LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

“PEWARNAAN BAKTERI”

Oleh :
Nama : Berlian Sari Pamungkas
NIM : 180210103071
Kelas :B
Kelompok :4

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN PENDIDIKAN MIPA
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS JEMBER
2020
I JUDUL
Pewarnaan Bakteri
II TUJUAN
2.1 Mampu mengetahui jenis – jenis bakteri
2.2 Mampu mengetahui jenis bakteri berdasarkan uji dan pewarnaan
III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
➢ Tabung reaksi
➢ Jarum ose
➢ Bunsen burner
➢ Rak tabung
➢ Pipet tetes
➢ Kaca benda
➢ Kaca penutup
➢ Kertas pengering
➢ Cawan petri
➢ Tusuk gigi
➢ Spidol
➢ Loop inokulum
➢ Mikroskop
3.1.2 Bahan
➢ Bakteri A, B, C (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan
Bacillus sp.)
➢ Alkohol 70%
➢ Aquades
➢ Tisu
➢ Pewarnaan sederhana : safranin, minyak emersi
➢ Pewarnaan gram : kristal violet, lugol, alkohol, dan safranin
➢ Pewarnaan negatif : tinta cina
➢ Pewarnaan endo spora : safranin, malachite green, immersion oil
 ➢ Pewarnaan KOH : reagen KOH 3%
3.2 Skema Kerja
3.2.1 Pewarnaan Gram

Menyiapkan sediaan bakteri

Menetesi dengan larutan kristal violet dan mendiamkannya selama 1

menit

Membilas dengan aquades

Memberi lugol

Membilas dengan aquades

Memberi alkohol 95% selama 30 detik

Membilas dengan aquades

 Memberi safranin dan diamkan selama 60 detik dan bilas dengan aquades

Mengeringkan dengan cara diangin – anginkan

Mengamati preparat di bawah mikroskop

3.2.2 Pewarnaan Sederhana

Membersihkan mikroskop slide menggunakan pensil marking Cina

untuk memberi label

Membuat lingkaran di tengah

Memberikan distilled water atau air mengalir pada slide

Melakukan sterilisasi ose dengan dipanaskan dengan bunsen

Mendinginkan dengan cara dianginkan, ketika sudah dingin

mentransfer koloni bakteri ke slide
Menggunakan ose untuk mencampur sel dan air sampai memenuhi
lingkaran

Mengeringkan dengan suhu ruang

Menandai dengan terlihatnya kabut putih tipis

Melakukan sterilisasi dengan melewatkan slide di atas api sebanyak

3 kali

Menuangkan safranin

Mengisi seluruh lingkaran dengan pewarna dengan pasti

Membiarkan pewarna selama 30 detik dengan lembut mencuci slide

dengan air mengalir
 Setelah slide benar – benar mengering, apusan akan terlihat seperti
kabut merah tipis

Mengamati di bawah mikroskop dari perbesaran rendah ke tinggi

3.2.3 Pewarnaan Endo spora

Menyiapkan sediaan bakteri dan memanaskan air di dalam beaker

glass di atas waterbath

Memanaskan dan meletakkan sediaan bakteri di atas beaker glass

Meletakkan paper towel di atas sediaan bakteri yang dipanaskan dan menetesi
dengan melachite green selama 5 menit dalam kondisi dipanaskan

Menunggu sampai mendidih kemudian mengangkat dari beaker

glass dan menunggu sampai dingin

Memindahkan paper towel dengan aquades lalu menyiram dengan

safranin dan mendiamkan selama 20 detik

Menyiram dengan aquades serta mengeringkan dengan pengering

 Mengamati di bawah mikroskop

3.2.4 Pewarnaan KOH

Menyiapkan alat dan bahan yang digunakan

Meneteskan sedikit reagen KOH 3% ke kaca benda

Menggunakan tusuk gigi untuk mengambil sel bakteri gram negatif

dari kultur murni

Mencampur dengan reagen yang terdapat di kaca benda dan

mengaduk hingga rata

Mengamati perubahan yang terjadi

Mengulangi langkah – langkah di atas menggunakan sel bakteri

gram positif dari kultur murni
 3.2.5 Pewarnaan Negatif

Menyiapkan sediaan bakteri

Memberi 1 tetes tinta cina

Menghapus tipis dengan kaca benda

Mengeringkan dengan cara diangin – angin

Mengamati preparat di bawah mikroskop dari perbesaran kecil ke

besar

IV HASIL PENGAMATAN
No Pewarnaan Hasil Keterangan

a. Pewarnaan Gram Negatif a. Pewarnaan gram

negatif berwarna
merah, bakteri
1 Pewarnaan Gram contaminated.
b. Pewarna gram
positif berwarna
b. Pewarnaan Gram Positif ungu
 Pewarna sederhana
Pewarnaan
2 akan berwarna
Sederhana
seperti haze merah

