UJI VIABILITAS NANO KOLAGEN SISIK IKAN

GURAME (OSPHRONEMUS GORAMY) TERHADAP

SEL EPITEL GINGIVA

PROPOSAL SKRIPSI

Oleh :

NUR AZIZAH HADI

NIM : 021511133047

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2018
 LEMBAR PENGESAHAN

UJI VIABILITAS NANO KOLAGEN SISIK IKAN

GURAME (OSPHRONEMUS GORAMY) TERHADAP
SEL EPITEL GINGIVA
PROPOSAL SKRIPSI
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Menyelesaikan
Pendidikan Sarjana Kedokteran Gigi Di Fakultas Kedokteran
Gigi Universitas Airlangga Surabaya
Oleh:
NUR AZIZAH HADI
NIM : 021511133047

Menyetujui
Pembimbing Utama : Pembimbing Serta :

Prof. Dr. Chiquita Prahasanti, drg., Sp.Perio (K) Noer Ulfah, drg., M.Kes., Sp. Perio (K)
NIP:195809091985032001 NIP: 196010101987022001

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2018
 i

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI ............................................................................................................ i

DAFTAR TABEL .................................................................................................. iii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. iv
BAB 1 ..................................................................................................................... 1
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
Latar Belakang ......................................................................................... 1
Rumusan Masalah .................................................................................... 3
Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3
Tujuan Umum ................................................................................... 3
Tujuan Khusus .................................................................................. 3
Manfaat Penelitian .................................................................................... 4
Manfaat Teoritis ................................................................................ 4
Manfaat Praktis ......................................................................................... 4
BAB 2 ..................................................................................................................... 5
Jaringan Periodontal ................................................................................. 5
Gingiva .............................................................................................. 5
Ligamen Periodontal ......................................................................... 8
Sementum.......................................................................................... 9
Tulang Alveolar .............................................................................. 10
Epitel ...................................................................................................... 11
Kolagen .................................................................................................. 13
Ikan Gurame ........................................................................................... 15
Kolagen Sisik Ikan Gurame ............................................................ 17
Nanoteknologi ........................................................................................ 18
Uji Viabilitas (MTT Assay) ................................................................... 19
BAB 3 ................................................................................................................... 22
Kerangka Konseptual Penelitian ............................................................ 22
Hipotesis Penelitian ................................................................................ 23
 ii

BAB 4 ................................................................................................................... 24
Jenis Penelitian ....................................................................................... 24
Rancangan Penelitian ............................................................................. 24
Sampel .................................................................................................... 24
Variabel Penelitian ................................................................................. 25
Variabel bebas ................................................................................. 25
Variabel terikat ................................................................................ 25
Varibel terkontrol ............................................................................ 25
Definisi Operasional ............................................................................... 25
Lokasi dan Waktu Penelitian .................................................................. 26
Alat Penelitian ................................................................................. 26
Bahan Penelitian.............................................................................. 27
Prosedur Penelitian ................................................................................. 28
Ekstraksi Sisik Ikan Gurame .......................................................... 28
Analisis Proksimat ......................................................................... 29
Pembuatan Nano Kolagen .............................................................. 29
Isolasi Sel Epitel Gingiva ................................................................ 29
Perlakuan Kultur Sel ....................................................................... 30
Pengenceran Partikel Nanokolagen Sisik Ikan Gurame ................. 31
Uji Viabilitas ................................................................................... 32
Perhitungan ..................................................................................... 35
Alur Penelitian ........................................................................................ 36
Analisis Data .......................................................................................... 38
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 39
 iii

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Jenis – Jenis Lapisan Epitel berdasarkan Susunan .............................. 12

Tabel 4.1. Skema pendistribusian suspensi partikel nanokolagen ...................... 34

 iv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Epitel Gingiva ................................................................................... 7

Gambar 2.2 Gingival Fibers ................................................................................. 8

Gambar 2.3 Serat Ligamen Periodontal ............................................................... 9

Gambar 2.4. Struktur kolagen triple helix ........................................................... 12

 BAB 1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Penyakit periodontal adalah penyakit yang timbul akibat respon tubuh

terhadap akumulasi bakteri pada jaringan periodontal yang menyebabkan jaringan

penyangga gigi kehilangan struktur kolagennya, dan apabila penyakit periodontal

ini tidak dilakukan perawatan yang tepat, maka dapat menyebabkan kehilangan

gigi (Lumentut et al ,2013). Penyakit periodontal merupakan penyakit gigi dan

mulut kedua terbanyak setelah karies gigi yang banyak diderita masyarakat di

dunia (Petersen et al, 2005), dan berdasarkan Riset Kesehatan Dasar pada tahun

2013, penyakit periodontal juga dialami oleh penduduk di Indonesia dengan

prevalensi yang cukup tinggi yaitu pada semua kelompok umur di Indonesia

sebanyak 96,58%.

Perawatan terdahulu yang sudah dilakukan pada penderita penyakit

periodontal yaitu dengan bedah resektif yang bertujuan untuk mengurangi

kedalaman poket dengan membuang jaringan yang rusak (Dalal et al, 2012),

sedangkan bedah regeneratif saat ini dianggap lebih menguntungkan karena selain

dapat menghilangkan kerusakan akibat kelainan periodontal juga diberikan bahan

– bahan yang dapat membantu pembentukan tulang dan ligament periodontal baru

serta perlekatan gingiva yang lebih ke koronal dan perawatan dengan bedah

regeneratif ini juga memiliki nilai estetik yang lebih baik dibanding dengan bedah

resektif (Newman et al, 2012).

1
 2

Perkembangan baru dalam bidang kedokteran gigi yang sedang berkembang

pesat saat ini adalah tissue engineering dengan menggunakan bahan regeneratif

pada tingkat selular untuk memacu adanya regenerasi jaringan periodontal yang

membutuhkan proliferasi sel yang terorganisasi, differensiasi sel dan

pengembangan berbagai tipe sel untuk membentuk perlekatan periodontal

(Cahaya dan Masulili, 2015). Keberhasilan rekayasa jaringan sangat ditentukan

oleh 3 faktor yang telah banyak dikemukaan oleh peneliti-peneliti terdahulu.

Ketiga faktor tersebut adalah tissue engineering yaitu scaffold, sel, dan growth

factor (Tabata, 2003).

Peran kolagen tipe I yakni sebagai matrik protein ekstraselular dengan

karakteristik peningkatan proliferasi sel sehingga secara langsung mempengaruhi

fisiologis dan morfologi sel (Cardoso et al, 2014). Kolagen tipe 1 dapat diperoleh

salah satunya dari sisik ikan. Sisik ikan mengandung komponen antara lain 70 %

air, 27% protein, 1 % lemak, dan 2 % abu. Senyawa organik terdiri dari 40%-90%

pada sisik ikan dan selebihnya merupakan kolagen (Budiharjo, 2015 ; Nagai et

al,2004).

Ikan gurame (Osphronemus goramy) merupakan salah satu produk perikanan

budidaya yang produksi setiap tahunnya meningkat. Jumlah konsumsi ikan

gurame mencapai 33,89 kg/kapita/tahun pada tahun 2012 dan pada tahun 2013

meningkat menjadi 35,14 kg/kapita/tahun. Meningkatnya jumlah konsumsi ikan di

Indonesia berakibat terhadap tingginya jumlah limbah yang dihasilkan,

diantaranya yaitu limbah sisik dan tulang dari ikan (Kementerian Kelautan dan

Perikanan, 2013).
 3

Secara umum kolagen sudah banyak dihasilkan dari limbah sisik ikan gurame,

tetapi tidak dalam ukuran nanopartikel. Penelitian dari Hoet et al tahun 2004

menyatakan bahwa partikel dengan ukuran nano akan lebih mudah untuk diserap

dan terdifusi dalam kulit daripada partikel yang memiliki ukuran lebih besar dan

beberapa partikel juga dapat menembus dermis. Hal ini yang mendasari penulis

untuk dikembangkannya scaffold untuk menunjang tissue engineering yang

digunakan untuk perawatan penyakit periodontal dibidang regeneratif. Sebagai

tahap awal, penelitian ini bertujuan untuk melihat viabilitas nano kolagen dari

sisik ikan gurame terhadap sel epitel gingiva.

Rumusan Masalah

Bagaimana viabilitas partikel nano kolagen sisik ikan gurame (Osphronemus

goramy) terhadap sel epitel gingiva ?

Tujuan Penelitian

Tujuan Umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi dan efek pemberian

partikel nano kolagen sisik ikan gurame (Osphronemus goramy) terhadap sel

epitel gingiva.

