pipet serologis yang berbeda agar
tidak terjadi kontaminasi. Untuk penanaman dimulai dari pengenceran 10-3
sampai 10-5 secara duplo. Ke enam cawan petri diletakkan dekat bunsen untuk
pengkondisian aseptis dan diberi label 10-3 A ,10-3 B, 10-4 A, 10-4B, 10-5 A dan 10-
5
B. Serta tiga cawan petri sisanya untuk media Na steril.Dalam penanaman
media NA digunakan metode tuang. Untuk tabung reaksi 10-3 diambil sampel 1
ml masing-masing untuk 10-3 A dan 10-3 B dengan menggunakan pipet serologis
bekas pengenceran pada tabung reaksi 10-3. Lakukan hal yang sama hinga 10-5.
Setelah sampel dimasukkan ke cawan petri kemudian masukkan media NA.

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 39

Menggunakan metode duplo agar apabila terjadi keasalahan atau kegagalan

pada penanama masih ada cadangan yang tersedia. Setelah media NA masuk,
buka cawan petri sedikit untuk mengeluarkan uap air. Setelah media dingin,
cawan petri dibalik. Hal ini bertujuan agar uap air tidak menetes pada media.

4.1.6 Penanaman Bakteri

Untuk penanaman bakteri, metode yang digunakan dalam praktikum ini
adalaa metode tuang.Pertama-tama disiapkan cawan petri steril.Kemudian
dimasukkan sampel sebanyak 1mL dari tabung reaksi, setelah itu dimasukkan
media Na sebanyak 15-20 mL.Lalu NA yang ada dicawan petri digoyang
membentuk angka 8 untuk meratakan dan memadatjan, lalu didinginkan sampai
media NA menjadi padat.Kemudian cawan petri dibalik agar uap air tidak
mengenai media yang dapat menyebabkan spreader.Penanaman dilakukan
secara duplo (dua kali). Untuk sampel bakteri dari tabung reaksi ke-3
dimasukkan ke dalam dua buah cawan petri yang telah disiapkan dengan pipet
serologis dan cawan petri kemudian ditandai sebagai 10-3 A dan 10-3 B, sampel
bakteri dari tabung reaksi ke-4 dimasukkan ke dalam dua buah cawan petri yang
telah disiapkan dengan pipet serologis dan cawan petri kemudian ditandai
sebagai 10-4 A dan 10-4 B, begitu seterusnya sampai tabung reaksi ke-5.Setelah
itu cawan petri dibungkus koran dan diikat tali agar kertas koran tidak
terlepas.Kemudian diinkubasi di dalam etalase bakteriselama 2 malam.
Tujuannya untuk menghindari tumbuhnya mikroba yang tidak diinginkan, lalu
akan didapatkan hasilnya.

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 40

4.1.7 Penanaman Jamur

Dalam praktikum penanaman jamur pada media PDA membutuhkan 3
tabung reaksi dan 4 cawan petri. Sedangkan penanaman dilakukan dari 10-2
sampai 10-3 karena pengeceran hanya dilakukan dari 10-1 sampai 10-3.
Hal pertama yang dilakukan adalah meja dan tangan disemprot alkohol
70% untuk pengkodisian aseptis. Selanjutnya tabung reaksi yang berisi sampel
diambil sebanyak 1 ml menggunakan pipet seorlogis dan dituang pad tabung
reaksi 10-2 yang sudah berisi NaFis, lakukan yang sama hingga pengenceran
10-3. Untuk penanaman dimulai dari pengenceran 10-2 dan 10-3 secara duplo.
Ke empat cawan petri diletakkan dekat bunsen, hal ini bertujuan untuk
pengkondisian aseptis. Setelah itu PDA diambil dan dimasukkan sebanyak 20 ml
untuk masing-masing cawan petri yang telah di beri label 10-2 A , 10-2 B 10-3 A
dan 10-3 B. Ratakan seluruh bagian cawan petri. Tunggu hingga padat. Setelah
padat, ambil 0,1 ml dari masing-masing tabung reaksi dan masukkan ke dalam
cawan petri sesuai label. Ratakan dengan Triangle. Setelah rata, buka tutup
cawan petri sedikit agar uap air keluar lalu balik cawan petri. Hal ini bertujuan
agar uap air tidak menetesi pada media PDA.

