LAPORAN KELOMPOK

DIAGNOSA TERHADAP AYAM DARI PASAR WONOKROMO DENGAN

INOKULASI SUSPENSI ORGAN PADA TELUR AYAM BEREMBRIO (TAB)

KELOMPOK 3
PPDH GELOMBANG XXXII

Bayu Aji Prasojo 061823143040

Rizal Ilham Akbar 061823143039
Ryandika Wahyu 061823143043
Hartono 061823143047
Naufal Tyamato 061823143038
Shahani Azpriyanne Cahyono 061823143035
Putri Anggraheni Kusumaningrum 061823143014
Siti Lia Rahmatika 061823143044
Aulia Puspa Amaris 061823143051
Kurnia Azizah 061823143036
Ratna Kusuma Wardani 061823143008
Ivana Dyah Pratiwi 061823143053

PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2019
 BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit hewan dapat disebabkan oleh virus, bakteri dan parasit. Penyakit
tersebut dapat menyerang manusia maupun hewan, bersifat sangat merugikan
karena dapat mengakibatkan kematian yang tinggi pada ternak. Penyakit virus pada
umumnya bersifat akut, menular dan kejadiannya berlangsung cepat menyebar
pada kelompok hewan. Angka sakit (morbiditas) dan angka kematian (mortalitas)
pada beberapa virus yang ganas (virulen) itu sangat tinggi. Morbiditas maupun
mortalitas dapat mencapai 100%, misalnya pada penyakit Avian Influenza atau
pada penyakit Newcastle Disease yang menyerang unggas, terutama pada unggas
yang tidak dipelihara dengan baik.
Pemeliharaan unggas yang baik dan benar yakni dengan menjaga kebersihan
kandang dan lingkungan (Biosecurity) dan melakukan pencegahan dengan
memberikan vaksinasi secara teratur guna meningkatkan kekebalan unggas
terhadap penyakit terentu. Perlu diingat bahwa penyakit virus tidak dapat diobati
dengan antibiotika. Oleh karena itu, pencegahan sangat memegang peran penting
dalam pengendalian penyakit virus. Vaksinasi dan Biosekuriti adalah faktor utama
dalam pencegahan virus. Pemberian vaksin secara teratur mampu meningkatkan
kekebalan ayam. Keberhasilan vaksinasi dapat diketahui dengan melakukan
pemeriksaan titer antibodi dengan uji serologis. Selain untuk memeriksa titer
antibodi, pemeriksaan penyakit virus juga bermanfaat untuk mendiagnosa penyakit
virus.
Beberapa penyakit virus tersebut, misalnya pada unggas : penyakit Avian
Influenza/flu burung, Newcastle Disease (ND)/Tetelo, penyakit Gumboro dan lain
sebagainya. Selain menyebabkan kerugian secara ekonomi, beberapa virus hewan
bersifat zoonosis yakni dapat menular ke manusia bahkan menyebabkan kematian
pada manusia yang terinfeksi misalnya penyakit flu burung.
Penyakit virus mempunyai gejala klinis mirip yang disebut dengan istilah
diagnosa banding. Misalnya penyakit flu burung mirip dengan penyakit ND karena
kedua penyait tersebut memiliki gejala klinis maupun angka sakit dan angka
1
kematian yang tinggi pada unggas. Untuk dapat mengetahui diagnosa yang pasti
dari penyakit tersebut, maka perlu dilakukan pemeriksaan laboratoris guna
menentukan agen penyebabnya. Untuk melakukan diagnosa laboratoris, dilakukan
beberapa tahapan yaitu : pengambilan sampel organ dari hewan sakit, pembuatan
inokulum, melakukan isolasi dan identifikasi virus (agen penyakit). Pada laporan
ini akan membahas tentang cara untuk melakukan isolasi virus dan cara untuk
mengidentifikasi virus secara virologis.