Tujuan Khusus

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui viabilitas partikel nano kolagen

sisik ikan gurame (Osphronemus goramy) terhadap sel epitel gingiva dengan

menghitung jumlah sel epitel gingiva yang hidup setelah diberikan perlakuan.
 4

Manfaat Penelitian

Manfaat Teoritis

Mengetahui viabilitas nano kolagen sisik ikan gurame (Osphronemus

goramy) terhadap sel epitel gingiva.

Manfaat Praktis

Mengetahui potensi sisik ikan gurami sebagai bahan alternatif pada

scaffold untuk menunjang tissue engineering.

 BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

Jaringan Periodontal

Gingiva

Gingiva merupakan bagian dari mukosa pengunyahan yang menutupi

tulang alveolar dan melingkari bagian servikal dari gigi. Gingiva terdiri dari

lapisan epitel dan jaringan ikat di bawahnya yang disebut lamina propria. Gingiva

berfungsi melindungi jaringan yang ada dibawahnya terhadap pengaruh

lingkungan rongga mulut serta pertukaran selektif dengan lingkungannya yang

dilakukan melalui proliferasi dan diferensiasi keratinosit (Lindhe et al, 2008).

Secara klinis, anatomi gingiva menurut Newman et al, 2012 dibagi menjadi 3,

yaitu :

1. Marginal gingiva adalah gingiva yang terdapat di sekeliling gigi, yang

disebut free gingiva. Marginal gingiva merupakan dinding jaringan lunak

sulkus gingiva, merupaka celah dangkal yang melingkar di permukaan gigi,

berbentuk V, dan probe dapat masuk. Kedalaman sulkus ini penting untuk

parameter menentukan kesehatan jaringan periodontal, kedalaman sulkus

normal secara klinis antara 2 hingga 3 mm.

2. Attached gingiva adalah kelanjutan free gingiva, bentuknya firm, melekat

kuat pada periosteum tulang alveolar, dan lentur. Pada dasar attached

gingiva terdapat mucogingival junction yakni batas mukosa alveolar dengan

batas attached gingiva.

5
 6

3. Interdental gingiva adalah gingiva yang berada pada interdental dibawah

area kontak gigi. Berbentuk piramida pada gigi anterior atau col pada gigi

posterior atau sesuai dengan titik kontak antar gigi.

3.1.1.1 Epitel Gingiva

Secara histologi epitel gingiva merupakan stratified squamous epithelium.

Fungsi utama epitel adalah melindungi struktur yang ada di bawahnya

danmemungkinkan terjadinya perubahan selektif pada lingkungan oral. Secara

morfologis dan fungsional, dapat dibedakan menjadi oral epithelium yaitu bagian

yang terletak dipermukaan luar dari free gingiva dan attached gingiva dibentuk

oleh sel pembentuknya, berkeratin atau parakeratin, sulcular epithelium

merupakan dinding lateral dari sulkus gingiva, sel pembentuknya tipis, tidak

berkeratin dan terdiri dari stratified squamous epithelium tanpa rete peg dan

junctional epithelium yang membentuk perlekatan antara gingiva dengan

permukaan gigi, epitel ini merupakan stratified squamous epithelium yang tidak

berkeratin. Junctional epithelium melekat pada permukaan gigi melalui lamina

basal interna dan melekat pada jaringan ikat gingiva melalui lamina basal externa.

Sel lain yang ditemukan, ada juga yang tidak berkeratin yang mengandung sel

langerhans, sel merkel, sel melanosit, dan sel – sel inflamatori seperti limfosit, T

sitotoksik dan T helper (Mueller, 2005 ; Newman et al, 2012).

 7

Gambar 2.1 Epitel Gingiva (Lindhe et al, 2008).

Epitel gingiva merupakan jaringan periodontal yang berproliferasi tinggi.

Proliferasi epitel gingiva berlangsung tinggi ketika proliferasi dimulai pada fase

awal penyembuhan luka sepanjang permukaan bagian dalam flap dalam arah

apikal, setelah sekitar satu minggu bagian bawah lesi akan tercapai dan akan

menempel pada permukaan gigi dengan mekanisme perlekatan dari epitel

(Mueller, 2005).

Jaringan ikat gingiva atau yang disebut dengan lamina propria terdiri dari

jaringan serabut kolagen padat (60%), fibroblast (5%), serta saraf dan pembuluh

darah (35%) (Lindhe et al, 2008). Kandungan kolagen yang terdapat pada jaringan

ikat gingiva terutama kolagen tipe I yang mempunyai fungsi menyangga margin

gingiva sehingga terikat ke permukaan gigi, menimbulkan kekakuan pada margin

gingiva sehingga tidak terkuak menjauhi gigi bila terkena tekanan pengunyahan,

dan menyatukan margin gingiva dengan sementum akar gigi dan attached gingiva.

Serabut gingiva terbagi dalam 3 kelompok yaitu gingivodental termasuk serabut

yang berjalan dari puncak alveolar ke gingiva; berjalan dari permukaan luar ; serta
 8

serabut yang berasal dari permukaan gigi dan di atas periosteum bukal atau

lingual. Sirkular yaitu serabut yang berjalan dalam pola melingkar atau setengah

lingkaran di sekitar gigi seperti cincin ; dan serat transeptal yang berjalan secara

interproksimal dari permukaan akar satu gigi, di atas puncak alveolar, dan ke

permukaan akar gigi yang berdekatan (Rose et al, 2004 ; Newman et al, 2012).

Gambar 2.2 Gingival Fibers. (a) serat yang berjalan dari permukaan akar dan di
atas periosteum oral, (b) serat yang berjalan dari permukaan akar dan ke dalam
gingiva, dan (c) serat yang berjalan dari tulang alveolar dan ke dalam gingiva.
Tidak ditunjukkan serat yang berjalan dalam arah melingkar atau
semicircumferential di sekitar gigi di dalam gingiva, serta kelompok serat
transseptal yang berjalan dari permukaan akar satu gigi di atas puncak alveolar
dan ke permukaan akar gigi yang berdekatan (Rose et al, 2004).

Ligamen Periodontal

Ligamen periodontal adalah jaringan ikat penyangga gigi yang terletak

diantara dua jaringan yang termineralisasi yaitu sementum dan tulang alveolar

(Kawase et al, 2008).

Struktur paling penting yang terdapat pada ligamen periodontal adalah

principal fibers yang mengandung berkas – berkas kolagen. Bagian ujung dari

principal fibers yang masuk ke dalam tulang disebut sharpey’s fiber. Principal
 9

fiber ligament periodontal tersusun dalam 6 kelompok yang melekat pada akar

gigi, antara lain : transeptal, alveolar crest, horizontal, oblique, apical, dan

interradikular.

Gambar 2.3 Serat Ligamen Periodontal (Lindhe et al, 2008).

Ligamen periodontal memiliki beberapa komponen sel antara lain sel

jaringan ikat yang berisi fibroblast, sementoblast dan osteoblast. Sel epitel rest of

malassez yang membentuk kisi – kisi dari ligament periodontal dan

didistribusikan dekat sementum sepanjang lihamen periodontal. sel lain yang

ditemukan adalah sel nutrofil, limfosit, makrofag, mast sel, dan eosinophil yang

merupakan sel imun (Kawase et al, 2008).

Sementum

Sementum merupakan jaringan mesenkimal yang avaskular dan

terkalsifikasi membentuk permukaan luar akar gigi. jaringan ini menutupi daerah

dentine dan komposisinya seperti tulang meskipun tidak ada sistem havers dan

pembuluh darah. Dua sumber utama serat kolagen dalam sementum adalah

Sharpey fibers (ekstrinsik), yang merupakan bagian tertanam dari serat utama
 10

ligamen periodontal dan yang dibentuk oleh fibroblast, dan serat yang termasuk

dalam matriks sementum (intrinsik), yang diproduksi oleh sementoblasts. Proporsi

utama dari matriks organik sementum terdiri dari tipe I (90%) dan tipe III (sekitar

5%) kolagen. Sementum pada bagian apikal gigi lebih tebal, dan terdapat sel – sel

yang mirip osteosit, yang disebut sementosis. (Bosshardt et al, 2005 ; Newman et

al, 2012).

Sementum terdiri dari matrix interfibrilar yang terkalsifikasi, dan fibril

kolagen. sementum terdapat 2 komponen yaitu : (Newman et al, 2012)

1. Komponen aseluler : Bagian sementum yang terbentuk paling awal,

menutupi 1/3 servikal sampai 1/2 bagian akar, tidak mengandung sel dan

ketebalannya mencapai 20 - 230 mikrometer. Sharpey fibers membentuk

sebagian besar struktur sementum aselular, yang memiliki peran utama

dalam mendukung gigi.