4.2 Analisa Hasil

Pada pratikum mikrobiologi dasar materi pembuatan media, pengenceran

dan penanaman bakteri menggunakan media NA dan PDA. Komposisi NA
(Nutrien Agar) terdiri dari pepton 5 gram sebagai sumber energy. Agar 12 gram
untuk mengentalkan. Ekstract beef atau ekstract daging 3 gram sebagai sumber
protein dan energi. Sedangkan komposisi dari PDA (Potato Dextrose Agar) terdiri
dari potato extract sebanyak 4 gram sebagai sumber karbohidrat dan protein.
Glukosa 20 gram sebagai sumber energy serta agar 15 gram sebagai pengental.

Menurut Fardiaz (1993),NA adalah suatu medium yang mengandung

sumber nitrogen dalam jumlah yang cukup yaitu 0,3% ekstrak sapi, dan 0,5 %
pepton tetapi tidak mengandung sumber karbohidrat. Oleh karena itu baik untuk
pertumbuhan bakteri, tetapi kapang dan khamir tidak dapat tumbuh dengan baik.
Sementara itu,PDA adalah suatu medium yang mengandung sumber karbohidrat
dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20 % ekstract kentang dan 2 %
glukosa,sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan jamur.

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 41

Berikut adalah hasil visualisasi media NA,PDA dan media kaldu setelah
dan sebelum disterilisasi:

Tabel 4. Media sebelum di sterilisasi dan setelah distrelisasi

Media Sebelum Sterilisasi Setelah Sterilisasi

NA Agak keruh,warna kuning, Kuning,substrat megental dan
terdapat substrat dibawah bercampur serta tidak ada
dan menggumpal. endapan kuning, bening, agak
mengental.
PDA
Sedikit keruh dan warnanya Kuning,bening, agak mengental.
Media kuning muda.
Kaldu Merah, cerah, bening dan Warna putih kental dan tidak ada
tidak ada endapan. endapan.

Untuk tingkat kekeruhan pada pengenceran sampel bakteri sampai

pengenceran 10-5 didapatkan hasil bahwa semakin tinggi tingkat pengencerannya
maka akan semakin terlihat lebih bening. Seperti halnya pada tabung reaksi 10-1
tingkat kekeruhannya semakin tinggi dibandingkan dengan pengenceran pada
tabung reaksi 10-2,10-3,10-4 dan 10-5. Hal ini menandakan penyebaran jumlah
bakteri yang ada semakin berkurang. Sementara itu untuk tingkat kekeruhan
pada pengenceran sampel jamur sama halnya dengan pengenceran bakteri.
Semakin tinggi tingkat pengencerannya akan terlihat semakin bening.

Hasil penanaman secara umum dari sampel yang di tanam secara duplo
dari tiap tabung reaksi memiliki kepadatan yang berbeda. Sepertihalnya cawan
petri dari sampel tabung reaksi 10-3 jauh lebih padat dari tabung reaksi 10-
5
,dikarenakan semakin banyak dilakukan pengenceran maka penyebarannya
akan semakin sedikit. Dan juga didapatkan pertumbuhan 30-300 sehingga
dikatakan TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung) bahkan ada yang didapatkan
pertumbuhan bakteri yang melebihi ¼ volume dari cawan petri atau disebut
spreader. Hal ini disebabkan karena adanya kontaminasi dari luar seperti halnya

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 42

saat penanaman melakukan pembicaraan atau tetesan uap air, ataupun

kesalahan prosedur saat penanaman.

Hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz dalam Damongilala (2009),

prosedur pengenceran adalah sebagai berikut :

1. Disiapkan larutan pengencer 0,9% NaCl masing-masing untuk pengenceran

tingkat pertama 90 ml dan mulut Erlenmeyer ditutup alumunium
foil,sedangkan untuk tingkat pengenceran kedua dan ketiga masing-masing
diambil 9 ml NaCl untuk 0,9 % kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi
dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 0menit tekanan
15 psi.
2. Sampel di blender dan ditimbang 10 gram secara aseptis kemudian
dimasukkan kedalam 90 ml NaCl 0,9 % steril sehingga diperoleh larutan
dengan tingkat pengenceran 10-1. Dari pengenceran 10-1 di pipet 1 ml
kedalam tabung reaksi kedua kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh
pengenceran kedua.
3. Dari setiap pengenceran diambil 1 ml dipindahkan kecawan petri steril yang
telah diberi kode untuk tiap sampel pada tingkat pengenceran tertentu.
4. Kedalam semua cawan petri dituangkan secara aseptis . NA sebanyak 15-20
ml. Setelah penuangan, cawan petri digoyang perlahan sambil diputar tiga
kali kekiri dan kekanan, lalu kedepan, kebelakang, kiri, kemudian kanan.
Setelah itu di dinginkan sampai agar mengeras. Setelah NA dapat
dimasukkan kedalam incubator selama 24 jam pada suhu kamar (27,50-29,80
C).