2
 BAB II METODE
2.1 Alat
Sterilisasi Alat
a. Tujuan Sterilisasi Alat
 Menjamin kebersihan alat
 Mencegah terjadinya infeksi silang
 Mencegah peralatan cepat rusak
 Menetapkan produk akhir dinyatakan sudah steril dan aman digunakan
b. Persiapan sterilisasi
Alat-alat laboratorium yang butuh di sterilkan; venoject, mortar, mortil, cawan
petri, pipet volume, gunting, dan pinset dibungkus dengan kertas buram satu
persatu lalu dimasukkan ke dalam autoclave.
c. Sterilisasi dengan cara Stoom
Mensterilkan peralatan dengan uap panas di dalam autoclave dengan waktu,
suhu, dan tekanan tertentu.
d. Hal-hal yang perlu diperhatikan pada proses sterilisasi
 Sterilisator harus dalam keadaan siap pakai
 Peralatan harus bersih dan masih berfungsi
 Peralatan yang dibungkus harus diberi label yang dengan jelas
mencantumkan nama, jenis peralatan, tanggal dan jam disterilkan
 Menyusun peralatan di dalam sterilisator agar seluruh alat yang dimasukkan
dapat disterilkan
 Waktu yang diperlukan untuk mensterilkan setiap jenis peralatan harus tepat
 Dilarang memasukkan atau menambahkan peralatan lain ke dalam
sterilisator sebelum waktu untuk mensterilkan selesai

2.2 Bahan
2.2.1 Ayam kampung I
a. Anamnesa:
- Ayam dibeli dari pasar Wonokromo.
3
 - Ayam kampung berkelamin jantan.
b. Gejala Klinis:
- Leher ayam mengalami tortikolis
- Ayam kurus dan sedikit lemas
- Ayam sulit berjalan
- Terlihat adanya eksudat dari sinus
c. Patologi Anatomi:
- Saluran pencernaan: seca tonsil tampak adanya ptechiae
- Saluran pernafasan : pada trakhea tampak hiperemis
- Organ Limpa : normal
- Organ Otak : normal.
d. Diagnosa sementara : Newcastle Disease (ND).
2.2.2 Ayam Kampung II
a. Anamnesa
Ayam yang dijadikan objek percobaan isolasi dan identifikasi virus
merupakan ayam kampung berkelamin jantan dan berumur 4 bulan
yang dikoleksi dari pasar Wonokromo Surabaya.
b. Gejala Klinis
- Terdapat discharge nasal mucous di hidung ayam
- Kondisi tubuh ayam lemas
- Bulu tampak kusam
- Mata tampak sayu dan berair
- Ngorok
- Demam
c. Patologi Anatomi
- Otak : normal
- Trachea : mengalami ptechiae
- Paru-paru : normal
- Limpa : normal
- Proventriculus : mengalami ptechiae
4
 - Caecatonsil : normal
e. Diagnosa sementara : Newcastle Disease (ND).
2.3 Pembuatan Suspensi
a. Sampel organ yang menunjukkan kelainan patologi dikoleksi dan diletakkan
pada cawan petri steril.
b. Masing-masing organ ditimbang dengan berat 0,4 gram, setelah itu
ditempatkan pada mortar steril, dan ditambahkan pasir kuarsa secukupnya
untuk memudahkan proses penggerusan organ.
c. Ditambahkan larutan PZ yang sudah dimasukkan antibiotik pada masing-
masing organ yang telah digerus
d. Selanjutnya suspensi jaringan dipindahkan ke dalam tabung steril untuk
disentrifuse dengan kecepatan 500 rpm selama 15 menit, kemudian
dipisahkan supernatan dari endapan. Supernatan diambil sebanyak 0,2 ml
menggunakan spuit 1 ml.
e. Telur SPF sebanyak 30 butir dicuci menggunakan sabun dan dibilas,
kemudian dicandling untuk memastikan embrio masih hidup, lalu ditandai
kantung udara dan ditandai titik bagian penyuntikan. Kemudian telur di lap
dengan kapas alkohol, lalu dilubangi pada titik yang sudah ditandai.
Selanjutnya larutan supernatan disuntikkan ke dalam TAB melalui lubang
tersebut. Setelah penyuntikan, lubang ditutup kembali dengan solatip lalu telur
di tandai.
f. Kemudian telur diinkubasi pada suhu 37oC dan diamati (dicandling) setiap
hari.
2.4 Isolasi Virus
Pasca nekropsi dilakukan, kedua ayam diduga terkena penyakit ND. Pada
ayam I menunjukkan gejala ND yang ringan. Untuk melakukan isolasi virus pada
ayam yang diduga ND, organ yang mengalami perubahan patologi dikoleksi untuk
mengidentifikasi adanya virus pada organ.
Adapun organ- organ yang dikoleksi untuk isolasi virus ND adalah sebagai
berikut:
5
a. Otak
Isolasi virus ND dilakukan apabila ayam menunjukkan gejala neurogenik
seperti tortikolis/terpelintir. Namun pada Ayam I tidak ditemukan gejala
neurogenik. Begitu juga pada pemeriksaan patologi anatomi tidak ditemukan
perubaan apapun. Meskipun begitu, penyakit ND dapat menyerang sistem
syaraf, salah satunya adalah otak. Sehingga pada Ayam I dan II tetap kami
koleksi sampel otak.
b. Trachea
Saluran pernapasan merupakan predileksi penyakit ND yang umum ditemukan.
Pada ayam I ditemukan adanya gejala discharge nasal sehingga perlu koleksi
organ saluran pernapasan seperti trachea. Begitupun pada pemeriksaan patologi
anatomi, ditemukan adanya pteciae pada trakea.
a. Pulmo
Saluran pernapasan merupakan predileksi penyakit ND yang umum ditemukan.
Pada ayam I ditemukan adanya gejala discharge nasal sehingga perlu koleksi
organ saluran pernapasan seperti pulmo. Tetapi tidak ditemukan perubaan
patoloi anatomi.
c. Proventriculus dan caeca tonsil
Pada penyakit ND salah satu organ yang diserang adalah sistem pencernaan
sehingga kelompok kami mengisolasi virus ND yang diduga ada pada organ
proventriculus dan caeca tonsil.
d. Limpa
Sistem limfatik merupakan sistem pertahanan tubuh yang rentan terinfeksi
virus. Limpa ayam yang terkena penyakit ND mengalami nekrosis dengan
bintik-bintik putih yang tersebar pada semua bagian. Namun pada ayam I dan
II tidak ditemukan perubaan patologi anatomi.
Organ-organ ayam yang dikoleksi, diletakkan pada cawan petri. Sebelum
digerus organ dipotong dan ditimbang dengan berat 0,4 gram. Semua alat bedah
yang digunakan untuk nekropsi dan pembuatan suspensi harus steril.

6
2.5 Inokulasi pada Cairan Alantois
TAB yang digunakan yakni TAB berumur 8-10 hari, berasal dari induk yang
sehat, tidak pernah divaksin dan tidak pernah tertular penyakit atau memiliki sifat
SPF (Spesific Pathogen Free) dan SAN (Spesific Antibody Negative).
Cara kerja:
a. Lakukan pemeriksaan TAB dan pastikan bahwa TAB tersebut berembrio dan
embrionya hidup dengan cara meneropong telur didepan lampu (candling).
b. TAB diberikan tanda batas dengan pensil antara ruangan hawa dengan isi telur.
c. Membuat lubang dengan paku pada kulit telur pada daerah ruang hawa (±3-5
mm dari tanda batas ruang hawa).
d. Ambil supernatan dari suspensi sampel dengan menggunakan spuit 1cc.
e. Melalui lubang paku dimasukkan jarum spuit sedalam ±1 cm sejajar dengan
sumbu panjang telur.
f. Supernatan yang didapat dari tiap organ diinokulasikan pada 3 TAB di bagian
cairan alantois sebanyak 0,2 ml.
g. Setelah disuntik lubang paku ditutup dengan selotip.
h. Telur diinkubasi pada suhu 37oC dengan posisi ruang hawa sebelah atas.
i. Pengamatan dilakukan setiap hari selama 5 hari dengan cara candling dibawah
sinar lampu untuk memastikan terjadinya kematian, jika telur mati telur
dimasukkan kedalam kulkas.
j. Pada hari ke-lima semua telur dimasukkan kedalam kulkas untuk selanjutnya
dilakukan pengamatan.
k. Pecahkan telur pada daerah ruang hawa dan lakukan pengujian terhadap cairan
alantois.

7
 BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil Candling Telur
TAB di-candling setiap hari untuk memastikan waktu kematian dan untuk
keperluan recording. TAB yang mengalami kematian kemudian disimpan ke
dalam lemari pendingin untuk menghindari proses pembusukan. Pada hari ke-6
setelah inokulasi, telur dibuka kerabangnya sehingga dapat diambil cairan
alantoisnya untuk melakukan uji HA (hemaglutinasi) yang dilanjutkan dengan uji
HI (hemaglutinasi inhibition) untuk identifikasi virus.
Tabel 3.1 Hasil Candling Ayam I
TAB I TAB II TAB III
Sampel Organ
Kematian (jam) Kematian (jam) Kematian (jam)
Otak 96 jam 96 jam 72 jam
Trakea 72 jam 72 jam 72 jam
Paru-paru 72 jam 72 jam 72 jam
Limpa 24 jam 96 jam 72 jam
Proventikulus 72 jam 72 jam 72 jam

Tabel 3.2 Hasil Candling Ayam II

TAB I TAB II TAB III
Sampel Organ
Kematian (jam) Kematian (jam) Kematian (jam)
Otak 96 jam +/- 109 jam
Trakea 96 jam >48 jam
Paru-paru 72 jam
Limpa +/- 109 jam +/- 109 jam 96 jam
Proventikulus 24 jam +/- 109 jam 72 jam

3.2 Hasil Uji Hemaglutinasi (HA)

Pada hari ke-6 pasca inokulasi TAB dengan supernatan organ yang diduga
terdapat virus didalamnya, dilakukan uji HA untuk mengetahui ada tidaknya virus

8
yang memiliki kemampuan mengaglutinasi eritrosit dan mengetahui titer antigen
dari virus. Uji HA dilakukan dengan mengambil cairan allantois dari TAB yang
telah diinokulasikan dengan supernatan organ ayam I dan II kemudian direaksikan
dengan eritrosit 0,5% adapun skema dari pelaksanaan uji HA (Haemaglutinasi)
yang dilakukan oleh kelompok kami yaitu sebagai berikut:

Tabel 3.3 Skema pelaksanaan Uji Hemaglutinasi (HA)

No. 1 2 3 4 5 6
Sumuran
PZ (µl) 25 25 25 25 25 25
Cairan 25 25 25 25 25 25
Allantois (25 sisa
(µl) dibuang)
Eritrosit 50 50 50 50 50 50
0,5% (µl)

Tabel 3.4 Hasil Uji Hemaglutinasi (HA) Sampel Organ Ayam I

Sampel Hemaglutinasi sumur ke Titer

Otak I 4 16 HAU

Otak II 4 16 HAU

Otak III 4 16 HAU

Trachea I 4 16 HAU

Trachea II 4 16 HAU

Trachea III 5 32 HAU

Paru-paru 1 5 32 HAU

Paru-paru II 5 32 HAU

9
 Paru-paru III 3 8 HAU

Limpa I - -

Limpa II 5 32 HAU

Limpa III 5 32 HAU

Proventriculus I 3 8 HAU

Proventriculus II 5 32 HAU

Proventriculus III 3 8 HAU

Tabel 3.4 Hasil Uji Hemaglutinasi (HA) Sampel Organ Ayam II

Organ 1 2 3
Otak 25 24 23
Trakea - - -
Paru-paru - 25 -
Limpa - - 22
Proventrikulus - 24 25

Berdasarkan dari hasil uji hemaglutinasi pada sample TAB yang

diinokulasikan oleh supernatan gerusan organ ayam kampung yang terduga
menderita ND, didapati hasil positif uji HA pada hampir semua sample. Namun
karena tidak satupun titer menunjukkan angka standart yaitu 4 HAU untuk
dilanjutkan kepada uji serologis haemagglutination inhibition (HI) maka perlu
dilakukan adanya tindakan re-titrasi. Untuk melakukan re-titrasi, cairan allantois
TAB akan diencerkan dengan cairan PZ dengan perhitungan sebagai berikut :
𝑥
= 𝑦, 𝑦 = 1 ∶ PZ
4