2. Komponen seluler : Terbentuk setelah gigi mencapai oklusal, mengandung

sel (sementosit) berbentuk irregular dan kurang terkalsifikasi. Sharpey fibers

lebih sedikit pada sementum seluler dan dipisahkan oleh serat lain yang

disusun baik sejajar dengan permukaan akar atau secara acak.

Tulang Alveolar

Tulang alveolar merupakan bagian dari tulang rahang yaitu tulang

maksila dan tulang mandibula yang mendukung dan membentuk soket gigi.

Prosesus alveolar berkembang bersamaan dengan perkembangan dan erupsi

gigi geligi. Tulang alveolar terdiri dari tulang yang terbentuk baik oleh sel-sel

dari folikel gigi (tulang alveolar) dan sel-sel yang tidak bergantung pada

perkembangan gigi. Bersama dengan sementum akar dan membran periodontal,

 11

tulang alveolar merupakan alat perlekatan dari gigi geligi, fungsi utamanya adalah

untuk mendistribusikan dan menyerap kekuatan yang dihasilkan oleh

pengunyahan dan kontak gigi (Lindhe et al, 2008).

Tulang alveolar adalah tempat melekatnya gigi yang terdiri dari komponen

dkomponen seluler yaitu, osteoblast dan osteoklast serta intercellular matrix yang

terdiri dua pertiga komponen non organik dan satu pertiga komponen organik.

Komponen anorganik diantaranya adalah kalsium, fosfat, hidroksil, karbonat,

sitrat, dan beberapa ion sodium, magnesium, fluoride. Komponen organik yang

ada adalah kolagen tipe 1 yakni 90% dengan jumlah sedikit osteokalsin,

osteonektin, protein morphogenetik, phospo protein, proteoglikan, osteoponin.

(Mackie, 2003 ; Nanci, 2006)

Tulang alveolar memiliki kemampuan untuk remodeling, yaitu untuk

memperbaiki diri. Remodeling pada tulang alveolar dapet mempengaruhi

ketinggian, kontur, dan densitas tulang alveolar. Terdapat 3 area remodeling

tulang, yaitu : di ligamen periodontal, periosteum daerah bukal atau fasial, dan

permukaan endosteal (Nanci, 2006)

Epitel

Epitel adalah sel berbentuk polyhedral yang melapisi permukaan luar

tubuh, melapisi rongga dalam, membentuk berbagai organ & kelenjar, serta

melapisi duktus. Lapisan sel epitel dipisahkan dari komponen seluler lainnya

(jaringan ikat, kapiler) oleh membran basal yang terdiri dari kolagen, laminin,

fibronektin, dan proteoglikan (Freshney & Freshney, 2002 ; Singh, 2011). Epitel

berasal dari ketiga lapis benih embrio yaitu (1) Lapisan ektodermal membentuk
 12

epitel yang melapisi kulit, mulut, hidung dan anus, (2) Lapisan endodermal

membentuk epitel yang melapisi sistem pernapasan, traktus digestivus dan

kelenjar-kelenjar traktus digestivus seperti pankreas dan hati, (3) Lapisan

mesodermal membentuk epitel lain seperti ginjal (Mescher, 2013).

Epitel ditemukan di antara organ dan lingkungan luarnya (epidermis,

bronkial, atau epitelium alveolar) atau antara organ dan ruang cairan (enterosit

usus, epitel tubular ginjal, atau hepatosit dan epitel empedu hati). Sel epitel

berfungsi juga untuk meregulasi permeabilitas, transportasi, endositosis, dan

eksositosis. Selanjutnya, jika permeabilitas harus diatur, maka transpor transeluler

cenderung mendominasi dan transportasi periseluler harus dibatasi. Sel epitel juga

mengangkut cairan, ion, oksigen, dan nutrisi, dan mengeluarkan produk (Freshney

& Freshney, 2002).

Tabel 2.1 Jenis – Jenis Lapisan Epitel berdasarkan Susunan (Mescher, 2013 ; Singh 2011).
Susunan Menurut Bentuk Distribusi Fungsi
Lapisan Sel Sel
Sederhana/ 1.Skuamous Endotel, Mempermudah Gerakan,
Selapis Perikardium Tranpor Aktif, Pinositosis
Pleura,Peritoneum Menutupi, Sekresi
2.Kuboid Ovarium, Tiroid Proteksi,Lubrikasi,Absorbsi,
3.Kolumner Usus, Kandung Sekresi
Empedu

Berlapis/ 2 1. Skuamous Kulit Proteksi, Mencegah

Lapis Atau dengan Penguapan Berlebihan,
Lebih Keratinisasi Sekresi
2. Skuamous tanpa Mulut, Oesopagus,
Keratinisasi Vagina,Anus
3. Kuboid Folikel Ovarium
4. Transisionil Vesica
Urinaria,Ureter
5. Kolumner Konjungtiva

Berlapis Semu Trakea,Bronkus Proteksi, Pengeluaran debu

 13

Semua jaringan epitel mempunyai permukaan basal yang berhubungan dengan

jaringan penyambung di bawahnya yaitu struktur ekstra sel barupa lembaran

kontinyu yang disebut lamina basalis. Telah diketahui bahwa lamina basalis

mengandung kolagen protein dan beberapa kompleks protein polisakarida amorf

dan tidak ada hubungan langsung diantara sel-sel ini dengan pembuluh darah .

Oleh karena itu nutrisi epitel tergantung dari difusi metabolit melalui membran

basalis dan bagian-bagain dari lamina propria (Mescher, 2013).

Epitel dianggap hanya memberikan penghalang fisik terhadap infeksi dan

perlekatan gingiva yang mendasarinya. Namun, sekarang sel-sel epitel

memainkan peran aktif dalam pertahanan inang bawaan dengan menanggapi

bakteri secara interaktif dengan menanggapi infeksi, dan mengeluarakan respon

imun. Sebagai contoh, sel epitel dapat merespon bakteri dengan peningkatan

proliferasi, perubahan pensinyalan sel, diferensiasi dan kematian sel, serta

perubahan homeostasis jaringan. (Carranza, 2015)

Kolagen

Kolagen adalah suatu protein yang berfungsi untuk memberikan kekuatan dan

fleksibilitas pada jaringan dan tulang serta bagi jaringan lainnya, termasuk kulit

dan tendon. Senyawa ini merupakan protein utama yang menyusun komponen

matrik ekstraseluler. Kolagen tersusun atas triple helix dari tiga rantai α

polipeptida (Fratzl, 2008). Kandungan kolagen berupa tiga rantai polipeptida

dengan lebih dari 1000 asam amino dimasing-masing rantainya (Asyiraf, 2011).
 14

Struktur triple helix kolagen berasal dari tiga asam amino utama, yakni glisin,

prolin, hidroksipolin (Lodish et al., 2000).

Kolagen merupakan komponen struktural utama jaringan ikat putih (white

connective tissue) yang meliputi hampir 30% total protein pada tubuh. Terdapat

19 jenis kolagen, yaitu tipe I sampai XIX. Kolagen tipe I merupakan kolagen

fibrous yang ditemukan di semua jaringan ikat, termasuk kulit dan tulang.

Strukturnya terdiri atas heteropolimer (rantai alfa-1 dan alfa-2) dan glisin (tanpa

tryptophan dan cysteine) (Jongjareonrak et al, 2005).

Gambar 2.4. Struktur kolagen triple helix: (a) struktur kristal resolusi tinggi pertama kolagen,
tersusun dari (ProHypGly)4–(ProHypAla)–(ProHypGly)5; (b) Tampilan melintang dari satu
(ProProGly)10 triple helix dengan tiga helaian pada ruang kosong yang digambarkan sebagai
bola, tongkat, dan pita; (c) gambar bola dan tongkat dari segmen kolagen triple helix; (d)
ikatan tiga helai pada segmen panel c (Shoulders dan Raines, 2009).

Kolagen memiliki fungsi biologis dalam pembentukan jaringan dan organ

serta terlibat dalam pembelahan, pertahanan, dan differensiasi sel. Fungsi biologis

tersebut menyebabkan penggunaan kolagen dalam industri. Kolagen memiliki

karakteristik yang mudah diserap dalam tubuh, memiliki sifat antigenesis rendah,

afinitas dengan air tinggi, tidak beracun, biocompatible dan biodegradable, relatif

stabil, dapat disiapkan dalam berbagai bentuk sesuai kebutuhan, dan mudah
 15

dilarutkan dalam air maupun asam sehingga pemanfaatannya dalam bidang

industri berkembang pesat (Lee et al, 2001).