Pewarna endo spora,

spora berwarna hijau
Pewarnaan Endo
3 dan vegetatif
spora
berwarna merah /
pink
Pewarna KOH, untuk
4 Pewarnaan KOH menentukan jenis
suatu bakteri
Pewarna negatif,
bakteri akan terlihat
seperti unit
transparannya atau
tidak terwarna,
5 Pewarnaan Negatif
sementara latar
belakangnya
berwarna gelap
sebagai efek dari
pewarna

V PEMBAHASAN
Mikroorganisme atau mikroba merupakan organisme hidup yang
berukuran sangat kecil (diameter kurang dari 0,1 mm) dan hanya dapat diamati
dengan menggunakan mikroskop. Organisme yang termasuk ke dalam
golongan mikroorganisme adalah bakteri, archaea, fungi, protozoa, alga
mikroskopis, dan virus. Sebagian besar mikroorganisme tidak berwarna, maka
untuk dapat melakukan pengamatan di bawah mikroskop cahaya, diperlukan
pewarnaan mikroorganisme dengan pewarna tertentu. Pewarnaan
mikrooganisme pada dasarnya adalah prosedur mewarnai mikroorganisme
dengan zat warna yang dapat menonjolkan struktur tertentu dari
mikroorganisme yang ingin diamati (Padoli, 2016 : 3 – 14).
Terdapat beberapa macam pewarnaan bakteri antara lain pewarnaan
gram, pewarnaan sederhana, pewarnaan endo spora, pewarnaan KOH, dan
pewarnaan negatif. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode
empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni
gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel
mereka. Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram negatif
memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid)
kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan
safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram.
Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. Perbedaan
respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan
pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam presentase
lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada
praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam
sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif
sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel
berwarna ungu, yang merupakan warna dari Kristal Violet (Putri, dkk., 2017 :
317 – 318).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang menggunakan
pewarna tunggal. Pewarna tunggal yang biasanya digunakan dalam pewarnaan
sederhana adalah Methylene Blue, Basic Fuchsin, dan Crystal Violet . Semua
pewarna tersebut dapat bekerja dengan baik pada bakteri karena bersifat basa
dan alkalin (kromoforiknya bermuatan positif), sedangkan sitoplasma bakteri
bersifat basofilik (suka terhadap basa) sehingga terjadilah gaya tarik antara
komponen kromofor pada pewarna dengan sel bakteri, hal tersebut
menyebabkan bakteri dapat menyerap pewarna dengan baik. Pewarnaan
sederhana bertujuan untuk memberikan kontras antara bakteri dan latar
belakang. Pewarnaan sederhana dilakukan ketika kita ingin mengetahui
informasi tentang bentuk dan ukuran sel bakteri (Putri, dkk., 2017 : 313 – 314).
Pewarnaan Negatif adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna
asam seperti Negrosin, Eosin, atau Tinta India sebagai pewarna utama.
Pewarnaan negatif dilakukan pada bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna
sederhana seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif bertujuan untuk memberi
warna gelap pada latar belakang dan tidak memberi warna pada sel bakteri. Hal
tersebut dapat terjadi karena pada pewarnaan negatif, pewarna yang digunakan
adalah pewarna asam dan memiliki komponen kromoforik yang bermuatan
negatif, yang juga dimiliki oleh sitoplasma bakteri. Sehingga pewarna tidak
dapat menembus atau berpenetrasi ke dalam sel bakteri karena negatif charge
pada permukaan sel bakteri. Pada pewarnaan negatif ini, sel bakteri terlihat
transparan (tembus pandang) (Putri, dkk., 2017 : 316).
Endospora merupakan struktur tambahan dan bentuk kondisi inaktif
(dormant) dari bakteri, yang terbentuk di dalam sel dan memberikan
perlindungan terhadap bakteri dari lingkungan yang tidak menguntungkan.
Tidak semua bakteri dapat membentuk spora. Spora tidak dapat diwarnai
menggunakan pewarna pada umumnya (seperti pewarnaan sederhana atau
gram) karena pewarnaan tidak dapat masuk ke dalam dinding spora. Metode