Keterangan :
x = angka titer awal

10
 Dari sample diatas dipilih 5 sample cairan allantois TAB yang menunjukkan
hasil positif pada uji hemaglutinin untuk dilakukan re-titrasi. Proses re-titrasi
antigen memiliki langkah yang sama dengan proses titrasi awal. Dari proses re-
titrasi antigen didapati hasil sebagai berikut :
Hasil Re-titrasi Uji Hemaglutinasi (HA) Sampel Organ Ayam I
Sampel Hemaglutinasi sumur ke Titer

Otak I 4 16 HAU

Trachea I 3 8 HAU

Paru-paru I 2 4 HAU

Limpa II - -

Proventriculus II 5 32 HAU

Dari hasil re-titrasi antigen tersebut salah satu sample yaitu antigen TAB
yang diinokulasikan dengan supernatant gerusan organ paru-paru I dipilih untuk
selanjutnya diuji dengan uji HI ND specific.
3.3 Hasil Uji Haemagglutination Inhibition (HI) spesifik Newcastle Disease (ND)
Pada uji coba ini uji HI digunakan sebagai uji identifikasi virus khususnya
virus Newcastle Disease (ND). Uji HI dilakukan pada mikroplate 48 well model
v, dengan bahan-bahan antara lain cairan PZ, antigen ND positif 4 HAU, anti-
serum ND, larutan cairan allantois sample, dan larutan eritrosit 0.5%. Skema
pelaksanaan uji HI dapat dilihat sebagai berikut :
No. 1 2 3 4 5 6
Sumuran
PZ (µl) 25 25 25 25 25 25
Anti- 25 25 25 25 25 25
serum ND (25 sisa
(µl) dibuang)

11
 Antigen 25 25 25 25 25 25
ND positif
atau
antigen uji
4 HAU(µl)

INKUBASI 30 MENIT

Eritrosit 50 50 50 50 50 50
0,5% (µl)
INKUBASI 30 MENIT

Pada uji coba ini digunakan 24 well dalam 2 baris microplate, baris pertama
digunakan untuk mengidentifikasi antigen sample sedangkan baris kedua digunakan
sebagai kontrol positif dengan menggunakan antigen ND positif. Hasil dari uji coba
tersebut disajikan dalam table berikut :