Glisin ditemukan sebagai asam amino utama bersama dengan alanine, proline,

dan hydroxyproline pada sisik ikan spesies Thunnus alalunga, Scoliodon

sorrakowah, dan Labeo rohita (Hema et al., 2013). Glisin dan prolin juga menjadi

asam amino dengan konsentrasi terbesar yang ditemukan pada spesies Liza

melinoptera, Liza macrolepis, Valamugil speigleri, dan Mugil cephalus

berdasarkan penelitian Massod et al. (2015). Hasil ini menegaskan adanya

kandungan kolagen, sebab glisin dan prolin merupakan komponen esensial

sebagai penyusun kolagen.

Biosintesis kolagen meliputi kombinasi asam amino ke bentuk rantai yang

akan bergabung membentuk molekul kemudian membentuk serat yang menyatu

dalam buntalan. tahap pertama terjadi di intraseluler untuk menghasilkan molekuk

prokolagen dimana dalam keadaan aktif berada ekstraseluler. pada tahap

intraseluler dimulai pada nukleus dimana gen – gen diaktifkan dan terjadi

pembentukan mRNA setelah itu diterjemahkan dan terjadi sintesis rantai

polipeptida triple. Prokolagen lalu meninggalkan sel kemudian asam amino

membelah secara enzimatik membentuk tropokolagen atau yang disebut molekul

kolagen. molekul kolagen selanjutnya akan bersatu dalam serat – serat dan

mengalami cross-linking membentuk bundel (Shoulders and Rainers, 2009).

Ikan Gurame

Ikan gurame (Osphronemus gouramy) merupakan salah satu ikan yang

mempunyai nilai ekonomis tinggi karena memiliki tekstur daging yang kompak
 16

serta rasanya lezat. Selain itu, ikan gurame mempunyai keunggulan lainnya yaitu

memiliki sifat omnivore (pemakan segala), memijah secara alami dan dapat hidup

di air tergenang serta pada kelarutan oksigen rendah (Rahardjo, 2008).

Berdasarkan (Rachmatika, 2010) ikan gurami (Osphronemus gouramy)

diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

Kelas : Pisces

Subkelas : Actinopterygii

Super Ordo : Perciformes

Ordo : Labyrinthici

Sub-Ordo : Anabantoidea

Famili : Anabantidae

Genus : Osphronemus

Spesies : Osphronemus gouramy

Sisik adalah lapisan terluar dari ikan yang berfungsi sebagai barrier yang

mencegah masuknya senyawa asing ke dalam tubuh ikan. Variasi sisik ikan ini

sangat luas, dapat dibedakan atas bentuk, ukuran, dan susunannya. Klasifikasi

umum terdiri atas cosmoid, ganoid, placoid, dan elasmoid (cycloid dan ctenoid)

yang sering ditemukan pada kelas teleost (Zhu et al., 2011).

Sisik ikan adalah jaringan yang mengandung osteoblast dan osteoklast seperti

yang ditemukan pada tingkat vertebrata yang lebih tinggi, namun regulasi

aktivitas sel dalam jaringan masih sedikit diketahui (Rotllant et al, 2005). Sisik

juga mempunyai karakteristik yang sama yang ditemukan dalam struktur-struktur

 17

lain seperti tulang, gigi, dan urat daging yang bermineral. Semua bahan ini

sebagian besar dibentuk oleh suatu komponen organik (yaitu kolagen), suatu

komponen mineral yaitu hidroksiapatit dan air (Torres et al, 2008).

Senyawa kimia yang terkandung dalam sisik ikan, antara lain adalah 41-84%

merupakan protein organik dan sisanya merupakan residu mineral dan garam

anorganik seperti magnesium karbonat dan kalsium karbonat. Komponen besar

yang terdapat di sisik ikan antara lain adalah 70 % air, 27% protein, 1 % lemak,

dan 2 % abu. Senyawa organik terdiri dari 40%-90% pada sisik ikan dan

selebihnya merupakan kolagen (Budiharjo, 2015 ; Nagai et al, 2004).

Kolagen Sisik Ikan Gurame

Kolagen dari sisik ikan merupakan kolagen derivat dari ikan, komponen asam

amino kolagen dari sisik ikan secara umum ada bermacam-macam namun

kandungan asam amino glisin yang paling tinggi. Hal tersebut mengakibatkan

suhu denaturasi kolagen sisik ikan relatif rendah dan membuatnya menjadi protein

yang mudah dicerna dan dapat diturunkan menjadi produk- produk yang lebih

sederhana. Selain itu kolagen sisik ikan juga bebas dari penyakit yang bisa

ditularkan oleh hewan unggas seperti flu burung atau mamalia seperti sapi gila

(Hartati dan Kurniasari, 2010).

Kolagen dari ekstrak sisik ikan gurami memiliki beberapa rantai polipeptida

yang dihubungkan oleh ikatan silang yang akan membentuk triple helix.

Kandungan asam amino glisin yang tinggi pada sisik ikan gurami dapat

dimanfaatkan sebagai bahan graft tulang, atau pengisi soket pasca pencabutan

gigi. Kandungan-kandungan lainnya diduga dapat memicu kerja Transforming

 18

growth factors alfa (TGF-α) dan Transforming growth factors beta (TGF-β).

Kolagen sisik ikan gurami khususnya dapat meningkatkan Transforming growth

factors beta satu (TGF-β1) sehingga memodulasi aktivitas sel-sel imun seperti

neutrofil, monosit, makrofag, limfosit serta meregenerasi sel fibroblas,

odontoblas, osteoblas dan osteoklas (Budiraharjo, 2015 ; Imamah, 2015).

Nanoteknologi

Nanoteknologi adalah ilmu yang mempelajari benda yang sangat kecil, mulai

dari kegunaan dan manipulasinya dalam skala kecil. Hal ini dapat memberikan

kesempatan untuk pengembangan materi, termasuk dalam aplikasi medikal,

dimana teknik konvensional sudah tidak mumpuni lagi. Nanoteknologi tidak dapat

dilihat sebagai satu teknik yang hanya dapat mempengaruhi area yang spesifik.

Meskipun sering disebut sebagai “ilmu kecil”, bukan berarti nanoteknologi

hanya sebuah struktur dan produk yang kecil. Fitur nano ini sering juga digunakan

untuk bahan produk massal dan besar. Nanoteknologi mecangkupi desain,

produksi dan aplikasi material dalam skala atomik, molekular dan

markomolekular untuk memproduksi materi nano yang baru (Hahens, et al.,

2007).

Nanopartikel adalah partikel yang berukuran sangat kecil dengan diameter

antara 1-100 nm. Nanopartikel merupakan suatu partikel berdimensi tiga, yang

memiliki ukuran berskala nanometer. Sifat materi yang berukuran nanometer

memiliki perbedaan dengan sifat pada ukuran yang lebih besar (bulk). Dimana

material yang berukuran nano memiliki sifat kimia, fisika dan biologi yang lebih
 19

unggul dibandingkan dengan material yang berukuran lebih besar (Khan et al,

2008).

Peneliti di bidang nanotoksikologi telah menemukan bahwa nanopartikel

dapat menembus penghalang stratum korneum dan sifat fisikokimia dari

nanopartikel dapat mempengaruhi penetrasi, translokasi sistemik dan toksisitas

(Delouise, 2012). Berbagai bahan nanopartikel diteliti untuk aktivitas antimikroba

sebagai inhibitor pertumbuhan, agen antimikroba, dan operator antimikroba.

Sebuah penelitian membuktikan bahwa nanopartikel perak aman untuk digunakan

tergantung pada ukuran partikel, karena partikel yang berukuran lebih kecil

menyajikan toksisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan nanopartikel lebih

besar (Gajbhiye et al, 2016).

Pembuatan nano kolagen dari hasil perlakuan terbaik pada isolasi kolagen

yang telah dihasilkan dan diuji sebelumnya dilakukan dengan melarutkan kolagen

dengan aquades dengan rasio perbandingan 1:2 dan dilakukan sizing selama 2-4

jam dengan magnetic stirrer pada kecepatan ±3000 rpm, Setelah 2-4 jam sampel

ditetesi dengan larutan etanol 96% dengan rasio perbandingan 1:1, hal ini

bertujuan agar tidak terjadi aglomerasi pada partikel kolagen yang sudah menjadi

nano kolagen. Tahap selanjutnya adalah pengujian ukuran partikel untuk

mengetahui distribusi ukuran kolagen nanopartikel yang dihasilkan (Coester et al,

2000).

