PROPOSAL SKRIPSI

UJI EFEKTIFITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK BAWANG

DAYAK (Eleutherine americana Merr.)
TERHADAP Escherichia coli

Oleh

REZA ALFITRA MUTIARA

NIM. 061611133175

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2019
UJI EFEKTIFITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK BAWANG
DAYAK (Eleutherine americana Merr.)
TERHADAP Escherichia coli

Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan dokter hewan
Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga

Oleh :

REZA ALFITRA MUTIARA

NIM 061611133175

Menyetujui
Komisi Pembimbing

(Dr. E. Djoko Poetranto, drh., MS.) (Dr. A. T. Soelih Estoepangestie., drh.)

Pembimbing Utama Pembimbing Serta

ii
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

HALAMAN PEGESAHAN ................................................................................. ii
DAFTAR ISI ...................................................................................................... iii
DAFTAR TABEL .............................................................................................. vi
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... vii
SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG ........................................................... viii

BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ............................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah .......................................................................................... 2
1.3 Tujuan Penelitian ........................................................................................... 2
1.4 Landasan Teori .............................................................................................. 4
1.5 Manfaat Penelitian ......................................................................................... 5
1.6 Hipotesis ........................................................................................................ 5

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 6

2.1 Bawang Dayak ............................................................................................... 6
2.3 Escherichia coli ............................................................................................. 8
2.4 Ekstraksi ..................................................................................................... 14
2.4.1 Tujuan Ekstraksi................................................................................ 14
2.4.2 Metode Ekstraksi ............................................................................... 15
2.5 Tinjauan Tentang Antibakteri ...................................................................... 18
2.6 Pengukuran Efek Antimikroba Melalui Tes Sensitivitas .............................. 20
2.6.1 Kadar Hambat Minimum (KHM)/Minimal Inhibitory Concentration
(MIC) ................................................................................................ 21
2.6.2 Kadar Bunuh Minimum (KBM)/Minimal Bactericidal Concentration
(MBC) ............................................................................................... 22

iii
BAB 3 METODE PENELITIAN ....................................................................... 23
3.1 Rancangan Penelitian ................................................................................... 23
3.2 Sampel ......................................................................................................... 23
3.3 Variabel Yang Diamati................................................................................. 23
3.4 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................................... 24
3.5 Alat Penelitian............................................................................................. 24
3.6 Bahan Penelitian .......................................................................................... 24
3.7 Diagram Alir ................................................................................................ 26
3.8 Prosedur Penelitian ...................................................................................... 27
3.8.1 Persiapan Penelitian ........................................................................... 27
3.8.1.1 Sterilisasi Peralatan Penelitian ............................................... 28
3.8.1.2 Pembuatan Simplisia Umbi Bawang Dayak ........................... 28
3.8.1.3 Pembuatan Ekstrak Umbi Bawang Dayak .............................. 28
3.8.2 Isolasi dan Identifikasi ........................................................................ 29
3.8.2.1 Pewarnaan Gram ................................................................... 29
3.8.2.2 Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) ....................................... 30
3.8.2.3 Tiple Sugar Iron Agar (TSIA) ................................................ 30
3.8.2.4 Uji Urea ................................................................................. 31
3.8.2.5 Uji Sulfide Indol Moyility (SIM) ............................................. 31
3.8.2.6 MR-VP medium ..................................................................... 32
3.8.2.7 Uji Simon Citrat Agar ............................................................ 33
3.8.2.8 Uji gula-gula .......................................................................... 33
3.8.2.9 Pembuatan Suspensi Bakteri ................................................... 33
2.7.3 Pelaksanaan Penelitian ....................................................................... 34
3.7.3.1 Penentuan Minimal Inhibitory Concentration (MIC) .............. 34
3.7.3.2 Penentuan Minimal Bactericidal Concentration (MIC) ........... 35
3.8 Analisis Data................................................................................................ 36

iv
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 37

v
 DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2.1 Tabel perbandingan kandungan susu sapi, susu kambing, dan air susu
ibu.......................................................................................................... 14
2.2 Standar Mutu Susu Kambing Segar ........................................................ 14
2.3 Karakteristik Biokimia Enterobacteriaceae ............................................ 23

vi
 DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Umbi bawang dayak (Eleutherine americana Merr).............. ................... 8

2.2 Kambing Peranakan Etawa ..................................................................... 11

2.3 Escherichia coli ...................................................................................... 22

vii
 SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG

BJ : Berat Jenis
CFA : Coloni Fimbrial Antigens
CIT : Citrat
DNA : Deoxyribo Nucleic Acid
EAEC : Enteroagregrative Escherichia coli
EHEC : Enterohaemoragic Escherichia coli
EIEC : Enteroinvasive Escherichia coli
EMBA : Eosin Methylen Blue
EPEC : Enteropathogenic Eschericia coli
GAP : Good Agriculture Practice
IND : Indol
KBM : Konsentrasi Bunuh Minimum
KHM : Konsentrasi Hambat Minimum
LT : The heat-Labile
MBC : Minimum Bactericidal Concentration
MIC : Minimum Inhibitory Concentration
MNT : Monitol
MOT : Motil
MR-VP : Metil Red – Voges Proskaver
NaCl : Natrium Cloride
PAD : Plat Agar Darah
PBS : Phospate Buffer Saline
PE : Peranakan Etawa
PFH : Peranakan Friesian Holstein
RNA : Ribonucleic Acid
SIM : Sulphide Indol Motility
SPSS : Statistical Product and Service Solutions
ST : The Heat-Stable
TSIA : Triple Sugar Iron Agar

viii
 BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Escherichia coli merupakan flora normal pada saluran pencernaan tetapi

memiliki potensi menimbulkan penyakit pada manusia. Escherichia coli menjadi

patogen jika jumlahnya dalam saluran pencernaan meningkat, juga saat sistem

kekebalan rendah (Jawetz dkk., 2013). Penelitian lain menunjukkan bahwa

Escherichia coli merupakan jenis kuman paling banyak yang diisolasi dari sampel

feses pasien yang menderita diare (Fazeli dan Salehi, 2007). Escherichia coli juga

digunakan sebagai salah satu indikator kontaminasi dan kualitas sanitasi dari

peternakan dan produsen produk.

Pemberian antibiotik biasa dilakukan untuk mengurangi kejadian penyakit

yang disebabkan oleh bakteri termasuk yang disebabkan oleh bakteri Escherichia

coli. Penggunaan antibiotik dapat menyebabkan masalah baru dalam dunia kesehatan,

yaitu adanya resistensi pada antibiotik. Selain karena resistensi, penggunaan

antibiotik memerlukan biaya yang belum tentu dapat dicapai oleh masyarakat umum

(Rahardjo dkk., 2017).

Berdasarkan hal tersebut penulis ingin memberi solusi alternatif dengan

memanfaatkan ekstrak etanol bawang dayak (Eleutherine americana Merr.). Bawang

ini merupkan salah satu jenis bawang yang ditemukan di hutan pedalaman

Kalimantan dan masih belum banyak diketahui masyarakat secara luas (Nisa Naspiah,

2014). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Chairul Saleh (2010), umbi

bawang tiwai mengandung banyak senyawa fitokimia, beberapa diantaranya

1
 2

berfungsi sebagai antibakteri seperti senyawa flavonoid, alkaloid, tanin, fenolik, dan

triterpenoid diketahui menunjukkan sifat sebagai antibakteri (Mierza dkk., 2011).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektivitas ekstrak etanol umbi bawang dayak

(Eleutherine americana Merr.) dalam menghambat pertumbuhan, serta membunuh

Escherichia coli yang diisolasi dari susu kambing Peranakan Etawa.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas maka rumusan masalah yang dapat

diajukan:

1. Apakah ekstrak bawang dayak (Eleutherine americana Merr.) bersifat

antibakterial terhadap bakteri Escherichia coli ?

2. Berapakah konsentrasi terendah ekstrak bawang dayak (Eleutherine

americana Merr.) dalam menghambat bakteri Escherichia coli?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah :

1. Untuk mengetahui apakah ekstrak bawang dayak (Eleutherine americana

Merr.) bersifat antibakterial terhadap bakteri Escherichia coli.

2. Untuk mengetahui konsentrasi terendah ekstrak bawang dayak

(Eleutherine americana Merr.) dalam menghambat bakteri Escherichia

coli.
 3

1.4 Landasan Teori

Escherichia coli merupakan flora normal pada saluran pencernaan tetapi

memiliki potensi menimbulkan penyakit pada manusia. Escherichia coli menjadi

patogen jika jumlahnya dalam saluran pencernaan meningkat, juga saat sistem

kekebalan rendah (Jawetz dkk., 2013). Escherichia coli juga digunakan sebagai salah

satu indikator kontaminasi dan kualitas sanitasi dari peternakan dan produsen produk.

