Penemuan Baru Pencegahan Migrain dengan Aimovig (Erenumab) Terapeutik,

Antibodi Pertama yang Disetujui-FDA terhadap Reseptor Protein G Ganda

ABSTRAK : Pada tahun 2018, Badan Pengawas Obat dan Makanan Amerika Serikat
(FDA) menyetujui Aimovig (erenumab) untuk pencegahan migrain. Erenumab adalah
terapi yang disetujui oleh FDA berupa antibodi terhadap reseptor G-protein ganda
yang merupakan reseptor kanonik peptida terkait gen kalsitonin (CGRP-R). Sebuah
antigen baru yang berfokus pada epitop dibuat untuk merekonstruksi domain
ekstraseluler CGRP-R dalam konformasi yang stabil. Inokulasi hewan XenoMouse
yang berhasil dan penyaringan yang cermat menghasilkan banyak kandidat molekul
berpotensi tinggi dengan selektivitas yang sangat baik terhadap CGRP-R
dibandingkan reseptor terkait lainnya. Upaya ini berujung pada penemuan dari
erenumab yang telah menunjukkan tingkat keampuhan dan keamanan pada banyak
studi klinis sebagai pencegahan migrain. Inovasi yang dikembangkan dalam
penemuan erenumab semakin meningkatkan kemampuan untuk menargetkan reseptor
protein G ganda dengan menggunakan pendekatan antibodi.

PENDAHULUAN
Migrain, penyebab utama kecacatan, menyerang hampir 15% dari populasi dunia dan
dikarakteristikkan dengan sakit kepala yang sangat berat, mual, dan peningkatan
sensitivitas terhadap cahaya dan suara. Selama ini, serangan migrain sulit untuk
dicegah dikarenakan kepatuhan berobat pasien yang buruk dan tidak responnya
sejumlah besar pasien terhadap obat yang diberikan, selain dari indikasi lainnya.
Untuk memenuhi kebutuhan tersebut, makanya Aimovig (erenumab) secara spesifik
didesain dan dikembangkan, menggunakan ekspertise biokteknologi Amgen.
Erenumab (erenuab-aooe kalau di Amerika Serikat) adalah satu-satunya antiobid
monoklonal (mAb) terhadap reseptor kanonik peptida terkait gen kalsitonin (CGRP)
oleh FDA. Obat ini poten dan spesifik terhadap target, secara klnis efektif dan dapat
ditoleransi oleh pasien. Dalam artikel ini, kami bermaksud untuk merangkum kunci
inovasi inovasi yang berujung pada penemuan agen ini.
ANTAGONISME RESEPTOR CGRP DAN MIGRAIN
Migrain adalah penyakit neurologis kompleks yang melibatkan sistem saraf
pusat dan perifer. Studi tentang interaksi saraf sensorik dan pembuluh darah kranial
dalam sistem trigeminovaskular mengungkapkan bahwa CGRP, sebuah peptida yang
merupakan poten vasodilator memiliki peran dalam sakit kepala yang terjadi selama
serangan migrain. CGRP adalah neuropeptida yang terdiri atas 37 asam amino (AA)
yang berikatan dengan beberapa GPCR berbeda dalam keluarga reseptor kalsitonin,
termasuk CGRP, amilin, kalsitonin dan reseptor adrenomedullin, dimana reseptor
CGRP menunjukkan afinitas tertinggi yang membuatnya kanonik. Reseptor CGRP
terdapat di kedua sistem saraf pusat dan perifer, begitu juga pada sel otot polos yang
mengeliling serebral, meningen dan arteri-arteri duramater. Kadar plasma CGRP
meningkat selama migrain baik dan dalam setelah pemberian triptan, agonis reseptor
serotonin 5- HT1B, 1D , dan dianggap sebagai standar terapi untuk migrain akut selama
beberapa dekade. Selain itu, infus CGRP intravena pada penderita migrain dapat
memicu serangan mirip migrain. Secara kolektif, data ini mendukung peran substantif
CGRP dalam patologi migrain dan antagonisme aksi CGRP dapat memberikan
manfaat.
Dengan ditemukannya peran utama jalur CGRP pada migrain, antagonis
dengan ukuran molekul kecil dari reseptor CGRP, yang dikenal sebagai "gepants",
kemduian dikembangkan. Beberapa gepants telah diuji di klinik, dan menunjukkan
efektifitas dalam membalikkan serangan migrain akut. Bukti klinis dari konsep ini
membuat terjadinya validasi lebih lanjut proses antagonisme CGRP dalam terapi
migrain.