Uji Viabilitas (MTT Assay)

Viabilitas menyatakan kemampuan sel untuk hidup setelah diberikan suatu

ekstrak atau zat tertentu. (Kartika, 2017). Tetrazolium (MTT) adalah salah satu
 20

metode yang paling sering digunakan untuk uji viabilitas sel. Metode ini

menggunakan kolorimeter untuk menentukan viabilitas sel pereaksi (reagen) MTT

menghasilkan nilai absorbansi rendah tanpa adanya sel. Dalam MTT assay,

hubungan linear antara sel aktif secara metabolik dan warna yang dihasilkan

ditetapkan, sehingga memungkinkan kuantifikasi yang akurat dari perubahan

tingkat kematian sel atau proliferasi. MTT adalah metode yang umum digunakan

untuk evaluasi viabilitas sel dan sitotoksisitas untuk screening obat. MTT assay

berdasarkan reduksi MTT (berwarna kuning) dan pewarna tetrazolium lainnya

tergantung pada aktivitas metabolik seluler NAD(P)H dengan oksidoreduktase

seluler enzim (Berridge et al., 2005). Sel yang tumbuh dengan baik dan cepat

menunjukkan tingkat reduksi MTT yang tinggi terhadap formazan sementara sel

mati atau tidak aktif gagal melakukannya. Produk akhir reduksi MTT adalah

formazan warna ungu yang dapat dengan mudah dilarutkan dalam DMSO.

Viabilitas dalam MTT assay dihubungkan dengan kuantifikasi formazan pada 540

nm yang secara linier terkait dengan aktivitas enzim dan secara tidak langsung

dengan jumlah sel yang hidup. Intensitas warna ungu yang tinggi menunjukkan

viabilitas sel yang lebih tinggi sementara penurunan intensitas warna ungu

menandakan jumlah sel yang berkurang dan menunjukkan sitotoksisitas zat yang

diberikan (Bahuguna et al, 2017).

Jumlah sel pada mikrotiter plate harus optimal untuk mendapatkan hasil yang

baik. Jumlah sel mempengaruhi tingkat aktivitas mitokondria dan laju proliferasi.

Untuk mendapatkan hasil optimal, beberapa konsentrasi sel harus ditanam dalam

5-7 lempeng. Kemudian ukur densitas optik menggunakan kolorimeter setiap hari

untuk menentukan kurva pertumbuhan garis sel untuk mencegah pertumbuhan

 21

berlebih, yang akan mempengaruhi percobaan. Nilai densitas optik awal hari 0

tidak boleh melebihi 0,125 (Van Meerloo et al., 2011).

 BAB 3

KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

Kerangka Konseptual Penelitian

Sisk Ikan Gurame

Partikel Nanokolagen Sisik Ikan

Gurame

Asam Amino Glisin Matriks

Ekstraselluler

Scaffold Kolagen

Media Perlekatan, Migrasi, dan

Proliferasi Sel Epitel

Peningkatan Viabilitas Sel

Epitel Gingiva

Variabel yang diteliti

Variabel yang tidak diteliti

22
 23

Sisik ikan gurami diketahui memiliki kandungan protein yakni berupa

kolagen, dan yang terbanyak adalah kolagen tipe 1. Asam amino yang dikandung

oleh kolagen tipe 1 yang paling tinggi diantaranya adalah asam amino glisin, yang

dapat merangsang proliferasi dari sel epitel. Kolagen merupakan salah satu

komponen yang dapat digunakan sebagai substrat pertumbuhan sel yang dikenal

dengan matriks ekstraseluler. Matriks atau substrat tumbuh tidak berarti

menyediakan nutrien, tetapi sebagai sarana melekatnya sel agar bisa

berproliferasi. Kolagen merupakan salah satu biopolimer, sehingga tidak hanya

sebagai substrat pelekatan sel namun lebih berperan sebagai scaffold. Scaffold

adalah material atau biomaterial yang berfungsi sebagai

penyokong/pendukung/penegak pertumbuhan sel. Kolagen sebagai scaffold tidak

hanya menyokong, namun akan bersatu dengan sel karena bersifat biodegradabel

sehingga dapat berfungsi sebagai media perlekatan, migrasi dan proliferasi dari sel

epitel yang dapat meningkatkan viabilitasnya. Sel yang dibiakkan pada media

mengalami pertumbuhan dari segi aktivitas proliferasi akibat asupan kolagen

sebagai nutrien maupun substrat (matriks ekstraseluler) untuk pelekatan sel

Hipotesis Penelitian

Viabilitas sel epitel gingiva baik setelah pemberian partikel nanokolagen sisik

ikan gurame.
 BAB 4

METODE PENELITIAN

Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratoris.

Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian ini menggunakan rancangan post test only control group

design.

Sampel

Populasi minimal sampel dihitung menggunakan rumus Federer (1955).

(t−1) (n−1) ≥ 15

(9-1) (n-1) ≥ 15

8 (n-1) ≥ 15

8n – 8 ≥ 15

8n ≥ 23

n ≥ 2,875

minimal jumlah sampel ≈ 3

t : banyak perlakuan

n : jumlah sampel per kelompok perlakuan

Perlakuan terdiri atas 7 perlakuan dengan 7 macam paparan partikel

nanokolagen sisik ikan gurami dan 1 kontrol sel dan 1 kontrol medium. Nilai n

24
 25

yang didapat adalah 3. Sehingga setiap kelompok perlakuan membutuhkan

minimal 3 sampel.

Variabel Penelitian

Variabel bebas

Partikel nanokolagen sisik ikan gurame dengan konsentrasi 1000 ppm; 500

ppm; 250 ppm; 125 ppm; 62,5 ppm; 31,25 ppm; 15,625 ppm (Arianie,

2017)

Variabel terikat

Vaibilitas sel epitel gingiva

Varibel terkontrol

Alat, bahan dan cara kerja

Definisi Operasional

1. Partikel nanokolagen sisik ikan gurame adalah kolagen tipe 1 yang

didapatkan dari sisik ikan gurame yang direndam dalam asetat dan

dikeringkan terlebih dahulu menggunakan alat freezedryer lalu dibuat

menjadi partikel nano.

2. Viabilitas sel adalah kemungkinan sel untuk dapat hidup setelah

terpapar suatu bahan.

3. MTT assay adalah salah satu metode yang digunakan dalam uji

viabilitas. Prinsip metode ini adalah reaksi redoks yang terjadi di

dalam sel. MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

bromide] direduksi oleh enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat di

dalam mitokondria sel hidup sehingga menghasilkan produk formazan

biru keunguan yang tidak larut dalam air. Formazan yang diproduksi
 26

dapat dihitung dengan melarutkan DMSO (Dimethyl sulfoxide) dan

mengukur densitas optik dari larutan yang dihasilkan. Reaksi warna

biru keunguan digunakan sebagai ukuran jumlah sel yang hidup

dengan bantuan alat ELISA reader pada panjang gelombang 590 nm.

4. Sel epitel gingiva merupakan salah satu jenis cell lines yang

menyediakan sistem sel yang ideal untuk membentuk feeder layer

sebagai model untuk mempelajari proses penyembuhan luka,

toksikologi, atau biologi sel dasar.

Lokasi dan Waktu Penelitian

1. Pembuatan partikel nanokolagen sisik ikan gurame dilaksanakan di

Politeknik Negeri Malang pada bulan Mei - Juni 2018.

2. Penanaman sel epitel gingiva dilakukan di ITD (Institute of Tropical

Disease) Surabaya pada bulan Juli – Agustus 2018.

3. Uji viabilitas dilaksanakan di ITD (Institute of Tropical Disease)

Surabaya Agustus 2018.

4.6 Alat dan Bahan

Alat Penelitian

a. Mikropipet 200 dan 500

b. Tabung reaksi kecil

c. Rak tabung kecil

d. 96-well plate

e. Conical tube

f. Yellow tip dan blue tip

g. ELISA reader
 27

h. Pinset

i. Cawan petri

j. Inkubator

k. Tisu

l. Aluminium foil

Bahan Penelitian

a. NaOH 0,05 N

b. CH3COOH 0,3 N

c. Etanol 96%

d. garam seimbang Hanks (HBSS)

e. Streptomisin 100 U/ml

f. Amfoterisin B 1%

g. Phosphate Buffer Saline (PBS) 10%

h. Media komplit (MK) (DMEM 500 mL, FBS 10% Penicillin-

Streptomycin 2%, fungizone 0,5%)

i. DMSO 7,5 mL

j. MTT 5mg/mL PBS (50 mg MTT dan 10 mL PBS)

k. SDS 10% dalam 0,1 N HCl

l. Sisik ikan gurami

m. Sel Human Gingival Epithelium

n. 10% bovine serum albumin (FBS)

o. Tripsin 0,25% sebanyak 0,5 mL

 28

Prosedur Penelitian

Ekstraksi Sisik Ikan Gurame (modifikasi Kittiphattanabawon et al,

2010)
Isolasi kolagen dari sisik ikan gurame pada penelitian ini terbagi dalam

beberapa tahap.