Adanya bakteri E. coli dapat diketahui dengan melakukan pemeriksaan

laboratorium. Pemeriksaan laboratorium dilakukan penelitian dan uji dalam media

untuk membuktikan adanya bakteri E. coli yang diduga terdapat di susu kambing.

Pengujian laboratorium yang biasa dilakukan adalah Plat Agar Darah (PAD), Eosin

Methylene Blue (EMBA), Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Urea Agar, Sulphide Indol

Motility (SIM), MR-VP, Simon Cytrat Agar, Uji Gula (glukosa, laktosa, sukrosa,

maltosa, dan manitol). Media untuk menguji keberadaan E.coli sangat higienis dalam

segi biaya dan waktu (Baehaqi dkk., 2015).

Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif tahan hidup dalam

media yang kekurangan zat gizi (Rahayu, 2000). Susunan dinding sel bakteri Gram

negatif memiliki struktur dinding sel yang lebih komplek daripada sel bakteri Gram

positif. Bakteri Gram negatif mengandung sejumlah besar lipoprotein,

lipopolisakarida dan lemak (Schlegel, 1993). Adanya lapisan-lapisan tersebut

mempengaruhi aktivitas kerja dari zat anibakteri. Terdapatnya lapisan protein pada

permukaan bakteri menyebabkan zat antibakteri kesulitan melakukan penetrasi

kedalam sel bakteri Escherichia coli.

 4

Tanaman bawang dayak mempunyai nama ilmiah Eleutherine americana

Merr. Tanaman bawang dayak telah diteliti beberapa kali dan terbukti berperan

sebagai antioksidan, aktivitas tabir surya, antiinflamasi, antiagregasi platelet,

antidiabetes, antibakteri, antifungi, antiamoeba, toksisitas subakut, antikanker

(Naspiah dkk., 2014). Di dalam umbi bawang dayak terkandung beberapa senyawa

fitokimia penting khususnya jika digunakan sebagai antibakteri seperti flavonoid,

saponin, tanin, fenolik dan triterpenoid (Mierza dkk., 2011).

Saponin dan tanin memiliki sifat antiseptik untuk penyembuhan luka pada

permukaan dan dapat digunakan sebagai bakteriostatik yang biasa digunakan untuk

infeksi kulit, mukosa dan melawan infeksi pada luka (Mursito, 2002). Tanin dapat

mengkerutkan membran sel bakteri yang mengakibatkan perubahan permeabilitas sel

itu sendiri, akibatnya aktivitas hidup terganggu dan akhirnya mati.

Fenol berfungsi sebagai antibakteri dengan cara mendetursi protein sel dan

merusak membran plasma bakteri (Herrera dkk., 2004). Fenol berikatan dengan

protein melalui ikatan hidrogen sehingga mengakibatkanstruktur protein menjadi

rusak. Sebagian struktur dinding sel dan membran sitoplasma bakteri menyebabkan

fungsi permeabilitas selektif, fungsi pengangkutan aktif, pengendalian susunan

protein dari sel bakteri menjadi terganggu. Gangguan integritas sitoplasma berakibat

pada lolosnya makromolekul dan ion dari sel. Sel bakteri menjadi kehilangan

bentuknya dan terjadilah lisis. Persenyawaan fenol bersifat bakteriositik atau

bakterisid tergantung dari konsentrasinya (Pelezar dan Chan, 1988). Kematian sel
 5

bakteri berarti hilangnya kemampuan bakteri secara permanen untuk beeproduksi

(tumbuh dan membeah) (Susanti, 2008).

Flavanoid berfungsi sebagai derivat fenol. Fungsi dari flavonoid dapat

mengganggu dan menyebabkan rusaknya susunan dan perubahan mekanisme

permeabilitas dari dinding sel bakteri (Handayani dan Tendelilin, 2006). Alkoloid

memiliki mekanisme penghambat dengan cara mengganggu komponen penyusun sel

bakteri yaitu peptidoglikan, sehingga lapisan sek tidak terbentuk secara utuh dan

menyebabkan kematian sel tersebut (Handayani dan Tendelilin, 2006). .

1.5 Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan bisa memberikan informasi terhadap

manfaat ekstrak umbi bawang dayak (Eleutherine americana Merr.) dan dijadikan

sebagai obat alternatif pada penyakit yang disebabkan oleh bakteri Escherichia coli.

1.6 Hipotesis

Berdasarkan landasan teori tersebut, dapat di ambil hipotesis sebagai berikut:

1. Pada susu kambing Peranakan Etawa terdapat bakteri Escherichia coli.

2. Ekstrak bangang dayak (Eleutherine americana Merr.) bersifat

menghambat dan membunuh bakteri Escherichia coli.

 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bawang dayak

Bawang dayak (Eleutherine americana Merr.) adalah salah satu tanaman yang

banyak dikenal oleh masyarakat dayak sebagai tanaman obat tradisional. Umbi dari

tanaman ini dikonsumsi sebagai obat dalam bentuk basah ataupun sudah dikeringkan.

Tanaman ini dapat dijadikan sebagai obat penyakit disuria, radang usus, disentri,

penyakit kuning, luka, bisul, diabetes melitus, hipertensi, menurunkan kolesterol, dan

kanker payudara (Galingging, 2009).

Secara taksonomi, tanaman bawang dayak memiliki jalur klasifikasi yaitu:

Kingdom : Planteae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida (Monocots)
Subkelas : Liliidae
Ordo : Liliales
Famili : Iridaceae
Genus : Eleutherine
Spesies : Eleutherine americana Merr. (Naspiah dkk., 2014)

Bawang tiwai atau bawang dayak (Eleutherine americana Merr) merupakan

tanaman semusim sejenis bawang-bawangan, yang tumbuh liar dipedalaman hutan

Kalimantan. Dalam waktu enam bulan umbi bawang tiwai telah dapat diambil dengan

tinggi tanaman sekitar 30-40 cm dan lebar sekitar 1,5-3 cm (Mangan, 2005).

Tanaman ini menyukai tempat-tempat yang terbuka yang tanahnya kaya akan humus

dan lembab (Nirmala dkk., 2007). Bawang tiwai merupakan tanaman yang tumbuh

berumpun atau bergerombol, berbatang basah, dan tingginya mencapai 50 cm. Umbi

bawang tiwai bebentuk bulat telur, panjang, berwarna merah, dan tidak berbau serta

6
 7

dapat dilihat pada Gambar 2.1. Daun tanaman ini berwarna hijau dengan bunga

berwarna putih yang biasa mekar pada sore hari selama beberapa jam (Tim

Agromedia, 2008).

Gambar 2.1 Umbi bawang dayak (Eleutherine americana Merr)

Sumber: Paramita dan Nuryanto (2018)

Bawang ini berasal dari Amerika Tropis dan memiliki berbagai nama daerah.

Bawang dayak (Palangkaraya dan Samarinda); bawang lubak (Samarida); bawang

sebrang, bawang kapal (Sumatra); babawangan beureum, bawang siyem (Sunda);

bawang siyem, brambang sabrang, teki sabrang, luluwa sapi (Jawa); bawang sayup

(Melayu) (Utami dan Ervira, 2013).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Chairul Saleh (2010), umbi

bawang tiwai mengandung senyawa fitokimia berupa triterpenoid, flavonoid, dan

fenolik. Kandungan metabolit sekunder yang terdapat dalam bawang tiwai terdiri atas

senyawa alkaloid, glikosida, falvonoid, fenolik, steroid, tanin (Mierza dkk., 2011;
 8

Noorcahyati, 2012), antrakuinon, saponin dan azulen (Mierza dkk., 2011; Nascimento

et al., 2012). Beberapa kandungan diantaranya seperti senyawa flavonoid, alkaloid,

tanin, fenolik, dan triterpenoid diketahui menunjukkan sifat sebagai antibakteri

(Mierza dkk., 2011). Bawang dayak mengandung berbagai senyawa aktif meliputi

naphtoquinonen dan turunannya, seperti elecanacine, eleutherine, eleutherol,

eleuthernone. (Utami dan Ervira, 2013).

Bawang dayak pertama kali digunakan sebagai antikanker dan penurun kadar

kolesterol darah. Efeknya sebagai antidiabetes baru diketahui belakangan ini, selain

itu bawang dayak juga menggandung senyawa antioksidan yang sangat tinggi.

Bawang dayak mengandung senyawa allicin dan alkaloid yang bersifat hopoglikemik

alias mampu menurunkan kadar gula dalam darah. Kandungan allicin dalam bawang

dayak juga dipercaya dapat menurunkan tekanan darah dan mengurangi kekentalan

darah (Utami dan Mardiana, 2013). Secara empiris bawang dayak sudah

dipergunakan masyarakat lokal sebagai obat berbagai jenis penyakit seperti kanker

payudara, obat penurun darah tinggi (Hipertensi), penyakit kencing manis (diabetes

melitus), menurunkan kolesterol, obat bisul, kanker usus dan mencegah stroke

(Galingging, 2009).

2.3 Escherichia coli

Escherichia coli adalah salah satu bakteri dari kelompok coliform, yakni flora

normal yang terdapat pada sistem pencernaan manusia dan hewan. Escherichia coli

pertama ditemukan oleh Theodor Escherich pada tahun 1885 sebagai Bacterium coli
 9

commune yang diisolasi dari feses bayi (Pumomo, 2011). Escherichia coli

merupakan flora normal pada saluran pencernaan, maka secara luas bakteri E. coli

digunakan sebagai indikator terkontaminasinya feses. Escherichia coli dikenal

sebagai penyebab kebanyakan kasus diare dan penyakit lain terkait bawaan melalui

kontaminasi makanan (Althalhi, 2009). Salah satu Escherichia coli yang patogenik

pada manusia dan hewan adalah verotoxic E. coli O157:H7 (Kusumaningsih, 2013).

Klasifikasi dari Escherichia coli, yaitu:

Filum : Proteobacteria
Kelas : Schizomycetes
Ordo : Eubacterialis
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies: Escherichia coli (Quinn, dkk., 2007).

Escherichia coli termasuk bakteri Gram Negatif, tidak tahan asam, tidak

membentu spora, berukuran 2-3 x 0,6 µm, mempunyai flagella peritrikus, morfologi

koloni sirkuler, konveks, dan halus, memfermentasi laktosa dan sukrosa, serta

memproduksi hemolisin. E.coli dapat tumbuh pada kisaran suhu antara 10˚ - 46˚C,

namun optimum pada suhu 37˚C (Howard dkk., 1997). Menurut Quinn dkk., (2007),

koloni Escherichia coli yang tumbuh memiliki bentu bulat, halus, cembung, dan

berwarna merah-hitam (dapat dilihat pada Gambar 2.3), hijau mengkilap atau biru

kehitaman sampai coklat dengan pendar methalic sheen pada media Eosin methylene

blue agar (EMBA). Fermentasi laktosa dan sukrosa menyebabkan koloni pada

EMBA berwarna gelap karena MB-eosinate terpresipitasi oleh koloni yang

memfermentasikan laktosa dan sukrosa tersebut. E. coli memfermentasi glukosa,

 10

laktosa, dan sukrosa, dapat memproduksi gas, tidak memproduksi , serta

memberikan hasil positif pada uji indol, motilitas, dan Methyl Red, dan negatif pada

uji Vegas Proskauer dan sitrat.

Gambar 2.3 Escherichia coli

Sumber: Khotimah (2016)

Tabel 2.3 Karakteristik Biokimia Enterobacteriaceae

Enterobacteruaceae IND MR VP CIT MOT GAS MNT SUK SRT
Eschericia coli + + - - + - + + V +
Klebsiella (-) (-) + + - - + + + +
Enterobacter - - + + + - + + + +
Proteus V + (-) V + + + - V -
Salmonella - + - + + + + + - +
Sumber: Journal Clinical and Phathogenic Microbiology (Howard, dkk., 1987)
Keterangan :
+ : Mayoritas positif ( ≥ 90%)
V : Variabel ( 26% - 74%) positif
(-) : Banyak strain negatif (11% - 25%)
- : Mayoritas negatif ( ≤ 10% )
IND : Indol
MR : Methyl red
VP : Voges-Proskauer
GAS : Produksi gas
CIT : Citrat
MOT : Motility
SUK : Sukrosa
S : Produksi S pada TSI
 11

Escherichia coli secara garis besar dapat dikelompokkan menjadi beberapa

strain yang diklasifikasikan berdasarkan sifat karakteristik virulensinya, yaitu

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Enterotoksigenik Escherichia coli

(ETEC), Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Enteroaggregative

Escherichia coli (EAEC), Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC). Setiap kelompok

Escherichia coli menyebabkan penyakit dengan mekanisme yang berbeda-beda

(Poolman, 2017).

Enterophatogenic E. coli (EPEC). Kelompok EPEC merupakan penyebab

terjadinya diare yang melekat pada sel mukosa usus halus. Kelompok EPEC ini

menyebabkan usus kehilangan mikrovili, pembentukan filaentous actin atau struktur

seperti cangkir yang biasanya EPEC masuk ke dalam mukosa. Akibat dari infeksi

EPEC adalah diare yang cair dan biasanya susah diatasi namun tidak bersift kronis.

Diare EPEC berhubungan dengan berbagai serotipe spesifik dari E. coli. Straiin

diidentifikasikan dengan antigen O dan seringkali dengan antigen H. Waktu diare

EPEC dapat diperpendek dan diare kronis dapat disembuhkan dengan pemberian

antibiotik (Brooks dkk., 1995). Menurut World Health Organization terdapat 12

serogoups dari EPEC, yaitu O26, O55, O86, O111, O114, O114, O119, O125, O126,

O127, O128, O142 dan O158.

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) sering menjadi penyebab utama

diare berair dan dehidrasi, banyak menyerang anak-anak di dunia yang mengalami

keterbatasan sumber daya. Organisme ini juga diidentifikasi sebagai sumber wabah

yang ditularkan melalui makanan di dunia. Enterotoxigenic Escherichia coli juga

 12

menyebabkan morbiditas dan mortalitas yang signifikan pada hewan muda, terutama

anak babi dan anak sapi. Enterotoxigenic Escherichia coli menghasilkan diare

sekretorik dan harus terlebih dahulu menginvasi usus kecil tempat racun sekretori

bekerja. Hal ini terjadi akibat pengkodean dari produksi koloni fimbrae ( CFA) yang

berikatan dengan reseptor pada eritrosit usus kecil atau dalam musin usus halus.

Eschericia coli menghasilkan CFA tetapi tidak ada racun yang mampu menginvasi

usus kecil sehingga kecil kemungkinannya untuk menyebabkan penyakit diare.

Enterotoxigenic Escherichia coli menghasilkan dua kelas utama toksin sekretori,

yaitu Enterotoksin kolera tidak tahan panas atau LT dan Enterotoksin kolera tahan

panas atau ST yang dikodekkan pada plasmid dan yang digunakan untuk identifikasi

strain ETEC (T Poolman, 2017). Enterotoksin yang labil terhadap panas ini bersifat

antigenik dan merangsang produksi penetralan antibodi dalam serum, sedangkan

Enterotoksin yang stabil mengaktifkan guanil cyclase dalam sel epitelia enterik dan

merangsang pengeluaran cairan (Brooks et al., 1995).

Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) sering dikaitkan dengan penyakit

diare akut dan persisten pada anak-anak yang mengalami keterbatasan sumber daya

dan pada pasien dengan HIV. Enteroaggregative Escherichia coli menyebabkan

penyakit diare melalui perlekatan pada enterosit, organisme-organisme ini pada

awalnya dikenali oleh cascading mereka yang khas, keterlibatan sel-sel dalam kultur

jaringan akan membentuk biofilm tebal. Enteroaggregative Escherichia coli

mengekspresikan keterlibatan agregat fimbriae 1 dan 2 (AAF I dan AAF II).

Enteroaggregative Escherichia coli terkait dengan penyakit diare. Gen untuk fimbrae
 13

ini dikodekan dengan virulensi pada plasmid. Enteroaggregative Escherichia coli

adalah kelompok heterogen dan beberapa strain telah diisolasi. Strain EAEC unik

yang mengekspresikan toksin Shiga (O104: H4) (Poolman, 2017).

Enteroaggregative Escherichia coli melekat pada mukosa intestinal dan

menghasilkan enterotoxin dan sitotoksin (Brooks et al., 1995).

Enterohemorragic Escherichia coli (EHEC) menyebabkan berbagai penyakit

mulai dari diare berair hingga diare berdarah (Poolman, 2017). EHEC memproduksi

verotoksin yang dinamakan berdasarkan efek sitotoksin pada sel vero. Kelompok

EHEC banyak dihubungkan dengan hemoragik kolitis, sebuah bentuk diare yang

parah, dan dengan sindrom uremik hemolitik, mikoangiopathi hemolitik anemia dan

trombositopenia (Brooks et al., 1995). Strain EHEC yang pertama diidentifikasi

adalah O157: H7 yang sejak itu telah terlibat dalam berbagai wabah yang terdapat

pada makanan. Strain EHEC non O157 kemungkinan sama ganasnya (Poolman,

2017).

Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) menyebabkan penyakit diare yang

tidak dapat dibedakan dengan shigellosis dan tampaknya menjadi penyebab penyakit

diare yang kurang umum dibandingkan dengan Escherichia coli patogen lainnya.