pewarnaan yang sering digunakan untuk mewarnai spora adalah Schaeffer
Fulton (Murwani, 2015 : 69 – 70).
Pewarnaan Spora dilakukan pada umur biakan bakteri tidak lebih dari
dua hari. Apusan dibuat yang kemudian difiksasi, setelah itu permukaan apusan
ditutup dengan kertas serap yang ditetesi Malachite green kemudian ditaruh di
atas penangas air selama 5 menit. Setelah itu apusan dicuci dan ditetesi kembali
dengan safranin kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu dibilas
dengan air mengalir. Apusan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran
1000 kali dengan ditetesi minyak imersi terlebih dahulu (Nugroho, dkk., 2017
: 93 – 94).
Bakteri Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif, non motil,
berbentuk kokus yang anaerob fakultatif dan tidak membentuk spora. Suhu
pertumbuhannya berkisar antara 7ºC - 48ºC dengan pertumbuhan optimal
terjadi pada suhu 37ºC. Bakteri ini tumbuh pada kisaran nilai pH 9,3. Nilai pH
optimalnya 7,0 - 7,5. Kisaran nilai pH untuk pembentukan enterotoksin lebih
kecil dan toksin yang diproduksi akan lebih sedikit pada pH di bawah 6,0.
Bakteri Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri patogen dan
bakteri ini dapat digunakan sebagai indikator dari pengolahan makanan yang
tidak higienis, sehingga mampu menghasilkan enterotoksin yang dapat
langsung dideteksi dalam makanan. Toksin yang dihasilkan oleh bakteri
Staphylococcus aureus akan sulit dihilangkan walaupun makanan yang
tercemar toksin tersebut disimpan di dalam lemari es dan umumnya toksin
tersebut tahan terhadap pemanasan yang digunakan pada pemasakan. Hasil
pewarnaan Gram yang diamati dibawah mikroskop memperlihatkan bahwa
bakteri Staphylococcus aureus berwarna ungu, berbentuk coccus, bergerombol
menyerupai anggur dan bersifat Gram positif (Riski, dkk., 2017 : 371 – 372).
Bacillus sp. adalah bakteri antagonis terhadap beberapa patogen tular
tanah dan tular udara. B. subtilis merupakan salah satu spesies dari Bacillus sp.
yang potensial sebagai agens pengendali hayati. B. subtilis diketahui memiliki
potensi sebagai agens pengendali hayati beberapa patogen tumbuhan.
Kemampuan bakteri B. subtilis sebagai agens hayati berkaitan dengan
kemampuannya bersaing untuk mendapatkan nutrisi, menghasilkan senyawa
metabolit sekunder seperti antibiotik, siderofor dan enzim ekstraseluler. B.
subtilis diketahui dapat mengendalikan patogen Magnoporthe grisea,
Xanthomonas oryzae pv. oryzae dan R. solanacearum. Mekanisme
pengendalian antagonis B. subtilis adalah dengan persaingan atau kompetisi,
antibiosis, parasitisme dan lisis. Mekanisme penekanan dengan persaingan
ditunjukkan pada pengujian dengan jamur patogen yang dibiakkan secara
ganda dengan memperebutkan ruang, nutrisi, dan oksigen dengan melihat
perkembangan patogen dan antagonis. Mekanisme penekanan dengan
persaingan ditunjukkan pada pengujian dengan jamur patogen yang dibiakkan
secara ganda dengan memperebutkan ruang, nutrisi, dan oksigen dengan
melihat perkembangan patogen dan antagonis tersebut mana yang lebih cepat
memenuhi cawan petri dengan diameter 90 mm. Apabila masing-masing
antagonis mampu menghambat jamur maka bersifat fungistatik, dan apabila
mematikan patogen maka bersifat fungisidal (Wulansari, dkk., 2017 : 128).
Pengamatan terhadap bakteri sangat sulit bukan hanya karena
ukurannya yang kecil, juga karena strukturnya yang transparan dan tidak
berwarna. Kombinasi antara prosedur pewarnaan dan pencahayaan
mikroskopis menjadi alat utama pada bidang mikrobiologi untuk mempelajari
sifat dan mengelompokkannya ke dalam grup yang lebih spesifik. Beragam
teknik pewarnaan dapat digunakan untuk menggambarkan, membedakan dan
membagi bakteri ke dalam beberapa istilah morfologi dan struktur sel. Tipe
teknik pewarnaan yakni pewarnaan sederhana (simple staining) yang
menggunakan satu jenis zat warna untuk menggambarkan bentuk morfologi
dan formasi dari bakteri sedangkan differential staining menggunakan dua
jenis zat warna untuk membagi bakteri ke dalam kelas (pewarnaan gram) dan
untuk menggambarkan struktur bakteri (pewarnaan kapsul). Pewarnaan gram
ini membagi bakteri menjadi dua kelompok, yakni gram positif yang