1. Tahap pertama yaitu sisik ikan gurame yang telah dicuci dan

ditimbang bobotnya, dilakukan perendaman dalam larutan NaOH 0,05

N rasio 1:10 selama 6 jam dengan tujuan untuk menghilangkan kadar

protein non kolagen yang masih terdapat pada sisik.

2. Setelah itu dilanjutkan proses netralisasi dengan pencucian

menggunakan aquades.

3. Tahap kedua perlakuan yang diberikan adalah perendaman sisik ikan

dalam larutan asam asetat (CH3COOH) dengan perbandingan sisik

ikan dan asam asetat adalah 1:6. Konsentrasi asam asetat yang

digunakan adalah 0,3 N (v/v) dengan lama perendaman yaitu selama 2

jam.

4. Sisik ikan kemudian dicuci menggunakan aquades hingga pH 4,6 dan

dilanjutkan dengan ekstraksi pada suhu 40 ºC selama 3 jam dengan

rasio bobot sisik ikan dan aquades adalah 1:2.

5. Filtrat yang diperoleh dari proses isolasi selanjutnya disaring dengan

menggunakan kertas saring.

6. Setelah itu untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan dilakukan

pengamatan berupa uji fisik yang meliputi analisis proksimat dan pH

dengan sampel yang sebelumnya telah dikeringkan terlebih dahulu

menggunakan alat freezedryer.

 29

Analisis Proksimat (AOAC 2005)

Analisis proksimat dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia suatu

bahan yang meliputi, analisis kadar air, lemak, protein, dan abu yang

mengacu pada AOAC 2005.

Pembuatan Nano Kolagen (modifikasi Coester et al, 2000)

Tahap selanjutnya adalah pembuatan nano kolagen dari hasil perlakuan

terbaik pada isolasi kolagen yang telah dihasilkan dan diuji sebelumnya.

1. Pembuatan nano kolagen dilakukan dengan melarutkan kolagen

dengan aquades dengan rasio perbandingan 1:2 dan dilakukan sizing

selama 2-4 jam dengan magnetic stirrer pada kecepatan ±3000 rpm,

2. Setelah 2-4 jam sampel ditetesi dengan larutan etanol 96% dengan

rasio perbandingan 1:1, hal ini bertujuan agar tidak terjadi aglomerasi

pada partikel kolagen yang sudah menjadi nano kolagen.

3. Tahap selanjutnya adalah pengujian ukuran partikel untuk mengetahui

distribusi ukuran kolagen nanopartikel yang dihasilkan.

Isolasi Sel Epitel Gingiva

1. Jaringan gingiva dari donor manusia diambil dari pasien RSGM-P FKG

Unair yang sehat digunakan sebagai sumber sel-sel epitel untuk kultur.

2. Jaringan gingiva diletakkan pada transport medium Leibowitz L-15

medium dan diberikan kepada laboratorium.

3. Setelah disinfektan dalam larutan povidone iodine selama beberapa

menit dan dicuci dengan media kultur, sampel jaringan gingiva

 30

dipotong-potong, sekitar 1mm3, dan ditempatkan pada plate untuk

kultur.

4. Setelah disinfektan dalam larutan povidone iodine, sampel jaringan

gingiva dicelupkan semalam pada suhu 4oC dengan 1 ml 0,25%

tripsin dalam larutan garam seimbang Hanks (HBSS) dengan 100

U/ml streptomisin dan 1% amfoterisin B.

5. Jaringan disimpan pada suhu kamar selama 30 menit dan epitelium

dipisahkan menggunakan forseps.

6. Epitelium dipisahkan dengan 0,02% tripsin dalam EDTA selama 10

menit dan disentrifugasi pada 400 x g.

7. Sel-sel dikumpulkan dan diberi makan dengan SFM keratinocyte

dengan 50 mg / ml gentamisin sebagai media kultur.

8. Kepadatan penyemaian sel setidaknya 0,56103 sel/ cm2. Tingkat

keberhasilan kultur menggunakan metode ini didefinisikan sebagai

kemampuan sel epitel dari jaringan yang dicerna untuk bertahan hidup

dan tumbuh setidaknya sampai subkultur pertama.

Perlakuan Kultur Sel

1. Kultur primer Human Gingival Epithelium Cell dikultur dalam

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM). Kultur ditambah

dengan 150 μg/mL serum fetal bovine (FBS) 10%, 10 μg/mL

Fungizone 0,5%, 100 μg/mL Penistrep 2%.

2. Sel diinkubasi pada suhu 37°C dalam atmosfer lembab denngan CO2

sebesar 5% di udara selama 1 bulan.

 31

3. Sel dengan densitas 5 x 103 ditransfer ke dalam 96 well, dengan 21

well diberi perlakuan dan 3 well berupa kontrol sel dan medium

(tanpa perlakuan).

4. Tiga well kosong disisakan sebagai kontrol media.

5. Keadaan sel diamati dengan mikroskop cahaya untuk melihat

distribusi sel.

6. Sel diinkubasi di dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC

(agar sel attach kenbali setelah dipanen).

7. Hari berikutnya, media yang mengandung sel-sel yang tidak melekat

dibuang.

8. Pada well ditambah kembali 100 μL media kultur baru.

Pengenceran Partikel Nanokolagen Sisik Ikan Gurame

1. Sebanyak 100 mg partikel nanokolagen sisik ikan gurame dilarutkan

dalam 1 mL DMSO sehingga didapatkan suspensi nanokolagen sisik

ikan gurame dengan konsentrasi 100 mg/mL

2. Sebanyak 7 tabung masing-masing diisi 2 mL media kultur komplit

dan setiap tabung diberi label tabung I berisi 1000 ppm, tabung II

berisi 500 ppm, Tabung III berisi 250 ppm, tabung IV berisi 125 ppm,

tabung V berisi 62,5 ppm, tabung VI berisi 31,25 ppm, tabung VII

berisi 16,25 partikel kolagen sisik ikan gurami.

3. Konsentrasi 100 mg/mL diencerkan untuk mendapat konsentrasi 1000

ppm. Konsentrasi 100 mg/mL diambil sebanyak 40 μL menggunakan

mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam larutan media kultur

 32

komplit sebanyak 3960 μL MK. Sehingga total kandungan tabung I

dengan konsentrasi 1000 ppm sebanyak 4 mL.

4. Konsentrasi 500 ppm didapatkan dengan cara mengambil sebanyak 2

mL larutan stok konsentrasi 1000 ppm menggunakan mikropipet

kemudian dimasukkan ke larutan media kultur sebanyak 2 mL.

5. Konsentrasi 250 ppm didapatkan dengan cara mengambil sebanyak 2

mL larutan stok konsentrasi 500 ppm menggunakan mikropipet

kemudian dimasukkan ke larutan media kultur sebanyak 2 mL.

6. Konsentrasi 125 ppm didapatkan dengan cara mengambil sebanyak 2

mL larutan stok konsentrasi 250 ppm menggunakan mikropipet

kemudian dimasukkan ke larutan media kultur sebanyak 2 mL.

7. Konsentrasi 62,5 mL didapatkan dengan cara mengambil sebanyak 2

mL larutan stok konsentrasi 125 ppm menggunakan mikropipet

kemudian dimasukkan ke larutan media kultur sebanyak 2 mL.

8. Konsentrasi 31,25 ppm didapatkan dengan cara mengambil sebanyak

2 mL larutan stok konsentrasi 62,5 ppm menggunakan mikropipet

kemudian dimasukkan ke larutan media kultur sebanyak 2 mL.

9. Konsentrasi 15,625 ppm didapatkan dengan cara mengambil

sebanyak 2 mL larutan stok konsentrasi 31,25 ppm menggunakan

mikropipet kemudian dimasukkan ke larutan media kultur sebanyak 2

mL.

Uji Viabilitas

1. Kultur primer Human Gingival Epithelium Cell disiapkan di dalam

laminar flow.
 33

2. Well H4, H5, H6 pada microplate pertama dan kedua diisi dengan

media kultur Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium dan fetal bovine

serum (FBS) 10% sebanyak 100 μL sebagai kontrol media.

3. Well H1, H2, H3 pada microplate hanya kultur Human Gingival

Epithelium Cell dan media kultur DMEM karena digunakan sebagai

kontrol sel.

4. Suspensi partikel nanokolagen sisik ikan gurame yang disterilkan

menggunakan UV sterilizer ditambahkan ke dalam tiap well sebanyak

100 μL mulai dari well A1-G3 pada 96-well plate.

5. Well A1, A2, A3 pada 96-well plate ditambah dengan suspensi

partikel nanokolagen sisik ikan gurame dengan konsentrasi 1000 ppm.