PENGGUNAAN ANTIBODI DIBANDINGKAN MOLEKUL KECIL

Meskipun keampuhan dan profil keselamatan obat baik, gepant generasi
pertama memiliki keampuhan yang terbatas secara klinis akibat kekhawatiran
hepatotoksisitas apabila digunakan dalam jangka panjang. Pada tahun 2011,
perkembangan telcagepant, antagonis reseptor CGRP molekul kecil yang paling
advans telah dihentikan. Tempat aksi dari gepant awalnya diasumsikan pada sistem
saraf pusat. Bagaimanapun, perhitungan konsentrasi otak berdasarkan paparan klinis
yang efektif dan sifat fisik-kimiawi dari antagnois ini mengarahkan kesimpulan
bahwa efektifitas klinis cenderung lebih terjadi di perifer. Sehingga kami berhipotesis
bahwa antibodi antagonis restriktif perifer yang bekerja pada reseptor CGRP akan
efektif sebagai terapi migrain. Antibodi monoklonal memberikan beberapa
keuntungan dibandingkan molekul-molekul kecil yaitu tingkat afinitas yang tinggi,
spesifisitas tinggi (toksisitas lebih-target yang rendah) melalui ikatan dengan epitop
yang uni dan waktu prauh plasma yang diperpanjang membuatnya tidak
membutuhkan dosis berulang. Sebagai tambahan, paparan sistem saraf pusat yang
terbatas dapat mengurangi liabilitas potensial yang berkaitan dengan blokade respetor
CGRP sebelum mencapai sawar darah-otak. Pendekatan ini kemudian didukung oleh
data biodistribusi hasil pencitraan PET pada pasien migrain dengan dosis efektif
telcagepant yang menunjukkan antagonisme reseptor CGRP di perifer dan mampu
meredakan nyeri kepala migrain.

TANTANGAN DALAM MENARGETKAN RESEPTOR CGRP DENGAN

ANTIBODI
GPCR mewakili sekitar 35 % target dari obat-obatan yang sering diresepkan
dan disetujui oleh FDA. Disamping kemampuan terapeutik yang signifikan dalam
kelas target ini, tidak ada satupun obat yang bersifat antibodi terapeutik sebelum
disetujuinya Erenumab. Jarangnya antibodi terapeutik disebabkan oleh tantangan
teknis terkait pembuatan antibodi fungsional terhadap GPCR. Secara umum, tingkat
kesuksesan kampanye penemuan antibodi meningkat bersama dengan ketersediaan
bentuk antigen larut dan mempertahankan keakuratan struktural dan fungsional dari
antigen ini bersifat krusial. Hal ini sulit dalam kasus GPCRS kamereka menyimpan
domain transmembran multipel yang mengakibatkan stabilitas struktural mereka
bergantung pada lapisan lemak pada membran sel. Bnetuk GPCR terkait membrain
dengan panjang awal juga dapat digunakan untuk membuat antibodi, tetapi selama
ini, hal tersebut memiliki tingkat kesuksesan yang rendah karena karakteristik antigen
yang kurang imunogenik.
Untuk reseptor CGRP, terdapat tantangnan tambahan dimana respetor adalah
kompleks heterodimetrik dari reseptor mirip reseptor kalsitonin (CLR), GPCR kelas
B dan reseptor protein 1pemodifikasi aktifitas, protein transmembran tipe 1; kedua
protein dibutuhkan untuk pengikatan CGRP dan selanjutnya membentuk kompleks
dengan protein G heterotrimer yang merupakan protein transduser utama untuk
reseptor ini. Reseptor CGRP sangat berhubungan dengan reseptor adrenomedulin
(AM) dan amilin (AMY) dari kelompok keluarga reseptor kalsitonin, ditampilkan
dalam gambar 1. Dua komponen yang ditemukan dari reseptor CGRP, CLR dan
RAMPI secara individualis dapat ditemukan pada reseptor-reseptor AM1
(CLR+RAMP2), AM2 (CLRD+RAMP3) dan AMY 1(CTR+RAMP1). Reseptor-
reseptor tersebut menunjukkan sensitivitas terhadap CGRP; bagaimanapun, tidak ada
baik AM1 atau AMY1 yang dihubungkan ke patofisiologi migrain. Sebaliknya kadar
amilin di sirkulasi meningkat sebagai respon ingesti makanan dan peptida secara
poten menghambat pengosongan lambaung dan sekresi asam lambung, selagi
adrenomedullin telah menunjukkan interval kerja yang baik, mulai dari meregulasi
pertumbuhan dan diferensiasi seluler melalui sekresi hormon yang memodulasi,
hingga efek antimikroba. Indikasi-indikasi fungsional ini mengundang selektivitas
tinggi terhadap reseptor CGRP. Sehingga, komponen yang dibagikan antara reseptor-
reseptor terkaitmenampilkan tantangan tambahan dimana ikatan asimetrik dari
antibodi anatagonis hingga komponen salah satu sendiri dapat membuatnya kurang
dalam selektifitas.

DESAIN KRITERIA ANTIBODI TERHADAP RESEPTOR CGRP

Pada saat mendesain program kita, diketahui bahwa CGRP berinteraksi
dengan reseptor CGRP melalui dua regio yang berbeda, domain CGRP terminal C,
yang memiliki ikatan afinitias tinggi dan CGRP domain terminal N yang memiliki
efek agonis. Domain CGRP terminal C berinteraksi dengan regio ikatan afinitas
tinggi yang terbentuk pada ujung distal dari domain ekstraseluler CLR-RAMP1.
Domain CGRP terminal N memiliki aktifitas agonis melalui interaksi dengan regio
ikatan agonis klasik yang terbentuk pada reseptor CGRP oleh transmembran
alfaheliks dari CLR heterodimer dengan tidak adanya interaksi langsung dengan
RAMPI. Interval interaksi antara CGRP dan reseptornya menunjukkan strategi
alternatif dalam mendesain antibodi antagonis (1) blokade regio ikatan agnois dari
kemungkinan interkasi dengan CGRP terminal N. Strategi ini dapat merjung pada
inhibitor non-selektif karena tidak mengikutsertakan RAMP1 sebagaimana
ditunjukkan oleh antagonis molekul kecil yang berinteraski dalam regio
transmembran. (2) Secara langsung memblokade area ikatan afinitis tinggi sehingga
CGRP dihambat untuk berinteraksi dengan reseptor. Kami memutuskan bahwa
blokade regio ikatan afinitas tinggi seperti itu adalah strategi paling efektif dan epitop
terbaik akan menjadi regio ekstraseluler reseptor CGRP yang terdapat didalamnya
RAMP1 dan CLR sebagaimana kombinasi yang unik pada epitop ini cenderung
memberikan selektifitas antara reseptor AM dan AMY.
Suatu pertimbangan tambahan yang penting dalam desain strategi kami adlaah
CGRP harus memiliki afinitas tinggi dengan reseptor CGRP dengan konstanta
disosiasi ~15pM. Sehingga kami berharap dalam in vivo, antibodi dapat secara efektif
berikatan dengan reseptor dalam internval picomolar yang rendah.
Kriteria desain untuk anti reseptor CGRP, antagonis antibodi seterusnya akan
kaku dan membutukan solusi-solusi yang inovatif. Antibodi membutuhkan blokade
seluruh regio ikatan sepsifik dnegan reseptornya dan diikuti selektifitas reseptor
CGRP dibandingkan reseptor satu golongan lainnya, bersama dengan potensi tinggi
dan afinitas yang dibutuhkan untuk dapat bersifat terapeutik. Untuk mengatasi
tantangan ini, kami berfokus dalam mengembangkan imunogen baru dan spesifik
untuk mengadakan kampanye pneemuan antibodi skala besar.