Tabel 3.5 Hasil Uji HI ayam I

Antigen Titer Log2
Cairan Allantois 128 27
ND Positif >4096 >212

Tabel 3.6 Hasil Uji HI ayam II

Organ 1 2 3
Otak 25 24 23
Paru-paru - 25 -
Proventrikulus - 24 25

Dari table diatas dapat diketahui bahwa pada cairan allantois TAB yang
diinokulasi dengan sample gerusan organ ayam I mengandung antigen Newcastle
12
Disease (ND). Hal ini dapat dibuktikan oleh adanya ikatan antara antibody pada
antiserum spesifik ND dengan antigen yang terdapat pada cairan allantois TAB.
3.4 Pembahasan
Uji HA bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan virus pada TAB, terlihat
bahwa sampel organ yang di inokulasi pada TAB terdiri dari organ otak, trakea,
paru-paru, limpa, dan proventrikulus menunjukkan hasil positif yang ditandai
dengan adanya aglutinasi yang mengindikasikan bahwa ada pertumbuhan virus
pada TAB yang dapat mengaglutinasi darah.
Berdasarkan hasil uji HA dilakukan pada ayam I yang didiagonsa terinfeksi
ND dari gejala klinisnya yaitu lemas, eksudat pada hidung, dan demam. Serta pada
pemeriksaan patologi anatomi ditemukan adanya ptechiae pada organ trakea. Uji
HA bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan virus pada TAB, terlihat bahwa
sampel organ yang di inokulasi pada TAB yang terdiri dari organ otak, trakea,
pulmo, limpa, seca tonsil dan proventriculus menunjukkan hasil positif pada semua
organ yang diinokulasikan pada TAB, yang ditandai dengan terjadinya aglutinasi
hal ini mengindiksikan bahwa terdapat pertumbuhan virus pada TAB. Ditemukan
titer antigen pada berbagai macam organ sebagai berikut: 1) otak dengan titer
antigen 24 (16 HAU), 2) trakea dengan titer antigen 24 (16 HAU), 3) pulmo dengan
titer antigen 23 (8 HAU), 4) limpa dengan titer antigen 25 (32 HAU), 5)
proventrikulus dan seca tonsil dengan titer antigen 25 (32 HAU). Hasil positif dari
uji HA, dilanjutkan dengan melakukan pengenceran guna mendapatkan titer 4 HA
Unit (22) dengan mencampurkan larutan PZ dan cairan alantois.
Setelah itu dilanjutkan dengan uji HI untuk mengetahui jenis virus yang
tumbuh pada TAB, dalam percobaan ini dilakukan identifikasi virus ND karena
dilihat dari gejala klinis dari ayam dimana ayam tampak lesu dan lemas, sedangkan
dilihat dari hasil patologis, tampak ptechiae pada proventikulus dan lendir pada
trakea. Hal ini sesuai dengan yang tertulis pada Manual Penyakit Ungas oleh
Kementrian Pertanian (2014).
Pada uji HI antigen yang digunakan adalah antigen dari organ paru-paru,
karena antigen tersebut memiliki titer 4 HA unit (22), dan dibandingkan dengan
13
kontrol positif antigen ND dengan titer 4 HAU (22). Hasil positif ND ditunjukkan
pada pemeriksaan HI pada antigen yang berasal dari organ paru-paru, karena
terdapat hambatan aglutinasi sempurna.
Pada percobaan ini pada ayam II didapatkan titer antibodi 26 melalui uji HI.
Hambatan aglutinasi sempurna (100%) adalah terjadinya pengendapan eritrosit
pada dasar lubang mikroplate yang terlihat seperti pada kontrol. Hal tersebut berarti
serum homolog dengan antigen sehingga tidak berikatan dengan eritrosit dan tidak
menyebabkan aglutinasi.

14
 BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil uji HA Pada sampel organ dari ayam kampung yang di
inokulasi pada TAB terdiri dari organ otak, trakea, paru-paru, limpa, dan
proventrikulus menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan adanya aglutinasi
yang mengindikasikan bahwa ada pertumbuhan virus pada TAB yang dapat
mengaglutinasi darah.
Pada sampel ayam I didapati hasil titer antibodi 27 dan 26 pada sampel ayam
II dengan menggunakan serum yang diambil dari cairan alantois TAB yang
diinokulasi dari gerusan organ, bila dibandingkan dengan kontrol positif yang diberi
antigen Positif ND (New Castle Disease).
4.2 Saran
Sebaiknya dilakukan recording atau anamnesa yang lebih detail seperti mengenai umur
ayam, jenis, berat badan, sejak kapan muncul gejala klinis dan asal sebelum dijual di pasar
pada saat pengambilan sampel dilapangan. Ketelitian pada saat pengerjaan uji HI seperti
pada waktu pengenceran menggunakan mikropipet sebaiknya jangan sampai terdapat
gelembung pada yellow tip. Meningkatkan Biosafety pada saat pengerjaan isolasi dan
identifikasi virus seperti menggunakan masker, glove, dan memastikan meja kerja steril
dengan menggunakan lisol atau cairan antiseptik sebelum dan sesudah mengerjakan.

15
 DAFTAR PUSTAKA

Darmawi, Fakhrurrazi, Wiliana, Dewi. M., Abrar. M., Jamin. F., Manaf. Z. H. 2015. Deteksi
Antibodi Serum Ayam Kampung (Gallus Domesticus) terhadap Virus Newcastle Disease
di Kota Banda Aceh. Jurnal Medika Veterinaria. 9(1) : 5-8.

Direktorat Kesehata Hewan. 2014. Manual Penyakit Unggas Cetakan ke-2. Kementrian
Pertanian: Jakarta.

16