menghasilkan warna ungu dan gram-negatif yang menghasilkan warna merah
muda. Bakteri tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya, hal inilah
yang menjadi penyebab bakteri sulit dilihat dengan mikroskop cahaya secara
langsung, oleh karena itu zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna ini mampu
mengadsorpsi dan membiaskan cahaya (Muthiah, dkk., 2017 : 36).
Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan bakteri gram positif
dan bakteri gram negatif. Bakteri di bumi dibagi menjadi 2, berdasarkan
struktur dinding selnya, yaitu bakteri gram negatif dan bakteri gram positif.
Bakteri gram positif dinding selnya tipis tapi peptidoglikannya tebal artinya
struktur dinding selnya tidak lengkap karena outer membran tidak banyak
mengikat lemak / karbohidrat. Gram negatif dinding selnya tebal akan tetapi
peptidoglikannya tipis sehingga struktur dinding selnya lengkap dan dapat
mengikat polisakarida (karbohidrat dan lemak). Peptidoglikanlah yang
membedakan bakteri menjadi gram positif atau gram negatif.
Setelah fiksasi, pemberian warna primer (kristal violet) akan masuk
dalam sel bakteri. Pada gram negatif kristal violet akan tertahan pada bakteri
gram, sedangkan gram positif hanya sampai bagian lipid saja. Pemberian lugol
berfungsi untuk memperkuat pewarna primer. Pemberian lugol pada gram
positif akan memperkuat kristal violet tertanam di sel bakteri. Alkohol 96%
digunakan untuk dekelorisasi (pelunturan warna). Pada gram positif, alkohol
tidak sampai masuk ke kristal violet karena tertahan peptidoglikan. Sedangkan
pada gram negatif, karena kristal violet tertahan di lipid, maka alkohol
melarutkan lipid sehingga kristal violet luntur terkena alkohol dan menjadi
transparan. Pada gram positif, safranin tidak dapat masuk karena di dalamnya
terdapat kristal violet sehingga sel tetap berwarna biru. Lain halnya dengan
gram negatif yang bisa menyerap safranin sehingga dinding sel berwarna
merah. Urutan warna bisa diganti, tetapi ditakutkan salah mengindikasikan
jenis bakteri gram, jadi lebih baik tidak perlu ditukar urutannya. Lugol dan
alkohol tidak bisa diganti urutannya karena sudah tepat mutlak.
KOH adalah basa kuat, suatu sel jika diberi konsentrasi berbeda maka
akan lisis sehingga materi genetik dan sitoplasma akan keluar dari dinding sel
yang menimbulkan lendir kental dari molekul DNA. Bakteri gram positif
punya dinding sel yang tebal (peptidoglikannya) sehingga KOH tidak bisa
 melisiskan kandungan pepyidoglikan yang tebal. Pada bakteri gram negatif
memiliki peptidoglikan yang tipis sehingga lipid bilayernya pecah / lisis jika
diberi KOH. Jika uji KOH diganti menggunakan asam kuat, maka hasilnya
akan sama karena konsentrasi yang lebih tinggi dari sel bakteri akan melisiskan
dinding sel bakteri tersebut. Namun penggunaan asam kuat lebih berbahaya
penggunaannya pada manusia. KOH 3% konsentrasinya sudah efisien untuk
melisiskan sel bakteri sehingga tidak perlu ditambah atau dikurangi.
Beberapa pewarna selain tinta cina dapat digunakan untuk pewarnaan
negatif karena pada dasarnya yang bisa digunakan adalah pewarna yang
bersifat asam (ion negatif). Pewarna ini akan bertemu sel bakteri yang sifatnya
asam kemudian terjadi tolak – menolak dan warna tidak masuk ke sel bakteri.
Pewarnaan negatif merupakan satu – satunya yang tidak difiksasi, karena
tujuannya untuk mengetahui motilitas bakterinya (bakteri hidup diberi
pewarna). Bakteri motil (bisa bergerak) akan terlihat ketika menggunakan
pewarnaan negatif.
Fungsi paper towel pada pewarnaan Endo spora adalah untuk menyerap
zat warna yang berlebihan pada kaca benda. Pada kondisi yang tidak
menguntungkan beberapa bakteri memproduksi bentuk pertahanan hidup yang
disebut endo spora. Proses ini dikenal dengan sporulasi. Pada bakteri sporanya
tidak mempunyai fungsi sebagai alat reproduksi. Endo spora ini tahan terhadap
kondisi lingkungan ekstrim seperti suhu yang tinggi, kekeringan, senyawa
kimia beracun (desinfektan, antibiotik) dan radiasi UV. Endo spora merupakan
fase tidur dari bakteri. Endo spora mampu bertahan sampai kondisi lingkungan
kembali menguntungkan. Endo spora kemudian membentuk proses germinasi,
dan membentuk bakteri sel tunggal.