6. Well B1, B2, B3 pada 96-well plate ditambah dengan suspensi

partikel nanokolagen sisik ikan gurame konsentrasi 500 ppm.

7. Well C1, C2, C3 pada 96-well plate ditambah dengan suspensi

partikel nanokolagen sisik ikan gurame konsentrasi 250 ppm.

8. Well D1, D2, D3 pada 96-well plate ditambah dengan suspensi

partikel nanokolagen sisik ikan gurame konsentrasi 125 ppm.

9. Well E1, E2, E3 pada microplate ditambah dengan suspensi partikel

nanokolagen sisik ikan gurame konsentrasi 62,5 ppm.

10. Well F1, F2, F3 pada 96-well plate ditambah dengan suspensi partikel

nanokolagen sisik ikan gurame konsentrasi 31,25 ppm.

11. Well G7, G8, G9 pada 96-well plate ditambah dengan suspensi

partikel nanokolagen sisik ikan gurame konsentrasi 15,625 ppm..

 34

1 2 3 4 5 6
A Tabung I
(1000 PPM)
B Tabung II
(500 PPM)
C Tabung III
(250 PPM)
D Tabung IV
(125 PPM)
E Tabung V
(62,5 PPM)
F Tabung VI
(31,25 PPM)
G Tabung VII
(15,625 PPM)
H KONTROL
SEL (123)
DAN
MEDIUM
(456)
Tabel 4.1. Skema pendistribusian suspensi partikel nanokolagen sisik ikan gurami pada 21 well.
Uji perlakuan dilakukan triplicate. Kolom A-G 123 merupakan sampel perlakuan, sedangkan
kolom A-G 456 well dibiarkan kosong. Well H1-3 merupakan kontrol sel dan dan well H4-6
merupakan kontrol medium.

12. Microplate pertama diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2

5% pada suhu 37ºC.

13. Microplate dikeluarkan dari alat inkubator, media kultur dan suspensi

partikel nanokolagen sisik ikan gurame dibuang kemudian kultur sel

dalam well dicuci dengan PBS.

 35

14. Pada masing-masing well, ditambahkan 100 μL larutan MTT. Sel

diinkubasi selama 4 jam dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37ºC.

15. Setelah masa inkubasi selesai, MTT beserta media kultur diambil

menggunakan syringe. Kristal formazan dilarutkan dengan cara

menambahkan stopper SDS 10% pada tiap well, kemudian digoyang

diatas shacker selama 10 menit.

16. Nilai densitas optik formazan dibaca menggunakan ELISA reader

dengan panjang gelombang 595 nm.

Perhitungan

Hasil bacaan dikonversikan ke dalam % dengan rumus sesuai (Gunawan,

et al., 2014) untuk menentukan persentase viabilitas sel :

Viabilitas sel = OD perlakuan + OD kontrol media x 100%

Keterangan:
OD kontrol sel + OD kontrol media

Viabilitas sel : Persentase jumlah kehidupan sel setelah diuji (dalam %)

OD perlakuan : Nilai absorbansi (optical density) formazan setiap sampel

perlakuan setelah dilakukan pengujian

OD kontrol media : Nilai absorbansi (optical density) formazan pada rata-rata

kontrol media

OD kontrol sel : Nilai absorbansi (optical density) formazan pada rata-rata

kontrol sel
 36

Alur Penelitian

Ekstraksi Sisik Ikan Gurame

Perendaman dalam larutan NaOH 0,05 N rasio 1:10 selama 6 jam dengan
tujuan untuk menghilangkan kadar protein non kolagen

Netralisasi dengan pencucian menggunakan aquades.

Perendaman sisik ikan dalam larutan asam asetat (CH3COOH) dengan

perbandingan sisik ikan dan asam asetat adalah 1:6. Konsentrasi asam
asetat yang digunakan adalah 0,3 N (v/v) dengan lama perendaman yaitu

dicuci menggunakan aquades hingga pH 4,6 dan dilanjutkan dengan

ekstraksi pada suhu 40 ºC selama 3 jam dengan rasio bobot sisik ikan dan
aquades adalah 1:2.

disaring dengan menggunakan kertas saring lalu

dikeringkan dengan alat freezedryer

Analisis proksimat

Pembuatan nano kolagen dilakukan dengan melarutkan kolagen dengan

aquades dengan rasio perbandingan 1:2 dan dilakukan sizing selama 2-4
jam dengan magnetic stirrer pada kecepatan ±3000 rpm

Setelah 2-4 jam sampel ditetesi dengan larutan etanol 96% dengan rasio
perbandingan 1:1, hal ini bertujuan agar tidak terjadi aglomerasi pada
partikel kolagen yang sudah menjadi nano kolagen
 37

Dilakukan kultur primer sel Human Gingival

Ephitelium

Sel Human Gingival Ephitelium dengan kerapatan 5000 ppm dipanen

dan diletakkan pada 96 well dengan rincian 24 well (A1-3 hingga H1-3)
berisi MK (DMEM 500 mL, FBS 10%, antibiotik penstrep 10%, dan
fungizone 0,5%) masing-masing sebanyak 5 x 103 dan media kontrol
diletakkan pada well H4-6

21 well yang telah terisi sel Human Gingival Ephitelium diberi suspensi
partikel nanokolagen sisik ikan gurami yang telah dilarutkan dalam
DMSO sebanyak masing-masing 2 mg/mL

well A1-3 well B1-3 well C1-3 well D1-3 well E1-3  well F1-3  well G1-3
 1000  500 ppm  250 ppm  125 ppm 62,5 ppm 31,25 ppm  15,625
ppm partikel partikel partikel partikel partikel partikel ppm partikel
nanokolagen nanokolagen nanokolagen nanokolagen nanokolagen nanokolagen nanokolagen

Microplate diinkubasi selama 24 jam, suhu 37oC, 5 % CO2

Media Kultur dan suspensi nanokolagen sisik ikan gurame dibuang

kemudain kultur sel dicuci dengan PBS 5 %

Dilakukan MTT assay dengan menambahkan 100 µL larutan MTT

kemudian diinkubasi selama 24 jam, suhu 37oC, 5 % CO2 lalu
dihentikan dengan stopper SDS 10%. Microplate diletakkan diatas
vortex selama 10 menit.

Dilakukan pengukuran densitas optic menggunakan ELISA reader

dengan panjang gelombang 595 nm.

Dilakukan penghitungan jumlah sel hidup, uji normalitas, uji

homogenitas, serta uji beda menggunakan SPSS 24.
 38

Analisis Data

Data hasil penghitungan jumlah sel Human Gingival Epithelial yang sudah

dikumpulkan dilakukan uji normalitas Shapiro-Wilk menggunakan SPSS 24

untuk melihat adanya pengaruh pemberian patrikel nano kolagen sisik ikan

gurame pada sel Human Gingival Epithelial. Data dikatakan memiliki

distribusi normal (bermakna) apabila p > 0,05 dan tidak normal (tidak

bermakna) apabila p < 0,05. Kemudian dilanjutkan dengan uji Levene’s Test

untuk melihat homogenitas sampel dan Mann-Whitney U Test menggunakan

SPSS 24 untuk melihat adanya perbedaan signifikan antara jumlah Human

Gingival Epithelial pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.

 39

DAFTAR PUSTAKA

Asyiraf, N., 2011, Extraction of Collagen From Fish Waste and Determination of
Its Physico-chemical Characteristic, Food Science and Technology, Faculty of
Applied Sciences, Selangor: Universiti Teknologi MARA.
Bosshardt, D.D, Degen T, Lang NP. 2005. Are cementoblast a Subpopulation of
Osteoblast or a Unique Phenotype? J Dent Res 320: pp. 208-219.
Budirahardjo, R., 2015. Sisik Ikan Sebagai Bahan yang Berpotensi Mempercepat
Proses Penyembuhan Jaringan Lunak Rongga Mulut, Regenerasi Dentin,
Tulang Alveolar dan Stomatogenatik. Jurnal Kedokteran Gigi, vol 7, no.2,
pp.136-140.
Cahaya, Cindy., Sri Lelyati C Masulili. 2015. Perkembangan Terkini Membran
Guided Tissue Regeneration/Guided Bone Regeneration sebagai Terapi
Regenerasi Jaringan Periodontal. Maj Ked Gi Ind. 1(1). hal. 1-11
Cardoso, V.S., Quelemes, P.V., Amorin, A., Primo, F.L., Gobo, G.G., Tedesco,
A.C., Mafud, A.C., Mascarenhas, Y.P., Corrêa, J.R., Kuckelhaus, S.A et al.,
2014, Collagen Based Silver Nanoparticles for Biological Applications:
Synthesis and Characterization, Journal of Nanobiotechnology, vol 12 (36),
pp. 1-9.
Coester CJ, Langer K, Van Briesen H, Kreuter J. 2000. Gelatin nanoparticles by
two-step desolvation-a new preparation method, surface modifications and cell
uptake. Microencapsulation 17(2): 187-193.
Dalal M, Dalal S, Momin R. 2012. Periodontal Surgery – Revolution from
Resection to Regeneration. Healthtalk, vol.4, pp. 1-4.
Delouise Lisa A. 2012. Application of Nanotechnology in Dermatology. J Invest
Dermatol. 132(302). pp. 964-975.
Fratzl, P., 2008, Collagen: Structure and Mechanics, New York: Springer.
Freshney, R. Ian and Mary G Freshney 2002. Culture of Epithelial Cells. Wiley-
Liss, Inc. 2 : pp. 1-30.
Gajbhiye S, Sakharwade S. 2016. Silver Nanoparticles in Cosmetics. Journal of
Cosmetics Dermatological Sciences and Applications. 6: pp. 48-53.
 40