Enteroinvasive Escherichia coli diperkirakan menyebabkan sebagian besar kasus

penyakit diare yang sporadis. Kelompok EIEC memfermentasi laktosa dengan lambat

atau tidak memfermentasi laktosa dan tidak motil. Patogenesis EIEC terjadi

memasuki usus dan berkembang biak secara intraseluler dan meluas ke sel-sel usus
 14

yang berdekatan serta menyebabkan kematian sel dan terkadang terjadi diare

berdarah (Poolman, 2017).

2.4 Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif

dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua

atau hampir semua pelarut diuapkan (Dirjen POM, 2000). Ekstraksi merupakan

proses pemisahan bahan dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai.

Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai keseimbangan antara konsentrasi senyawa

dalam pelarut dengan konsentrasi dalam sel tanaman. Setelah proses ekstraksi, pelarut

dipisahkan dari sampel dengan penyaringan. Ekstrak awal sulit dipisahkan melalui

teknik pemisahan tunggal untuk mengisolasi senyawa tunggal, oleh karena itu ekstrak

awal perlu dipisahkan kedalam fraksi yang memiliki polaritas dan ukuran molekul

yang sama (Dirjen POM, 2000).

2.4.1 Tujuan Ekstraksi

Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik dan memisahkan senyawa yang

mempunyai kelarutan berbeda-beda dalam berbagai pelarut komponen kimia yang

terdapat dalam bahan alam baik dari tumbuhan, hewan, dan biota laut dengan

menggunakan pelarut organik tertentu. Proses ekstraksi ini didasarkan pada

kemampuan pelarut organik untuk menembus dinding sel secara osmosis yang

mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dalam pelarut organik dan karena adanya

perbedaan konsentrasi antara didalam dan diluar sel, mengakibatkan terjadinya difusi
 15

pelarut organik yang mengandung zat aktif keluar sel. Proses ini berlangsung terus

menerus sampai terjadi keseimbangan konsentrasi zat aktif didalam dan diluar sel

(Dirjen POM, 2000).

Tujuan utama dari proses ekstraksi berkaitan dengan satu atau lebih dari sifat,

yaitu hasil ekstraksi yang tinggi didapatkan senyawa target diperoleh secara tuntas

atau hampir tuntas. Kemurnian yang tinggi (selektivitas) sehingga ekstrak yang

dihasilkan memiliki bahan pengganggu atau bahan yang tidak diinginkan dalam

jumlah yang rendah. Sensitivitas yang tinggi menghasilkan ekstrak yang

memungkinkan untuk dikuantifikasi dengan teknik yang berbeda dengan

menghasilkan linearitas yang tinggi dalam kurva kalibrasi. Batas deteksi rendah

(kuantifikasi) sehingga komponen dalam ekstrak dapat dideteksi/diukur pada tingkat

rendah karena tingkat noise (gangguan analisis) yang rendah dapat diperoleh dalam

sistem analitis (Haeria, 2014: 16).

2.4.2 Metode Ekstraksi

Metode ekstraksi menggunakan pelarut dapat dilakukan secara dingin yaitu

maserasi dan perkolasi, dan secara panas yaitu refluks, soxhlet, digesti, infus, dan

dekok (Dirjen POM, 2000). Umumnya zat aktif yang terkandung dalam tanaman

maupun hewan lebih larut dalam pelarut organik. Pelarut organik akan menembus

dinding sel dan masuk kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan

larut di dalam sel dan pelarut organik di luar sel. Larutan dengan konsentrasi tinggi
 16

berdifusi keluar sel dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi keseimbangan

antara konsentrasi zat aktif di dalam sel dan di luar sel.

Jenis-jenis metode ekstraksi yang dapat digunakan adalah :

1. Maserasi

Maserasi merupakan metode sederhana yang paling banyak digunakan. Cara

ini sesuai, baik untuk skala kecil maupun skala industri. Metode ini dilakukan dengan

memasukkan serbuk tanaman dan pelarut yang sesuai ke dalam wadah inert yang

tertutup rapat pada suhu kamar. Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai

kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam

sel tanaman. Setelah proses ekstraksi, pelarut dipisahkan dari sampel dengan

penyaringan.

2. Ultrasound – Assisted Solvent Extraction

Merupakan metode maserasi yang dimodifikasi dengan menggunakan bantuan

ultrasound (sinyal dengan frekuensi tinggi, 20 kHz). Wadah yang berisis serbuk

sampel ditempatkan dalam wadah ultrasonic dan ultrasound. Hal ini dilakukan untuk

memberikan tekanan mekanik pada sel hingga menghasilkan rongga pada sampel.

Kerusakan sel dapat menyebabkan peningkatan kelarutan senyawa dalam pelarut dan

meningkatkan hasil ekstraksi.

3. Perkolasi

Pada metode perkolasi, serbuk sampel dibasahi secara perlahan dalam sebuah

percolator (wadah silinder yang dilengkapi dengan kran pada bagian bawahnya).
 17

Pelarut ditambahkan pada bagian atas serbuk sampel dan dibiarkan menetes perlahan

pada bagian bawah.

4. Soxhlet

Metode ini dilakukan dengan menempatkan serbuk sampel dalam sarung

selulosa (dapat digunakan kertas saring) dalam klonsong yang ditempatkan di atas

labu dan di bawah kondensor. Pelarut yang sesuai dimasukkan ke dalam labu dan

suhu penagas diatur di bawah suhu reflux.

5. Reflux dan Destilasi Uap

Pada metode reflux, sampel dimasukkan bersama pelarut ke dalam labu yang

dihubungkan dengan kondensor. Pelarut dipanaskan hingga mencapai titik didih. Uap

terkondensasi dan kembali ke dalam labu.

Destilasi uap memiliki proses yang sama dan biasanya digunakan untuk

mengekstraksi minyak esensial (campuran berbagai senyawa menguap). Selama

pemanasan, uap terkondensasi dan destilat (terpisah sebagai 2 bagian yang tidak

saling bercampur) ditampung dalam wadah yang terhubung dengan kondensor

(Mukhriani, 2014).

Faktor biologi yang mempengaruhi mutu ekstrak meliputi beberapa hal, yaitu pertama

identitas jenis tumbuhan (spesies) jenis tumbuhan dari sudut keragaman hayati dapat

dikonfirmasi sampai informasi genetik sebagai faktor internal untuk validasi jenis

(spesies). Kedua lokasi tumbuhan atau asal tumbuhan yang berarti faktor eksternal
 18

yaitu lingkungan (tanah dan atmosfer) dimana tumbuhan berinteraksi berupa energi

(cuaca, temperatur, cahaya), dan materi (air, senyawa organik, dan anorganik). Ketiga

periode pemanenan hasil tumbuhan. Keempat adalah penyimpanan bahan tumbuhan

yang hendak digunakan. Kelima yaitu umur tumbuhan dan bagian yang digunakan.

Selain kelima faktor tersebut untuk bahan tumbuhan dari hasil budaya ada lagi faktor

GAP (Good Agriculture Practice) sedangkan untuk bahan dari tumbuhan liar (wild

crop) ada faktor kondisi proses pengeringan yang umumnya dilakukan di lapangan.

Terdapat juga faktor kimia yang baik untuk bahan dari tumbuhan liar maupun

dari tumbuhan obat hasil budidaya meliputi beberapa hal, yaitu: Faktor internal

meliputi jenis senyawa aktif, komposisi kuantitatif senyawa aktif, komposisi

kualitatif senyawa aktif dan kadar total rata-rata senyawa aktif. Selain faktor internal

terdapat juga faktor eksternal meliputi metode ekstraksi, perbandingan ukuran alat

ekstraksi, ukuran kekerasan, dan kekeringan bahan, pelarut yang digunakan,

kandungan logam berat, kandungan pestisida (Dirjen POM, 2000).

2.5 Tinjauan Tentang Antibakteri

Zat antibakteri adalah sekelompok zat yang dapat melawan bakteri termasuk

bakteri patogen. Cara antibakteri merusak bakteri tersebut yaitu dengan membunuh

atau mengurangi aktivitas metabolisme bakteri serta efek patogenik di lingkungan

biologisnya yang akan diminimalkan (Pirmoradian and Hooshmand, 2019).

Penghambatan pertumbuhan dan hilangnya viabilitas bakteri sering kali merupakan

hasil dari kaskade kejadian yang timbul setelah pengobatan dengan agen antibakteri
 19

dengan cara kerja yang biasanya melibatkan lebih dari satu target tunggal. Obat

antibakteri saat ini menggunakan target seluler yang berbeda, seperti membran, RNA,

DNA, enzim, dan bubstrat enzim (Vardanyan and Hruby, 2016) .

Kematian sel yang disebabkan oleh antibakteri atau penghentian pertumbuhan

melibatkan banyak jalur biokimia dan genetik dan tidak dipahami dan dibuktikan

dengan sangat baik. Antibakteri dapat dibedakan berdasarkan mekanisme kerjanya

yaitu antibakteri yang menghambat pertumbuhan dinding sel, antibakteri yang

mengakibatkan perubahan permeabilitas membran sel atau menghambat

pengangkutan aktif melalui membran sel, antibakteri yang menghambat sintesis

protein dan antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat sel. Brooks et al.,

(2005) menyatakan bahwa aktivitas antibakteri dibagi menjadi dua macam, yakni

aktivitas yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri (bakteriostatik) dan aktivitas

antibakteri yang dapat membunuh bakteri patogen. Agen antibakteri digunakan untuk

pengobatan atau pencegahan infeksi bakteri (Vardanyan and Hruby, 2016).

Antibakteri yang kebanyak beredar saat ini masih dalah bentuk kimiawi. Di

antara agen antibakteri yang ada, antibiotik merupakan produk antibakteri yang

sangat umum digunakan. Antibiotik dapat secara informal didefinisikan sebagai

senyawa yang diproduksi oleh organisme hidup, berasal dari bakteri, jamur, tanaman,

dan sumber hewani. Antibiotik digunakan untuk mengobati infeksi bakteri dan

merupakan salah satu kelas obat terlaris di seluruh dunia. Skema klasifikasi untuk

antibiotik ada beberapa macam, yaitu berdasarkan asal antibiotik, berdasarkan

aktivitasnya, berdasarkan cara kerjanya (bakterisida atau bakteriostatik), berdasarkan

 20

spektrum bakteri, kelompok mikroba umum yang bekerja melawan (antibakteri,

antijamur, atau antiprotozoa), rute pemberian (injeksi, oral atau topikal) serta

berdasarkan klasifikasi struktur kimianya. Sebagian besar antibiotik adalah produk

alami dan turunan semisintetiknya, atau senyawa sintetis yang meniru struktur produk

alami (Vardanyan and Hruby, 2016).

2.6 Pengukuran Efek Antimikroba Melalui Tes Sensitivitas

Pengukuran yang dilakukan pada efek antimikroba terhadap bakteri dapat

dilakukang menggunakan tes sensitivitas bakteri dengan dua teknik, yaitu teknik

dilusi dan teknik defusi. Tes sensitivitas yang dilakukan dengan teknik delusi dapat

digunakan untuk menentukan Kadar Hamhat Minimum/ Minimal Inhibitory

Concentration (MIC) dan menentukan kadar Hambat Bunuh Minimal/ Minimal

Bactericidal Concentration (MBC), sedangkan defusi digunakan untuk menentukan

zona hambat dengan mengamati zona hambat pada pertumbuhan bakteri (Titty,

2012). Metode dilusi merupakan metode yang akurat jika digunakan untuk

menentukan kepekaan antibakteri, maka penelitian ini menggunakan metode dilusi.

Metode dilusi menggunakan antibakteri dengan konsentrasi yang rendah secara

bertahap baik pada media cairmaupun pada media padat, dengan begitu kadar

konsentrasi MIC dan MBC dapat diketahui.

Menurut Koburger et al., 2010 bahwa kita dapat membandingkan potensi dari

efektivitas antimikroba dengan cara membandingkan konsentrasi dari efektifnya.

Konsentrasi efektif dari suatu antimikroba dapat diamati serta dibandingkan dengan
 21

nilai MIC dan nilai MBC. MIC dan MBC yang menunjukkan nilai rendah hal ini

berarti bahwa potensi dari suatu antibakteri tersbut lebih kuat sehingga dapat

dikatakan efektif terhadap bakteri tersebut.

2.6.1 Minimal Inhibitory Concentration (MIC)

Minimal Inhibitory Concentration (MIC) adalah konsentrasi hambat minimum

yang merupakan konsentrasi terendah suatu antibiotik atau antibakteri dalam

menghambat pertumbuhan bakteri yang dinyatakan dalam μg / mL. MIC merupakan

metode kuantitatif uji kerentanan bakteri terhadap antibakteri. MIC membantu

menentukan antibakteri mana yang paling efektif. Informasi ini dapat mengarahkan

pada pilihan antibiotik atau antibakteri yang tepat dan dapat meningkatkan peluang

keberhasilan dalam pengobatan serta membantu perjuangan untuk memperlambat

kasus resistensi terhadap antibiotik.

Penilaian terhadap MIC dilakukan dengan Interpretasi kerentanan, yaitu: S

(sensitif), I (menengah), atau R (resisten), diikuti oleh MIC dalam μg / mL. Sensitif

menyiratkan bahwa organisme dihambat oleh konsentrasi antibakteri yang dicapai

dengan dosis biasa. Intermediet menggambarkan bahwa organisme hanya dihambat

oleh dosis maksimum yang disarankan. Resisten menyatakan bahwa organisme kebal

atau resisten terhadap kadar suatu antibakteri yang biasanya dapat dicapai. Standar

interpretatif ini telah ditetapkan oleh Clinical and Laboratory Standards Institute

(CLSI) (IDXX, 2019).

 22

2.6.2 Minimal Bactericidal Concentration (MBC)

Kadar Bunuh Minimal (KBM)/Minimal Bactericidal Concentration (MBC)

adalah suatu konsentrasi minimum dari suatu antibakteri yang bersifat bakterisidial.

Hal ini ditentukan oleh pengenceran kembali kultur (Subkultur) yang menghambat

pertumbuhan bakteri (yang ada pada MIC) (Sykes and Rankin, 2014). Penentuan

kadar bakterisidial minimum yaitu biakan pada MIC dengan konsentrasi tertunggi

hingga tabung yang jernih dibiakkan ulang pada media perbenihan agar, kemudian

diinkubasi selama 24-72 jam pada suhu 37˚C. Setelah diinkubasi maka dilihat ada

tidaknya pertumbuhan koloni pada lempeng agar, bila tidak ada maka disebut kadar

bunuh minimum (Tritty, 2012).

 BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

Metode penelitian yang digunakan pada penelitian ini merupakan metode

eksperimental laboratorium dengan desain penelitian Rancangan Acak Lengkap

(RAL), dilakukan secara in vitro menggunakan uji kepekaan metode dilusi yang

meliputi Minimal Inhibitory Concentration (MIC) dan Minimal Bacterial

Concentration (MBC).

3.2 Sampel

Jumlah sampel pada penelitian eksperimen ekstrak bawang dayak dihitung

dengan rumus Frederer, (t-1)(n-1) ≥ 15 dengan n = banyak pengulangan, dalam hal

ini 6 perlakuan, dan t = jumlah perlakuan (Supranto, 2000).

(t-1) (n-1) ≥ 15
(t-1) (6-1) ≥ 15
5 (t-1) ≥ 15
t-1 ≥ 3
t≥4
Maka banyak pengulangan minimal dalam penelitian ini sebanyak 4 kali.

3.3 Variabel Yang Diamati

Dalam penelitian ini variabel yang digunakan adalah:

1. Variabel bebas: Pada penelitian ini variabel bebasnya adalah konsentrasi

ekstrak umbi bawang dayak (Eleutherine americana Merr.).

2. Variabel terkontrol: Pada penelitian ini variabel terkontrol yaitu suhu,

lama inkubasi, dan jenis media.

23
 24

3. Variabel terikat: Variabel terikatnya adalah nilai MIC dan MBC terhadap

bakteri Escherichia coli.

3.4 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Nopember 2019 sampai Desember

2019. Proses ekstraksi dilakukan di Laboratorium Farmasi Fakultas Kedokteran

Hewan Universitas Airlangga. Isolasi dan identifikasi serta uji efektivitas antibakteri

dilakukan di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran

Hewan Universitas Airlangga.

3.5 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tabung reaksi steril, ose,

mikro pipet, mikrotip, pipet, spuit, sentrifuse, vortexmixter, mikroskop, inkubator,

penangas dan refrigenerator, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, ose,

pembakar bunsen, gelas ukur, tabung erlenmayer, gelas objek, gelas penutup,

alumunium foil, timbangan analitik digital, autoclave, oven.

3.6 Bahan Penelitian

Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah umbi bawang

dayak yang berasal dari Kecamatan Samarinda Utara, Kota Samarinda, Provinsi

Kalimantan Timur. Bahan lain yang digunakan meliputi alkohol 70%, spiritus, karbol

gentian violet, lugol, alkohol 95%, air fuschin, minyak emersi, Phospate Buffer

Saline (PBS), aquades steril, methanol, safranin, dan larutan giemza pekat. Media
 25

untuk menumbuhkan bakteri yang digunakan adalah Plat Agar Darah (PAD), Eosin

Methylene Blue (EMBA), Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Urea Agar, Sulphide Indol

Motility (SIM), MR-VP, Simon Cytrat Agar, Uji Gula (glukosa, laktosa, sukrosa,

maltosa, dan manitol).

 26

3.7 Diagram Alir

3.8
 27

3.8 Prosedur Penelitian

Prosedur pada penelitian ini dilakukan dengan beberapa tahap mulai dari

persiapan, apabila persiapan telah dilakukan dengan baik barulah dilakukan

pemeriksaan ada tidaknya bakteri Eschrichia coli pada sampel dengan isolasi dan

identifikasi. Setelah itu pengujian antibakteri dilakukan dengan penentuan MIC dan

MBC, jika data telah didapatkan baru dilakukan analisis data.

3.8.1 Persiapan Penelitian

Beberapa persiapan harus dilakukan sebelum melaksanakan penelitian.

Persiapan yang haus dilakukan berkaitan dengan peralatan maupun bahan. Peralatan
 28

yang digunakan haruslah dalam keadaan yang baik dan steril, dan bahan baik organik

maupun bahan kimia yang digunakan harus yang memiliki kualitas baik dan layak

digunakan. Setelah dapat dipastikan alat dan bahan telah disiapkan sesuai standart

barulah penelitian dapat dilaksanakan.

3.8.1.1 Sterilisasi Peralatan Penelitian

Sebelum penelitian dilaksanakan, seluruh peralatan yang digunakan

disterilisasi dengan menggunakan autoclave, sterilisasi dilakukan pada suhu 121˚C,

pada tekanan uap 15 pound/inci selama 15 menin (Mardigan and Martinko, 2006).

3.8.1.2 Pembuatan Simplisia Umbi Bawang Dayak

Umbi bawang dayak didapatkan dari kota Samarinda, Kalimantan Timur

sebanyak 2 kilogram yang selanjutnya dilakukan pencucian sampai bersih tanpa

adanya kotoran atau komponen lain dari umbi kemudian umbi dipotong tipis-tipis dan

dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada tempat tanpa terkena sinar matahari

langsung. Selanjutnya umbi bawang dihancurkan untuk memperoleh serbuk

(simplisia).

3.8.1.3 Pembuatan Ekstrak Umbi Bawang Dayak

Umbi bawang dayak yang telah dijadikan simplisia kemudian dilakukan

proses maserasi. Maserasi dilakukan dengan cara merendam simplisia ke dalam

pelarut etanol 96%, sampai terendam seluruhnya selama ± 24 jam, kemudian disaring

dengan kertas penyaring. Residu kembali dimaserasi lagi dengan cara yang sama
 29

selama 3 hari. Ekstrak hasil maserasi atau filtrat yang dihasilkan, ditampung menjadi

satu dan diuapkan untuk memisahkan pelarutnya. Penguapan dilakukan dengan

menggunaka alat Rotary vacum evaporator pada suhu 30-40˚C (Harbone, 1996).

Sehingga didapatkan ekstrak murni cairan kental dari umbi bawang dayak.

3.8.2 Isolasi dan Identifikasi

20 Sampel yang digunakan yaitu Susu kambing Peranakan Etawa yang

dibawa dari Kabupaten Mojokerto kemudian tiap sample tersebut dibiakkan pada

Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) secara streak atau goresan dipermukaan media

dan diinkubasi 37˚C selama 24 jam, Kemudian koloni hasil pertumbuhan

dikelompokkan berdasarkan morfologi koloni yang menciri E.coli, yakni membentuk

warna hijau metalik. Media EMBA yang ditemukan koloni dengan warna hijau

metalik kemudian dilakukan identifikasi pada TSIA, Urea Agar, SIM Agar, VP-MR,

Simon Cytrat Agar, dan uji gula-gula.

3.8.2.1 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram dilakukan untuk membedakan bakteri yang tahan atau tidak

tahan terhadap alkohol disebut Gram positif dan sebaliknya disebut Gram negatif.

Pada prinsipnya, terbentuk kompleks kristal violet yodium di dalam sel, adanya

perbedaan dalam susunan kimia pada dinding sel bakteri, sehingga memberi

perbedaan dan permeabilitas zat warna ke dalam bakteri (Erni dkk., 2008).

Cara melakukan pewarnaan gram, yaitu koloni bakteri diambil dengan ose

kemudian diletakan diatas object glass dan ditetesi akuades selanjutnya difiksasi
 30

diatas api bunsen sampai kering. Langkah selanjutnya area apusan ditetesi gentian

violet dan dibiarkan selama 1,5 menit kemudian dibilas perlahan menggunakan air

mengalir. Selanjutnya ditetesi larutan iodin ke atas area apusan, dibiarkan selama 1

menit kemudian ditetesi alkohol selama 5 menit, lalu dibilas dengan air mengalir.

Apusan selanjutnya ditetesi safranin dan dibiarkan selama 5 detik, lalu dibilas dengan

air mengalir dan dibiarkan selama 2 detik, dikeringkan di suhu ruang dan selanjutnya

diamati di bawah mikroskop. Bakteri dapat dikatakan Gram positif apabila bakteri

terlihat berwarna ungu pada mikroskop, sedangkan gram negatif bila bakteri terlihat

berwarna merah. Bakteri Escherichia coli memiliki bentuk batang dan bersifat Gram

negatif (Baehaqi dkk., 2015).

3.8.2.2 Eosin Methylen Blue Agar (EMBA)

Media EMBA dapat digunakan untuk media isolasi sekaligus diferensiasi.

Penanaman bakteri pada media EMBA digunakan untuk membedakan bakteri

memfermentasikan laktosa dan yang tidak. Cara pemupukan pada media EMBA, satu

koloni hasil pertumbuhan pada media EMBA dengan cara streak dan diinkubasi 37˚C

selama 24 jam. Bakteri Escherichia coli pada media EMBA menunjukkan koloni

berwarna hijau metalik (Hendrix and Sirois, 2007).

3.8.2.3 Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Uji TSIA digunakan untuk mengetahui apakah bakteri termasuk kelompok

yang memfermentasikan gula (glukosa, laktosa dan sukrosa). Satu ose koloni hasil

pada media EMBA ditanam pada media TSIA dengan cara menusuk kemudian
 31

dilanjutkan streak pada permukaan yang miring dan diinkubasi 37˚C selama 24 jam.

Bakteri yang memfermentasikan glukosa, sukrosa dan laktosa akan menyebabkan

media berubah warna menjadi kuning (asam), terbentuk dapat diketahui dengan

terbentuknya warna hitam pada media (Pasaribu, 2004). Escherichia coli pada media

TSIA menunjukkan reaksi asam, gas positif.

3.8.2.4 Uji Urea

Uji urea digunakan untuk melihat dan menentukan adanya aktivitas enzim

urease yang dimiliki bakteri. Satu ose biakan bakteri ditanam dengan cara streak dan

diinkubasi 37˚C selama 24 jam. Bila bakteri memiliki enzim urease, maka urea akan

terhidrolisis dan membebaskan amonia sehingga media akan menjadi basa. Suasana

basa akan menyebabkan indikator phenol red mengubah warna media menjadi merah

ungu, sedangkan warna kuning tidak berubah menunjukkan hasil negatif (Hendrix

and Storius, 2007).

3.8.2.5 Uji Sulfide Indol Motility (SIM)

Uji Sulfide Indol Motility (SIM) digunakan untuk mengetahui terbentuknya

Sulfide, indol dan mengetahui pergerakan bakteri (Erni dkk., 2008). Triptofan

merupakan salah satu asam amino daat dipecah oleh enzim triptofanase menjadi

produk yang lebih sederhana, yaitu indol. Karena tidak semua bakteri menghasilkan

enzim ini, maka uji indol dapat digunakan sebagai salah satu uji deferensiasi untuk

membedakan bakteri. Media SIM diinokulasikan bakteri secara tusuk dengan

menggunakkan needle dan diinkubasi 37˚C. Selama 24 jam. Setelah diinkubasi,

 32

diteteskan kurang lebih 2 ml reagen Kovac yang terdiri dari anyl alkohol,

hydrochioric acid, dan p-dimethyl-aminobenzoldehide. Tes positif dengan

penambahan reagen Kovac yakni terbentuk cincin berwarna merah pada permukaan

media. Produksi gas kditunjukkan dengan adanya bentukan pertumbuhan bakteri

yang menyebar pada bekas tusukan needle, sedangkan non motil bila pertumbuhan

bakteri tidak menyebar. E.coli pada uji indol menunjukkan indol positif dan bersifat

motil (Merchant and Packer, 1961).

3.8.2.6 MR-VP medium

MV-VP berasal dari kata Methyl Red and Voges Proskauer medium yang

dipergunakan untuk mengetahui terbentuknya asam setelah ditetesi dengan reagen

MR, sedangkan test VP dipergunakan untuk mengetahui terbentuknya asetil metil

karbonil (Erni dkk., 2008). Dua media dextrose cair masing-masing diinokulasi

bakteri dan diinkubasi 37˚C selama 48-72 jam. Setelah inkubasi, untuk uji MR, maka

ditambahkan lima tetes methyl red. Hasil positif bila media berwarna merah yang

menunjukka pH <4,5 dan hasil negatif bila media berwarna kuning yang

menunjukkan pH >4,5. Untuk uji VP ditambahkan dengan 12 tetes α-naphtol dan 5

tetes potassium hydroxide (KOH 40%) dan kocok hingga mencampur rata. Uji positif

bilaa warna menjadi merah muda sampai merah yang menunjukkan adanya kehadiran

accetyl-methyl-carbinol. E. coli pada uji MR menunjukkan reaksi positif sedangkan

pada uji VP menunukkan reaksi negatif (Hemraj et al., 2013).

 33

3.8.2.7 Uji Simon Cytrate Agar

Uji citrat digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

memanfaatkan natrium citrat sebagai sumber karbon untuk keperluan hidupnya. Uji

ini dilakukan dengan menanam biakan pada media citrat agar Bromothymol blue

sebanyak satu ose kemudian diinkubasi dengan suhu 37˚C selama 24 jam. Tanda

adanya pertumbuhan bakteri pada media ini, yaitu adanya perubahan warna dari hijau

menjadi biru (Hendrix and Siriois, 2007).

3.8.2.8 Uji gula-gula

Uji gula-gula digunakan untuk melihat kemampuan bakteri

memfermentasikan gula-gula, yaitu glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa, dan monitol.

Satu ose biakan ditanam pada masing-masing media gula-gula dan diinkubasi 37˚C

selaman 24 jam. Bakteri dikatakan positif memfermentasikan gula-gula bila media

dengan indikator phenol red berubah menjadi kuning. E. coli. Pada uji gula-gula

tersebut menunjukkan hasil positif dan terbentuknya gas yang tertampung pada

tabung Durham (Erni dkk., 2008).

3.8.2.9 Pembuatan Suspensi Bakteri

Pembuatan suspensi bakteri dilakukan dengan cara mengambil beberapa

koloni bakteri dari hasil pupukan pada EMBA. Kemudian koloni pupukan

disuspensikan ke dalam 10 ml media NaCl fisiologis dan diaduk hingga merata

sampai kekeruhannya sebanding dengan standart Mc Farland no. 1 yang memiliki

 34

jumlah bakteri sebanyak 3x sel/ml (Clinical and Laboratory Standards Institute,

2018).

Menurut Beisher (1983), untuk uji sensitifitas bakteri terhadap antibakteri

digunakan bakteri - sel/ml. Pada penelitian ini jumlah bakteri yang dipakai

sebanyak 3x sel/ml. Maka dilakukan pengenceran secara berseri untuk

mendapatkan jumlah bakteri sebanyak 3x sel/ml.

Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan tabung reaksi sebanyak

dua buah yang diisi NaCl fisiologis 9 mml. Pada tabung pertama ditambahkan 1 ml

larutan suspensi Escherichia coli dari tabung yang disamakan kekeruhannya dengan

standart MCFarland no. 1 yang mengandung bakteri 3x sel/ml kemudian

dihomogenkan dengan vortex. Selanjutnya tabung kedua ditambah 1 ml Larutan

suspensi Escherichia coli dari tabung pertama, kemudian dihomogenkan dengan

vortex kembali, sehingga diperoleh kekeruhan suspensi Escherichia coli sebanyak

3x sel/ml (Assidqi, 2012).

3.8.3 Pelaksanaan Penelitian

Tahap ini merupakan tahapan pengujian efektifitas antibakteri dari ekstrak

bawang dayak (Eleutherine americana Merr.)

3.8.3.1 Penentuan Minimal Ihibitory Concentration (MIC)

MIC digunakan untuk mengukur konsentrasi hambat minimum yang

merupakan karakterisasi satu angka paling penting dari efektivitas agen antimikroba

terhadap mikroorganisme yang akan diuji, dengan kata lain, MIC adalah konsentrasi
 35

minimum agen antimikroba yang diperlukan untuk menyebabkan stasis (tidak ada

pertumbuhan) (Jepson et al., 2016). Berdasarkan penelitian Warsiti dkk., (2018),

ekstrak etanol umbi bawang dayak dibuat 4 tingkatan konsentrasi yaitu 25%, 50%,

75% dan 100%, dengan pengulangan 4 kali tiap kelompok.

Penentuan MIC dilakukan dengan cara larutan ekstrak etanol umbi bawang

dayak diencerkan dalam tabung reaksi dengan menggunakan aquades secara serial

sehingga didapat pengenceran berkonsentrasi 100%, 75%, 50% dan 25% (Warsiti

dkk., 2018). Selanjutnya Suspensi kuman sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam

masing-masing tabung. Pada masing-masing tabung reaksi diberi label. Tabung

kontrol positif (+) berisi 2 ml suspensi bakteri tanpa larutan ekstrak bawang dayak

dan tabung kontrol negatif (-) berisi 2 ml larutan ekstrak bawang dayak tanpa

suspensi bakteri. Selanjutnya suspensi bakteri yang diuji dan ekstrak dihomogenisasi.

Kemudian seluruh tabung diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam.

3.8.3.2 Penentuan Minimal Bactericidal Concentration (MBC)

Minimal bactericidal concentration berujuan untuk menetahui minimum

antimikroba yang yang bersifat barektisidal. Hal ini ditentukan oleh pengenceran

kembali kultur (subkultur) yang menghambat pertumbuhan organisme bakteri (yaitu,

yang berada di atau di atas MIC). MBC adalah pengenceran suspensi antimikroba

terendah yang mencegah pertumbuhan mikroorganisme pada lempeng agar (Sykes

and Shelly, 2014). Penentuan MBC dilakukan dengan cara disiapkan 1 buah MHA
 36

steril dan dibagi menjadi enam bagian. Kemudian mengambil suspensi bakteri pada

masing-masing tabung hasil uji MIC tiap konsentrasi pada setiap samplenya dan di

tanam pada media MHA dengan cara streak. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37˚C

selama 24 jam.

3.9 Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan analisis probit yang

diolah dengan menggunakn program SPSS (Statistical Product and Service

Solutions) 20.0 for Windows.

 DAFTAR PUSTAKA

Altalhi, A.D. and S.A. Hassan. 2009. Bacterial quality of raw milk investigated by
Escherichia coli and isolates analysis for spesific virulence-gene markers.
Article Food Control. 913-917.

Alys, K.J., J. Schwarz-Linek, Ryan, L., Maxim G.R. and Wilson C.K.P. 2016. What
is the ‘Minimum Inhibitory Concentration’(MIC) of Pexiganan Acting on
Escherichia coli? – A Cautionary Case Study.
Assidqi, K. 2012. Potensi Ekstrak Daun Patikan Kebo (Euphorbia hirta) Sebagai
Antibakterial Terhadap Aeromonas Hydrophilia Secara In Vitro. Skripsi.
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga. Surabaya.

Baehaqi, K. Y., Putriningsih, P. A. S., I Wayan, S. 2015. Isolasi dan Identifikasi

Escherichia Coli O157:H7 dada Sapi Bali Di Abiansemal, Badung, Bali.
Indonesia Medicus Veterinus 4(3) : 267-278.

Blakely, J. dan D. H. Blade. 1994. The Science of Animal Hubandry. Printice Hall
Inc. New Jersey.

Brooks, G. F., J. S., Butel and S.A. Morse. 2005. Medical Microbiology. New York :
McGraw-Hill

Brooks, John T., Evangeline G., Sowers, Joy G., Welis, Katherine D., Greene,
Patricia M., Griffin, Robert M., Hoekastra and Nancy A. Strockbine.1995.
Non-0157 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infection in the Unied
States. Foodborn and Diarrheal Dieases Branch and Information Branch,
Division of Bacterial and Mycotic Disease, National Center for Infectious
Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Geogia.

Clinical and Laboratory Standards Institute. 2018. Performance Standards for

Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th Edition. .

Dirjen POM. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tanaman Tumbuhan Obat.
Jakarta: Depkes RI.

Erni, R.S.I., Wiwiek, T., Suryanie., Hasutji, E.N., S. Chusniati. 2008. Penuntun
Praktikum Mikrobiologi Veteriner. Devisi Bakteriologi dan Mikologi
Departemen Mikrobiologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas
Airlangga. Surabaya.

37
 38

Fazeli H. and Salehi R. 2007. Antibiotic resistance pattern in shiga toxin-producing

Eschericia coli isolated from diarrheal patient in Al-zahra hospital, Isfahan.
Iran: Pharmaceutical science.

Galingging, Ronny Yuniar. 2009. Bawang Dayak Sebagai Tanaman Obat

Multifungsi. Kalimantan Tengah: Badan Peneliti dan Pengembangan
Pertanian.

Haeria. Kimia Produk Alami. 2014. Makassar: Alauddin University Press.

Harborne, J. B. 1996. Metode fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah.

Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.

Hemraj, V., Diksha, D., Avneet, G. 2013. A Review On Commonly Used

Biochemical Test For Bacteria. Innovare Journal of Life Science Vol 1, Issue
1.

Hendrix, C.M. and Sirois, M. 2007. Laboratory Procedures for Veterinary

Technicians. Fifth Edition. Mosby Elvier. Canada. Page: 114-140.

Handayani, J. Dan R.T.C. Tandelilin. 2006. Pengaruh Daya Antibakteri Ekstrak Daun
Teh Segar (Camelia sinensi) Terhadap Sterptococcus alpa. Jurnal Persatuan
Dokter Gigi. Vol. 50, No. 2 : 14-21.

Hardjosubroto, W. 1994. Aplikasi Pemuliabiakan Ternak di Lapangan. PT Grasindo.

Jakarta

Herrera, A.A., R.S. Flores, S.M.A., Chaves dan J. Tortoriello. 2004. Effectiveness
and Tolerability of A Standardizer Extract from Hibiscus Sabdariffa in Patiens
with Mild to Moderate Hypertension, a controlled and randomized clinical
trial phytomedicine. Vol 11 : 375-382.

Howard RL, et. al. 2003: Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and
enzyme production. African Journal of Biotechnology, Volume 2, No.12,
Page 602-619.

IDXX Laboratories. 2019. Microbiology guide to interpreting minimum inhibitory

concentration (MIC). United States.

Jawetz E., Melnick J.L., Adelberg E.A., Brooks G.F. 2013. Mikrobiologi kedokteran
(terjemahan). Edisi ke-25. Jakarta: EGC.

Khotimah, L. 2016. Analisis Cemaran Bakteri Coliform dan Identifikasi Escherichia

coli pada Es Batu Kristal dan Es Balok di Kelurahan Cibubur Jakarta Timur
 39

Tahun 2016. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi

Farmasi. Jakarta. Skripsi.

Koburger, T., Hubner, N.O., Braun, M., Siebert, J. And Kramer, A., 2010.
Standardized comparison of antiseptic efficacy of triclosan, PVP-iodine,
octanide dihydrochloride, polyhexanide, polyhexanide and chlorhexidine
digluconate. Journal of antimicrobial chemotherapy

Mangan, Yellia. 2005. Cara Bijak Menaklukan Kanker. Jakarta : Agromedia Pustaka.

Mardigan, M.T. and J.M. Martinko. 2006. Brock Biology of Microorganism 11th Ed.
Person Prentice Hall. New Jersey: 931-932.

Mia Rahardjo, Eko Budi Koendhori, Yuani Setiawati. 2017. Uji Aktivitas Antibakteri
Ekstrak Etanol Lidah Buaya (Aloe vera) terhadap Bakteri Staphylococcus
aureus. Jurnal Kedokteran Syiah Kuala Volume 17, Number 2, Agustus 2017
Pages: 65-70.

Mierza, Vriezka, Suryanto, Dwi, dan Nasution, M. Pandapotan. 2011. Skrining

Fotokimia dan Uji efek antibakteri Ekstrak Etanol Umbi Bawang Sabrang
(Eleutherine palmifolia Merr.), Prosiding Seminar Nasional Biologi. Medan :
USU Press.

Mukhriani. 2014. Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi Senyawa Aktif.

Makassar: Jurnal kesehatan. Vol. VII No. 2.

Mursito, B. 2002. Ramuan Tradisional Untuk Penyakit Malaria. PT. Penebar

Swadaya. Jakarta.

Nascimento, M.S., Vieira, J.M.S., Malheiros, L.C.S., Junior, J.O.C. Silva, Rodrigues,
L.C.S. and Barbosa, W.L.R. 2012. Characterisation of Isoeleutherin In
Aqueous Extract of Eleutherine plicata Herb, Iridaceae, Active Against
Entamoeba hystolica/Entamoeba dispar In Vitro. International Journal of
Pharmaceutical Sciences adn Research, Vol. 3, No. 4 : 1096-1100.

Naspiah, Nisa, Masruhim, Amir, M., Fitriani, Yulita, V. 2013. Uji Aktivitas
Antioksidan Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata Linn.) terhadap DPPH
(1,1-diphenyl- picrylhydrazyl). Indonesian Journal Applied Sciences-IJAS,
Vol. 3, No. 2 : 62-65.

Nirmala, Ratna, dkk. 2007. Budidaya dan Pengembangan Bawang Tiwai/Bawang

Sabrang (Eleutherine americana (L). Merr.) Asal Kultur Jaringan Sebagai
Obat Herbal, Laporan Akhir Penelitian. Samarinda: Tim Peneliti Pangan dan
Bahan Obat Alami.
 40

Nisa Naspiah, Y.I. 2014. Artikel Ulasan: Bawang Tiwai (Eleutherine americana
Merr.), Tanaman Multifungsi. IJAS, Vol. 4 Nomor 2.

Noorcahyati. 2012. Tumbuhan Berkhasiat Obat Etnis Asli Kalimantan. Balikpapan :

Badan Penelitian Teknologi Konservasi Sumber Daya Alam.

Pasaribu, Fachriyan H. 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri. Pelatihan Mikrobiologi

DasarBidang Kesehatan Hewan dan Peternakan Gisarua, 26 April-7 Mei
2004.

Pelezae, J. Michael dan Chan, E.C.S. 1988. Dasara-Dasar Mikrobiologi 2. Penerbit

UI Press. Jakarta.

Pirmoradian, M. And Hooshmand, T. (2019). Remineralization and antibacterial

capabilities of resin-based dental nanocomposites. Applications of
Nanocomposite Materials in Dentistry, 237–269. doi:10.1016/b978-0-12-
813742-0.00015-8.

Rahayu, P. Winiati. 2000. Aktivitas Antimikroba Bumbu Masakan Tradisional Hasil

Olahan Industri Terhadap Bakteri Patogen dan Perusak. Buletin Teknologi
dan Industri Pangan: 11 (2) : 6-12.

Ruminich, B. 1968. The Goats in Philippines: preliminary notes. Bangkok Thailand;

FAO Regional Office, 21 hlm. [AB 37,313].

Schlegel, G. Hans. 1993. Seventh Edition. General Microbiology. Cambridge

University Press. Eng;and: 139-140.

Supranto, J. 2000. Teknik Sampling untuk Survei dan Eksperimen. Penerbit

PT Rineka Cipta, Jakarta.

Susanti, A. 2008. Daya Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Beluntas (Pluchea indica
less) terhadap Escherichia coli Secara In Vitro. Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga.

Swandari Paramita, Muhammad Khairul Nuryanto. 2018. Aktivitas Antiperadangan

Ekstrak Etanol Umbi Bawang Dayak (Eleutherine Bulbosa (MILL.) URB.)).
Journal of Vocational Health Studies 01 : 51–55.

Sykes, J.E. and Shelley C.R. 2014. Isolation and Identification of Aerobic and
Anaerobic Bacteria. Sykes, J. E., & Rankin, S. C. (2014). Canine and Feline
Infectious Diseases: 17–28.
 41

T Poolman, J. 2017. Escherichia coli. Bacterial Vaccine Discovery & Early

Development, Janssen, Leiden, The Netherlands.

Titty, S. 2012. Perbedaan Efek antimikroba papacarie dan papain terhadap

streptococcus mutans in vitro [Accessed online from:
http://lib.ui.ac.id/file?file=digital/20335032-T33030-Tity%20Sulianti.pdf]

Utami, Prapti dan Desty Ervira Puspaningtyas. 2013. The Miracle Herbs. Jakarta: PT
AgroMedia Pustaka

Utami, Prapti dan Lina Mardiana. 2013. Umbi Ajaib Tumpas Penyakit. Jakarta :
Penebar Swadaya.

Vardanyan, R. and Hruby, V. 2016. Antibiotics. Synthesis of Best-Seller Drugs, 573–

643.

Warsiti, Sisca Dwi Kusuma Wardani, Siska , Ardea Achmad Ramadhan, Ratna
Yuliani. 2018. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bawang Dayak
(Eleutherine palmifolia (L.) Merr) terhadap Bakteri Staphylococcus aureus.
Pharmacon: Jurnal Farmasi Indonesia. Vol 15, No 2.