DESAIN ANTIGEN TERBARU : REKONSTRUKSI DOMAIN

INTRASELULER RESEPTOR CGRP
Sebagai ambahan dalam persiapan imunogen seluler dan membran sel
konvensional, kami secara spesifik mendesain dan memproduksi protein imunogen
larut terbaru yang mengandung hanya domain ekstraseluler (EDCs) dari reseptor
CGRP, sembari menunggu hasil rekapitulasi struktur heterodimetrik uni dari reseptor
ini dan mengekspresikan berbarengan regio ekstraseluler baik CLR dan RAMP1.
Pencapaian heterodimer yang stabil secara struktural bersifat esentisal untuk
mewakili epitop heterodimetris unik untuk dilakukan imunisasi. Pendekatan kami
adalah untuk mengekspresikan tiap komponen ECD pasien sebagai protesin yang fusi
dengan fomain antibodi Fc. Domain Fc diharapkan dapat membentuk D-dimer ketiga
diekspresikan bersamaa untuk menilai CLR dan RAMP. Tambahan, regio
penghubung dimasukkan antara ECD dan domain Fc untuk menurunkan konstrain
rotasional pada ECD dan mempromosikan pertemuan tahunan natif dari CLR ataupun
RAMP1.
Dua komponen CLR ECD-Fc dan RAMP1 ECD-Fc, berbarengan
diekspresikan untuk membentuk protein heterodimer Fc. Faktor komplikasi dalam
memproduksi imunogen adalah dimerisasi domain Fc yang tidak terpenuhi. Proses ini
memproduksi tiga spesies: CLR ECD homodimer, RAMP-1 ECD homodimer dan
CGRP-R ECD-heterodimer. Penggunaan strategi purifikasi kromatograif membiarkan
pemisahan RAMP1-ECD-Fc homodimer yang lebih kecil, tapi CLR-ECD-Fc
homodimer dan heterodimer reseptor CGRP R-ECD-Fc tidak mampu secara total
dipisahkan karena similaritas ukuran keduanya. Secara umum, kami mengestimasikan
sampel akhir yang dipurifikasi sama dengan 40 % reseptor CGRP ECD-Fc dan 60 %
spesies homodimetrik.
Untuk menilai apakah reseptor CGRD ECD-Fc heterodimer yang dipurfikasi
parsial dengan rekapitulasi struktur ikatan dengan ligand, enzim dites untuk aktifitas
dalam pemeriksaan ikatan ligand CGRP berbasis FACS sel teraktivasi fluoresens.
Sampel CGRP ECD-Fc diinkubasi dan dilabeli dari CGRP (ALEXA-657 CGRP)dan
ditambahkan pada sel yang mengekspresikan rseeptor CGRP. Penurunan jumlah
ikatan CGRP ALEXA-647 dengan sel kemudian dikalkulasi dsebagai persentase
inhibisi. Kompleks ECD mendemonstrasikan inhibisi tergantung konsentrasi dari
pengikatan CGRP dengan reseptornya. Data ini membuktikan bahwa heterodimer
cenderung mereplikasi struktur area ikatan ligand reseptor CGRP naif antara CLR
dan RAMP1.
PENEMUAN ANTIBODI
Hewan XenoMouse adalah mencit galur transgenik yang memiliki gen
imunoglobulin manusia seluruhnya, digunakan dalam studi ini untuk membentuk
antibodi CGRP reseptor. Keuntungan antibodi manusia secara lengkap sebagai
molekul terapeutik memiliki resiko lebih rendah secara relatif dalam imungenisitas.
Untuk memastikan diversitas dan identifikasi kandidat kualitas tertinggi
dengan maksimal, kampanye dua generasi antibodi yan berjalan melalui XenoMause:
yang pertama kaan berinokulasi dengan imunogen CGRP-R ECD-Fc yang larut dan
kedua dengan kombinasi sel yang mengekspresikan CGRP-R dan persiapan membran
sel lagi sebagai imunogen.
Kampanye pertama berfokus pada protein imunogen larut dengan kumpulan
repertoire imun dari hewan yang paling merespon baik untuk pembentukan hibridoma.
Sekitar 100.000 klon hibridema ini disaring untuk daya ikatmenggunakan Chinesse