Gruber, R . 2014. Molecular and Cellular Basis of Bone Resorption, Wiener

Medizinische Wochenschrift, pp. 7-10.
Hartati, I. and Kurniasari, L., 2010. Kajian produksi kolagen dari limbah sisik
ikan secara ekstraksi enzimatis. Momentum, vol. 6, no. 1, hal. 33-35.
Hema, G.S., Shyni, K., Mathew, S., Anandan, R., Ninan, G., dan Lakshmanan,
P.T. 2013. A Simple Method for Isolation of Fish Skin Collagen- Biochemical
Characterization of Skin Collagen Extracted from Albacore Tuna (Thunnus
alalunga), Dog Shark (Scoliodon sorrakowah), and Rohu (Labeo rohita), Annals
of Biological Research, 4 (1) : 271-278
Hoet PHM, Bruske-Hohlfeld I, Salata OV. 2004. Nanoparticles known and
unknown health risks. J Nanotechnol vol 2(12) pp. 1-5.
Imamah, Indah Nur. 2015. Pengaruh Pemberian Kolagen Ikan Terhadap Proses
Penyembuhan Luka Insisi (Studi Eksperimen pada Tikus Putih Rattus
Norvegicus). Jurna Husada Mahakam. Vol. 4 (1), hal.1-71.
Jongjareonrak, A., Benjakula, S., Visessanguanb, W., Prodpranc, T., dan Tanakad,
M., 2005, Isolation and Characterisation of Acid and Pepsin-Solubilised
Collagens from The Skin of Brownstripe Red Snapper (Lutjanus vitta), Food
Chemistry, 93 pp. 475–484.
Kawase T, Sato S, Miakke K, Saito S. 2008. Alkaline Phospatase of Human
Periodontal Ligament Fibroblast-Like Cell. Adv. Vent Res 2 pp. 234-239.
Kedjarune, Ureporn, Supreya Pongprerachok, Premjit Arpornmaeklong,Kiattisak
Ungkusonmongkhon. 2001. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery 29, pp.
224 – 231.
Kementerian Kelautan dan Perikanan. 2013. Statistik menakar target ikan air
tawar tahun 2013 available from kkp.go.id.
Khan AK, Rasyid R, Murtaza G, Zahra, A. 2014. Gold Nanoparticles: Synthesis
and Applications in Drug Delivery. Tropical Journal of Pharmaceutical
Research. 13(7). pp. 1169-1117.
Kittiphattanabawon P, Benjakul S, Visessanguan W, Kishimura H, Shahidi F.
2010. Isolation and Characterisation of collagen from the skin of brownbanded
bamboo shark (Chiloscyllium punctatum). Food Chem 119: 1519-1526.
 41

Lee CH, Singla A, Lee Y. 2001. Biomedical applications of collagen.

International Journal Pharmacy 221:1-22.
Lindhe, Jan., Niklaus P. Lang., Thorkild Karring. 2008. Clinical Periodontology
and Implant Dentistry. Blackwell. Munksgaard. Vol 1. pp. 5-6, 8, 296
Lumentut, Reyna A. N., Gunawan, P. N., and Mintjelungan, C. N., 2013, Status
Periodontal dan Kebutuhan Perawatan Pada Usia Lanjut, Jurnal eGiGi (eG), Vol
1(2): 79-83.
Mackie EJ. Osteoblast novel roles in orchestration of skeletal architecture. 2003.
Internal J Biochem Cell Btol, vol. 35, pp. 1301.
Massod, Z., Yasmeen, R., Haider, M.S., Tarar, O. M., Zehra, L., dan Hossain, M.
Y., 2015, Evaluation of Crude Portein and Amino Acid Contents From The
Scales of Four Mullet Species (Mugilidae) Collected From Karachi Fish
Harbour, Pakistan, Indian Journal of Geo-Marine Science, 44 (5): pp. 1-9.
Mescher, Anthony L. 2013. Junqueira’s Basic Histology Text and Atlas.
McGraw-Hill Education 13 : pp. 200-205.
Mueller, H.P. 2005. Textbook of Periodontology The Essential. Thieme, Stuttgart,
pp. 6,133
Muyonga JH, Cole CGB, Duodu KG. 2004. Characterisation of acids oluble
collagen from skins of young and adulti Nileperch (Lates niloticus). Food
Chemistry 85(1): 81-89.
Nagai T, Izumi M, Ishii M. 2004. Preparation and partial characterization of fish
scale collagen. International Journal of Food Science and Technology, vol.
39, pp 239-244.
Nanci, Antonio and Dieter D. Bosshardt. 2006. Structure Of Periodontal Tissues
In Health And Disease. Periodontology. Blackwell Munksgaard, 40 : 11-28.
Newman, M.G., Takei, H., Klokkevold, P.R. and Carranza, F.A., 2012.
Carranza's clinical periodontology 12th Ed. Elsevier health sciences.
Petersen PE, Bourgeois D, Ogawa H, Estupinan-Day S, Ndiaye C. 2005. The
global burden of oral diseases and risks to oral health. Bull World Health
Organ. 83(9). pp. 661-669
Rachmatika, Ike. 2010. Taksonomi dan Habitat Ikan Gurame Sungai. Jurnal
Iktiologi Indonesia 10(2) : 145-151.
 42

Rahardjo, A. P. 2008. Pengaruh Umur Panen Terhadap Komposisi Asam Lemak

Daging Ikan Gurami (Osphronemus gouramy). Program Studi Tekologi Hasil
Perikanan. IPB. Bogor. hal. 68
Riset Kesehatan Dasar 2013 available from
www.depkes.go.id/resources/download/general/Hasil%20Riskesdas%202013.
pdf diakses tanggal 14 Maret 2018, hal.110-119.
Rose, L. F., Mealey B. L., Genco, R. J., and Cohen, D. W. 2004. Periodontics
Medicine, Surgery, and Implants, Elsevier Mosby, St. Louis, Missouri. pp. 45-
46,49-52
Rotllant J, Redruello B, Guerreiro PM, Fernandes H, Canario AVM, Power DM.
2005. Calcium mobilization from fish scales is mediated by parathyroid
hormone related protein via the parathyroid hormone type 1 receptor.
Regulatory Peptides. 132: 33-40.
Shoulders MD, Raines RT. 2009. Collagen Structure And Stability. Annu Rev
Biochem.78: pp. 929-958.
Tabata ,Y., 2003, Tissue Regeneration Based on Drug Delivery Technology,
Topics in Tissue Engineering e-book, Eds. N. Ashammakhi & P. Ferretti, pp.
4Torres FG, Troncoso OP, Nakamatsu J, Grande CJ, G’omez CM. 2008.
Characterization of the nanocomposite laminate structure occurring in fish
scales from Arapaima gigas. Materials Science and Engineering C. 28
(8):1276-1283.
Zhu, D., Ortega, C.F., Motamedi, R., Szewciw, L., Vernerey, F., dan Barthelat, F.,
2011, Structure and Mechanical Performance of a ‘‘Modern’’ Fish Scale,
Advanced Engineering Materials 13 (20): 1-10.
Bahuguna, Ashutosh., Khan Imran,. Bajpai Vivek K and Kang Sun Chul. 2017.
MTT assay to evaluate the cytotoxic potential of a drug. Bangladesh J
Pharmacol. 12 : 115-118
Berridge MV, Herst PM, Tan AS. 2005. Tetrazolium dyes as tools in cell biology:
New insights into their cellular reduction. Biotechnol Annu Rev 11: 127-52.
Van, Meerloo J, Kaspers GJL, Cloos J. 2011. Cell sensitivity assays: The MTT
assay. Methods Mol Biol.731: 237-45.