TEKNIK-TEKNIK DALAM

BIOTEKNOLOGI

Vilya Syafriana, M.Si.

 TEKNIK-TEKNIK DALAM BIOTEKNOLOGI

 Isolasi DNA
 PCR
 Spektrofotometri
 Elektroforesis
 Digesti
 Sequencing
ISOLASI DNA
 Isolasi DNA

 Isolasi DNA adalah proses pemisahan DNA

dengan zat lain dari suatu sel (pengotor), sehingga
didapatkan DNA murni dari sel
 DNA adalah senyawa kimia yang terdapat dalam
nukleus yang memiliki karakteristik sebagai
pembawa materi genetik yang diwariskan dari
suatu organisme induk ke generasi – generasi
berikutnya
 DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun
di organel, seperti mitokondria dan kloroplas
 DNA yang terdapat di nukleus disebut DNA
kromosomal
 DNA yang di luar inti sel (seperti: di mitokondria,
kloroplas dan plasmid) disebut DNA ekstrakromosomal
 Tahapan isolasi DNA:
1. Ekstraksi/Pelisisisan: Memecahkan dinding sel dan
membran inti
2. Pemisahan DNA dari komponen lain
3. DNA harus dijaga agar tidak rusak dan didapatkan
DNA dalam bentuk rantai yang panjang
 Sentrifugasi :memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat
akan berada di dasar (pelet), sedangkan substansi
yang lebih ringan akan terletak di atas
(supernatan).
 Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam
sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi
dengan kecepatan yang bervariasi.
 Tahap Isolasi DNA: 1. Ekstraksi/Pelisisan
 Sel dilisiskan agar dapat mengeluarkan isi dalam sel
 Biasanya dilakukan dengan homogenasi dengan penambahan
buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak
 Pelisisan ini bergantung pada tipe sel
 Selbakteri: menggunakan lisozim. Bisa ditambah dengan
EDTA dan detergen (SDS). EDTA membantu stabilitas
membran luar bakteri dan juga menghambat kerja Dnase,
sedangkan detergen akan melarutkan lipid membran
 Tumbuhan dan Fungi: struktur dinding sel berbeda dengan
bakteri bisa dilakukan mekanisme mekanis atau enzimatik
 Hewan: menggunakan detergen yang lebih lembut
Tahap Isolasi DNA:
2. Pemisahan DNA dari pengotor
 Dilakukan dengan sentrifugasi
 Pemisahan DNA dengan RNA. Menggunakan Rnase.
Tahap ini ada yang menganggap perlu, ada yang
tidak
 Pemisahan dengan protein. Menggunakan fenol ata
fenol-kloroform. Setelah disentrifugasi protein akan
terdenaturasi dan akan mengendap.
Tahap Isolasi DNA: 3. Presipitasi DNA

 Menggunakan etanol absolut atau isopropanol

 Selain DNA, semua bahan yang lain akan larut
dalam etanol dingin, sehingga DNA akan
mengendap dan terpisah dari senyawa atau bahan
yang lain.
 Hal-hal yang dapat terjadi dalam proses
ekstraksi
 DNA patah-patah selama proses isolasi
 DNA terdegradasi oleh enzim nuklease
 Terjadi kontaminasi oleh polisakarida
 Metabolit sekunder ikut terisolasi
POLYMERASE CHAIN
REACTION
(AMPLIFIKASI DNA)
 Polymerase Chain Reaction

 Polymerase Chain Reaction adalah

pelipatangandaan segmen DNA dalam tabung
dengan bantuan enzim DNA Polimerase dalam
waktu singkat
 DNA template biasanya kurang dari 1000 bp.
 Primer untuk mengapit daerah spesifik pada
DNA yang akan diperbanyak, serta menginisiasi
replikasi DNA.
 Taq DNA polimerase
 PCR buffer untuk menjaga kestabilan ionik pH.
 Ion magnesium sebagai kofaktor dengan
mengkatalis reaksi.
 Deoksinukleosida Trifosfat (dNTP) berfungsi
untuk membentuk basa komplemen yang
tepat pada hasil cetakan DNA
 Thermal cycler adalah sebuah mesin yang
dapat diprogram untuk menaikkan dan
menurunkan suhu sesuai dengan urutan dan
waktu yang diinginkan
Tahap PCR:
1. Denaturasi
2. Annealing
3. Ekstensi
 1. Denaturasi

 Denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu

tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus
(denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal.
 Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak
lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua
berkas DNA terpisah.
 Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap
menjadi template bagi primer.
 2. Annealing atau Penempelan

 Tahap annealing atau penempelan. Primer

menempel pada bagian DNA template yang
komplementer urutan basanya.
 Dilakukan pada suhu antara 45–60 °C.
 Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak
tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan
atau primer menempel di sembarang tempat.
 Durasi tahap ini 1–2 menit.
 3. Ekstensi atau Pemanjangan

 Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 72 °C.

 Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
 Waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA
yang diinginkan sebagai produk amplifikasi

 Setelah tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1.

 Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau)
menjadi template bagi primer lain.
 Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang
dipakai.
 Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara
eksponensial
 Umumnya dilakukan 30-35 siklus
SPEKTROFOTOMETRI
 Spektrofotometri

 Teknik pengukuran konsentrasi zat terlarut dalam

suatu larutan secara kuantitatif
 Absorbansi adalah jumlah cahaya yang diserap
 Transmitan adalah persentase jumlah cahaya yang
dilewatkan
ELEKTROFORESIS
 Elektroforesis

 Teknik pemisahan molekul organik menggunakan

matriks gel agarosa sebagai medan listrik.
 Elektroforesis merupakan metode standar untuk
identifikasi, pemisahan, dan purifikasi fragmen DNA
Komponen-komponen dalam Elektroforesis
 Comb: membentuk well pada gel agarosa
 Tray: sebagai cetakan gel agarosa
 Chamber: sebagai wadah gel agarosa
 Sumber listrik: sebagai pemberi arus saat proses
elektroforesis
 Running buffer adalah buffer yang berfungsi sebagai
perantara arus listrik
 Loading buffer adalah buffer yang berfungsi sebagai
pemberat sampel pada gel
 Marka DNA adalah Fragmen DNA yang telah diketahui
ukurannya
Prinsip Kerja

 Phosphate groups of DNA is negatively charged at neutral pH.

 Amixture of DNA fragments is placed in a well in a porous gel,
and an electric field (with positive and negative ends) is applied
across the gel.
 Because opposite charges attract, the DNA fragments move
toward the positive end of the field.
 Since the porous gel acts as a sieve, the smaller molecules move
faster than the larger ones.
 After a fixed time, and while all the fragments are still in the gel,
the electric power is shut off.
 The separated fragments can be visualized by staining them with
a dye that fluoresces under ultraviolet light.
 Pewarna yang digunakan Etidium Bromida (EtBr)
 EtBr akan terikat di antara di antara dua untai ganda
DNA, sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan
berpendar karena pewarna ini mengandung zat
fluoresen.
 Ikatan DNA-EtBr akan terekspos pada sinar UV pada
panjang gelombang 300 nm.
Electrophoresis gives two types of information:
1. The sizes of the fragments. DNA fragments of known
molecular size are often placed in a well in the gel next to the
sample to provide a size reference.
2. The presence of specific DNA sequences. A specific DNA
sequence can be located by using a probe
 Faktor-faktor yang Mempengaruhi
Migrasi DNA:
 Konsentrasi Agarosa. Molekul besar (spt. genom
utuh) menggunakan agarosa 0,8%. Hasil amplifikasi
DNA 1,5-2%.
 Ukuran molekul DNA/RNA
 Voltase. Voltase 50 V walaupun lebih lambat tetapi
hasil pemisahannya lebih maksimal
 Suhu. Molekul DNA akan cepat terurai pada suhu
tinggi dan akan menyatu bila suhu mendingin.
DIGESTI DNA
 Digesti DNA

 Digesti merupakan pemotongan DNA pada situs

pengenalan oleh enzim endonuklease restriksi
 Enzim restriksi merupakan enzim yang dapat
memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik
yang jumlahnya terbatas
 Enzim ligase merupakan enzim utama dalam replikasi
dan perbaikan DNA
 Plasmid adalah suatu cincin kecil DNA berbentuk
sirkular yang membawa gen aksesoris yang terpisah
dari gen kromosom bakteri
 Langkah Digesti DNA

1,9 kb

Situs pemotongan
Endonuklease restriksi

1,9 kb

Situs pemotonganrestriksi
Endonuklease

5,5 kb
Aplikasi Digesti
1. Teknologi DNA rekombinan
insersi DNA asing ke dalam vektor
pengklonaan (vektor pengklonaan dapat
berupa plasmid, kosmid, fage, YAC)
2. Pembuatan pustaka genom
3. Analisis DNA
kloning sequencing
alternatif lain: PCR
NEVER FORGET!!!!!!!!!