Hamster Ovary (CHO) secara stabil mengekspresikan R-CGRP dan sel CHO yang
secara stabil mengekspresikan reeptor AM1. Total 1092 hibridoma diidentifikasi
dengan ikatan selektif pada reseptor CGRP. Seluruh kasus hibridoma ini kemudian
disaring untuk kemampuan blokade jalur sinyal yang diinduksi CGRP dalam
pemeriksaan cAMP berbasis sel yang merupakan kunci kedua dalam aksi reseptor
CGRP. Aktifitas antagonis tiap hbridoma supernatant diekspresikan sebagai inhibisi
produksi cAMP dalam persen diinduksi oleh 1 nM CGRP. Mengenaik panel pengikat
spesifik reseptor CGRP, 28 % mencapai >50 % inhibisi pada pemeriksaan ini.
Kampanye dengan sel dan imunogen membran sel jauh lebih tidak produktif
dibandingkan membntuk upaya pengikat spesifik dan antagonis dibandingkan hasil
dengan reseptor CGRP ECD_Fc. Dalam kasus ini, sekitar 103.000 hibridoma disaring
dan total 119 pengklip dari reseptor CGRP tak dapat diidentifikasi. Panel pengikat ini
kemudian diskrining dengan pemeriksaan jalur sinyal CGRP menggunakan kondisi
yang sama dengan kampanye di atas yaitu hanya 2,5 % dari panel yang mencapai >50
% inhibisi dalam jalur sinyal CGRP.
Imunisasi hewan XenoMouse dengan protein CGRP-R ECD-Fc berbanding
dengan respon imun spesifik target dibandingkan dengan hasil dari imunogen natif
berbasis sel. Luaran yang berbeda dan dramatis dari kedua pemeriksaan penyaring
kampanye jelas mengindikasikan bahwa keuntungan dari strategi imunogen larut
berfokus epitop. Imunogen heterodimer CGRP-R ECD-Fc larut membentuk secara
signifikan respon imun yang lebih kuat dibandingkan hewan XenoMause, sehingga
membuat identifikasi panel pengikat spesifik ukuran 10 kali lipat lebih besar
dibandingkan kampanye skala menengah dengan imunogen seluler. Imunogen larut
juga mengangkat frekuensi antagnosis antibodi yang spesifik reseptor CGRP, sangat
penting dalam kesuksesan kampanye. Panel yang lebih besar ini membuat penyegaran
stringent dari kandidat-kandidat inti dari anatogonis selektif tinggi. Gambar 3
menyimpulkan terjadi selektifitas fungsional pada panel. Dalam penyaringan ini, set
paling poten dari antagonis 167 CGRP-R (>70 % inhibisi) dites untuk selektfitias
terhadap AMY1 dan AM1. Mayoritas kandidat adalah inaktif secara fungsional dalam
permasalahan terkait reseptor, mengindikasikan derajat tinggi selektifitas dan
keutungan dalam menggunakan imunisasi protein CGRP-R-ECD-Fc dan
mengumpulkan hampir seluruh panel inti dari antibodi kandidat.
Penyaringan throughput tinggi dilakukan dengan supernatan hibridoma
diidentifikasi oleh panel kandidat. Dari subset ini, kami membnetuk sampel antibodi
klonal dan dipurifikasi untuk menilai potensi. Data mengenai potensi dan selekiftas
data ditampilkan pada tabel 1 yang menyimpulkan seluruh profil aktifitas. Keempat
kandidiat ditunjukkan untuk memiliki konstanta disosiasi dalam interval pM dua
angka (dibandingkan hiperkalemia dari CGRP pada 20 pM ketika dites satu per satu
dalam studi ini, data tak ditampilkan) dan IC50s antagonis dalam interval nM satu
angka berada dalam pemeriksaan jalur sinyal cAMP berbasis sel. Kemudian,
pengikatan dan aktivitas antagonistik fungsional terlihat secara selektif sangat
meningkatkan reseptor CGRP manusia dibandingkan asal lain. Bila diambil
berbarengan, maka hasil ini mengindikasikan tujugan desain kita hari ini.

KONFIRMASI INTERAKSI HETEROMETRIK

Kami menyimpulkan bahwa kandidat obat antibodi yang diidentifikasi harus
berikatan dengan regio heterodimerik pada reseptor CGRP oleh CLR dan RAMP1.
Untuk mengetes hipotesis ini, kami melakukan pemeriksaan perlindungan protease
untuk menyusun regio2 pengkatan. Setelah membentuk map peptida disulfida oleh
CGRP-R ECD-Fc protein (metode dideskripsikan pada ref 31), peptida yang
diproduksi melalui digesti proteolitik menggunakan AspN (yang menghilang setelah
asam aspartat dan beberapa asam glutamat residual) dianlaisis oleh LC-MS untuk
menentukan sekuens dari fragmen peptida CLR dan RAMP1. Pemeriksaan proteksi
kemudian dilakukan dengan keberadaan anti reseptor CGRP. Perbedaan antara map
peptida mengindikasikan regio protein CGRP -R ECD Fc yang dilindung dari digesti
proteolitik oleh AspN ketika diikatkan dnegan antibodi anti CGRP R (metode
dideskripsikan pada ref 32). Hasil tiap studi seperti ini. Studi ini menunjukkan bahwa
fragmen peptida baik dari CLR dan RAMP1 yang dilindung oleh pengikatan antibodi
reseptor CGRP-Rdari digesti AspN. Analisis kami mengindikasikan bahwa CLR
memiliki area pembelahan multipel yang diproteksi oleh ikatan antibodi; ini termasuk
regio antara D55-P67/D86-H110, D8-Y24 dan E25-Q32/D48-N54. Pada RAMP1,
hasil mengindikasikan bahwa antibodi melindung beberapa tempat pembelahan,
termasuk regio antara D32-A44 dan E12-V20/D45-A51. Data tersebut, meskipun
dengan resolusi terbatas, memberikan bukti langsung bahwa regio pada CLR dan
RAMP1 terkait erat dengan antibodi anti-CGRP-R ketika terikat. Pengikatan antibodi
dengan kompleks unik CGRP-R ECD-Fc kemungkinan berkontribusi pada
spesifisitas atas reseptor terkait lainnya dalam keluarga reseptor.

KESIMPULAN
Dalam artikel ini, kami menyoroti inovasi utama yang mengarah pada penemuan
erenumab, terapi pencegahan untuk migrain. Dengan tujuan mengembangkan molekul
pertama di kelasnya, kami menghasilkan antagonis antibodi monoklonal yang
sepenuhnya manusia, sangat kuat dari CGRP-R manusia, GPCR kompleks yang secara
formal hanya ditargetkan oleh pendekatan molekul kecil. Desain terfokus Epitope dari
antigen spesifik mengarah ke panel kandidat antibodi dengan potensi dan spesifisitas
yang diinginkan. Uji klinis untuk erenumab menunjukkan keamanan dan kemanjuran
untuk pencegahan migrain episodik dan kronis.(33−36) Potensi tinggi dan spesifisitas
erenumab yang sangat penting adalah kunci dalam pengembangan yang sukses secara
klinis sebagai terapi antibodi pertama yang disetujui FDA untuk pencegahan migrain.
Inovasi yang diterapkan dalam penemuan erenumab semakin meningkatkan
kemampuan untuk menargetkan GPCR secara terapeutik menggunakan teknologi
antibodi. Kami menantikan penerapan strategi ini untuk pengembangan banyak agen
dalam waktu dekat.