VI PENUTUP
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk mempermudah pengamatan
morfologi bakteri supaya terlihat jelas, untuk mengetahui jenis – jenis bakteri,
berdasarkan uji dan pewarnaan. Jenis pewarnaan terdapat beberapa macam
antara lain pewarnaan gram, pewarnaan sederhana, pewarnaan endo spora,
pewarnaan KOH, dan pewarnaan negatif. Bakteri yang digunakan yaitu
Staphylococcus aereus, E.coli, dan Bacillus sp. Bakteri Staphylococucus
aureus memiliki bentuk bulat atau lonjong serta bergram positif.
 DAFTAR PUSTAKA
Murwani, Sri. 2015. Dasar – Dasar Mikrobiologi Veteriner. Malang : Universitas
Brawijaya Press.
Muthiah, H., W. Dewi, I. Sudjarwo. 2017. Pemanfaatan ekstrak etil asetat buah
merah sebagai zat warna primer pada teknik pengecatan negatif kapsul
bakteri. Jurnal Ked Gi Unpad. 29 (1) : 36.
Nugroho, F. L., D. Rusmaya, M. Damayanti. 2017. Identifikasi Mikroorganisme
pada EM1 dan Mudball (Dedak Padi, Tanah Liat dan EM1) yang
Digunakan Dalam Penjernihan Air Sungai Buatan. Infomatek. 19 (2) : 93
– 94.
Padoli. 2016. Mikrobiologi dan Parasitologi Keperawatan. Jakarta : Kementerian
Kesehatan Republik Indonesia.
Putri, M.H., Sukini, Yodong. 2017. Mikrobiologi. Jakarta : Kementerian Kesehatan
Republik Indonesia.
Riski, K., Fakhrurrazi, M. Abrar. 2017. Isolasi Bakteri Staphylococcus aureus pada
Ikan Asin Talang – Talang (Scomberoides commersonnianus) di Kecamatan
Leupung Kabupaten Aceh Besar. JIMVET. 01 (3) : 371 – 372.
Wulansari, N. K., N. Prihatiningsih, H. A. Djatmiko. 2017. Mekanisme Antagonis
Lima Isolat Bacillus subtilis Terhadap Colletotrichum capsici dan C.
gloeospoiroides In Vitro. Agrin. 21 (2) : 128.
 LAMPIRAN GAMBAR
➢ Lampiran Buku 1

➢ Lampiran Buku 2

➢ Lampiran Buku 3
➢ Lampiran Jurnal 1

➢ Lampiran Jurnal 2

➢ Lampiran Jurnal 3

➢ Lampiran Jurnal 4
➢ Lampiran Screenshot Video
1. Pewarnaan Gram

2. Pewarnaan Sederhana

3. Pewarnaan Endo spora

4. Pewarnaan KOH

5. Pewarnaan Negatif