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 43

5. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Pada praktikum Mikrobiologi Dasar mengenai pembuatan media,
pengenceran dan penanaman, diperoleh beberapa kesimpulan antara lain:
- Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrient, yang bertujuan
untuk membiakkan mikroba.
- Bakteri yang tumbuh pada media sangat tergantung pada komposisi nutrisi
dalam media itu sendiri.
- Komposisi Nutrient Agar (NA) antara lain ekstrak yeast 2 gram, pepton 5
gram, agar 10 gram, sodium chloride 5 gram, lab lemco powder 1 gram.
- Komposisi Potato Dextrose Agar antara lain agar 15,0 gram/liter, potato
extract 4,0 gram, glucose 20,0
- Pengenceran media bertujuan untuk mengurangi kepadatan bakteri yang
ditanam
- Metode penanaman bakteri terdiri dari metode tuang (pour plate) dan metode
tebar (spread plate).
- Metode yang penanaman digunakan dalam praktikum adalah metode gores
(zig-zag).
- Jumlah koloni bakteri yang paling banyak terdapat pada median dengan FP
10-3.
- NA (NUTRIEN AGAR) adalah padatan yang bermaksut membuat media jadi
padat, komposisi NA :
 Ekstrak daging sapi 3 gr
 Pepton 5 gr
 Agar 15 gr
 Air 1000 ml
- Hasil visualisasi media NA sebelum sterilisasi adalah warna agak keruh
kekuniangan, terdapat substrat di bawah dan menggumpal. Setelah direbus
warna kekuningan, substrat bercampur, mengental. Setelah sterilisasi warna
lebih pekat dan lebih kuning. Untuk PDA sebelum sterilisasi adalah Larutan
agak keruh dan berwarna kuning muda. Setelah direbus warna kuning
mendekati bening dan agak mengental. Setelah sterilisasi warna menjadi
bening. Untuk media kaldu sebelum sterilisasi warna merah cerah, tidak ada

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 44

endapan di dasar. Setelah direbus warna keruh agak putih, kental, ada
endapan di dasar. Setelah sterilisasi warna lebih pucat, banyak endapan di
dasar.

.
5.2 Saran
` Sebaiknya dibenahi lagi sistem praktikum dari segi waktu praktikum,
asisten agar dibagi secara merata untuk asisten mejanya karena ada
beberapa kelompok yang tidak mendapatkan asisten meja. Dan perlu
ditingkatkan lagi beberapa asisten dengan praktikum agar lebih kompak.
Untuk praktikan diharapkan dapat menjaga ketenangan selama praktikum dan
berhati-hati.

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman

 Mikrobiologi Dasar 2013 45

DAFTAR PUSTAKA

Amelia, G .2005.Dunia Mikroba 2. Balroom Karya Aksara : Jakarta.

Amelia, G., R. Handajani, I. Saskiawan, I. Khusniati, A. Cholik. 2005. Isolasi dan

Pengujian Aktivitas Enzim Amilase dan Profase Mikroba dari Terasi
Asal Kalimantan Timur. Program Studi Kimia, FMIPA, IPB: Bogor.

Dwijoseputro, D. 1978. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta

Ferdiaz.1993.Mikrobiologi Pangan. PT.Raja Grafindo Persada:Jakarta.

Hadioetomo.1985.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek .Gramedia :Jakarta.

Hadioetomo.1990.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Jilid 2.Gramedia: Jakarta.

Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. Raja Grafindo

Persada: Jakarta.

Murachaman, Ahmad Soewarso, dan Heppy Nursyam .1991 .Buku Panduan

Praktikum Mikrobiologi. FPIK. Universitas Brawijaya : Malang

Murachman, Ahmad Soewarso, dan Heppy Nursyam.1995. Buku Panduan

Praktikum Mikrobiologi jilid 2. FPIK. Universitas Brawijaya : Malang.

Pratiwi. 2005. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga : Jakarta.

Restuati. 2008. Perbandingan Chitosan Kulit Udang dan Kulit Kepiting dalam
Menghambat Pertumbuhan Kapang Aspengilus idalius.Unsu :
Jakarta.

Stanier, Roger Y., Edward A. Adelberg., dan John L. Ingraham. 1984. Dunia
MikrobeII. Bhratara Karya Aksara: Jakarta.

Suriawiria, Unus.1995. Mikrobiologi Dasar. Papasinas Sunar : Jakarta

Sutedjo, Mulmulyani., A. E. Kartapoerta, dan S. Sastroatmojo. 1991. Mikrobiologi

Tanah. Rineka Cipta : Jakarta.

Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman