Lihat diskusi, statistik, dan profil penulis untuk publikasi ini di: https://www.researchgate.

net/publication/261700370

Metabolomik dalam Penelitian Pengobatan Herbal

Bab · April 2013

DOI: 10.1002 / 9783527669882.ch8

KUTIPAN
BACA
1
1.649

3 penulis, termasuk:

Chiu-Ping Liu
Academia Sinica
4 PUBLIKASI 69 KUTIPAN

Beberapa penulis publikasi ini juga mengerjakan proyek terkait berikut:

Produksi antibodi dan glycoengineering Lihat proyek

Semua konten setelah halaman ini diunggah oleh Chiu-Ping Liu pada 09 Januari 2018.

Pengguna telah meminta peningkatan dari file yang diunduh.

 j155

8
Metabolomik dalam Penelitian Pengobatan Herbal
Lie-Fen Shyur, Chiu-Ping Liu, dan Shih-Chang Chien

8.1
pengantar

Tumbuhan menghasilkan susunan metabolit yang sangat beragam, diperkirakan

berkisar dari 200.000 hingga 1.000.000 di kerajaan tumbuhan [1]. Banyak yang
berevolusi untuk mengatasi tekanan lingkungan, melindungi dari musuh alami, dan
berfungsi sebagai atraktan kimiawi [2]. Tanaman obat yang mengandung metabolit
ini telah digunakan sepanjang sejarah untuk mencegah atau mengobati penyakit.
Organisasi Kesehatan Dunia memperkirakan bahwa sekitar 80% populasi dunia
menggunakan tanaman obat sebagai sumber utama pengobatan mereka. Baru-baru
ini, produk alami tumbuhan telah digunakan sebagai sumber senyawa aktif secara
farmakologis, langsung sebagai agen terapeutik, atau sebagai petunjuk penemuan
obat [3].
Metabolomics adalah analisis kuantitatif dan kualitatif yang komprehensif dari
sekumpulan metabolit tertentu (pendekatan target) atau semua metabolit
(pendekatan tanpa target) yang ada dalam sel, jaringan, atau organisme tertentu [3].
Pendekatan tak bertarget, juga dikenal sebagai pendekatan kemometri, melibatkan
penggunaan daftar puncak mentah tanpa pemberitahuan, profil spektral selaras, atau
data spektral binned yang dikombinasikan dengan analisis statistik multivariat untuk
mengidentifikasi fitur spektral dalam set sampel yang berbeda [4]. Tantangannya
adalah identifikasi senyawa selanjutnya dan penanganan kebisingan atau puncak
positif palsu dalam spektrum profil metabolik yang kompleks. Metode yang
ditargetkan, atau profil metabolik kuantitatif, biasanya membutuhkan identifikasi
senyawa dan prosedur kuanti fi kasi yang dapat dicapai dengan perbandingan
dengan satu set standar kimia atau perpustakaan spektral referensi [4]. Namun,
metode ini memakan waktu dan tenaga dalam memisahkan, memurnikan, dan
secara struktural menjelaskan berbagai metabolit sekunder dari campuran kompleks
ekstrak tumbuhan dari spesies tumbuhan tertentu sebagai standar kimiawi.
Kurangnya standar kimia global juga menjadi kendala teknis saat ini dalam studi
metabolisme tanaman dan tanaman obat. Metabolomik adalah teknologi penting
yang muncul di bidang seperti ilmu tanaman, fitomedis, pengembangan obat, dan
toksikologi, menggabungkan metode analitik bertanda hubung [misalnya,
kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS), kromatografi cair-spektrometri
massa (LC-MS), dan resonansi magnetik nuklir Metode ini memakan waktu dan
tenaga dalam memisahkan, memurnikan, dan secara struktural menjelaskan
berbagai metabolit sekunder dari campuran kompleks ekstrak tumbuhan dari spesies
tumbuhan tertentu sebagai standar kimiawi. Kurangnya standar kimia global juga
menjadi kendala teknis saat ini dalam studi metabolisme tanaman dan tanaman obat.
Metabolomik adalah teknologi penting yang muncul di bidang seperti ilmu
tanaman, fitomedis, pengembangan obat, dan toksikologi, menggabungkan metode
analitik bertanda hubung [misalnya, kromatografi gas-spektrometri massa (GC-
MS), kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), dan resonansi magnetik
nuklir Metode ini memakan waktu dan tenaga dalam memisahkan, memurnikan,
dan secara struktural menjelaskan berbagai metabolit sekunder dari campuran
kompleks ekstrak tumbuhan dari spesies tumbuhan tertentu sebagai standar
kimiawi. Kurangnya standar kimia global juga menjadi kendala teknis saat ini
dalam studi metabolisme tanaman dan tanaman obat. Metabolomik adalah teknologi
penting yang muncul di bidang seperti ilmu tanaman, fitomedis, pengembangan
obat, dan toksikologi, menggabungkan metode analitik bertanda hubung [misalnya,
kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS), kromatografi cair-spektrometri
massa (LC-MS), dan resonansi magnetik nuklir dan secara struktural menjelaskan
metabolit sekunder individu dari campuran kompleks ekstrak tumbuhan dari spesies
tumbuhan tertentu sebagai standar kimiawi. Kurangnya standar kimia global juga
menjadi kendala teknis saat ini dalam studi metabolisme tanaman dan tanaman obat.
Metabolomik adalah teknologi penting yang muncul di bidang seperti ilmu
tanaman, fitomedis, pengembangan obat, dan toksikologi, menggabungkan metode
analitik bertanda hubung [misalnya, kromatografi gas-spektrometri massa (GC-
MS), kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), dan resonansi magnetik
nuklir dan secara struktural menjelaskan metabolit sekunder individu dari campuran
kompleks ekstrak tumbuhan dari spesies tumbuhan tertentu sebagai standar
kimiawi. Kurangnya standar kimia global juga menjadi kendala teknis saat ini
dalam studi metabolisme tanaman dan tanaman obat. Metabolomik adalah teknologi
penting yang muncul di bidang seperti ilmu tanaman, fitomedis, pengembangan
obat, dan toksikologi, menggabungkan metode analitik bertanda hubung [misalnya,
kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS), kromatografi cair-spektrometri
massa (LC-MS), dan resonansi magnetik nuklir

Buku Pegangan Metabolomik Tumbuhan, Edisi pertama. Diedit oleh Wolfram Weckwerth dan Günter Kahl
# 2013 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Diterbitkan 2013 oleh Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
(NMR) spektroskopi] dengan alat data mining untuk menghasilkan profil metabolik
yang komprehensif dari suatu organisme [3,5]. Metabolomics telah terbukti sangat
cepat dan unggul dari teknologi postgenomics lainnya untuk analisis pengenalan
pola sampel biologis [6], dan sekarang memainkan peran penting dalam biologi
tanaman fundamental dan bioteknologi pertanian terapan. Metabolomik telah
digunakan untuk menilai kualitas komposisi tanaman [7] dan garis introgresi
interspesifik untuk perbaikan tanaman tomat [8], memastikan keamanan suplemen
makanan nabati [9], mengevaluasi tanaman yang dimodifikasi secara genetik
[10,11], mengkarakterisasi respons metabolik untuk cekaman abiotik (misalnya,
kekurangan air, garam, dan cekaman kekeringan), dan mengidentifikasi lokus sifat
kuantitatif metabolik [12,13].
Karena kompleksitas kimia dari metabolisme tumbuhan, para peneliti
umumnya menganggap bahwa teknik analitik tunggal memiliki keterbatasan dan
bias yang melekat pada kelas senyawa tertentu, terutama karena kromatografi,
teknik ionisasi, dan kemampuan detektor yang tidak akan memberikan visualisasi
yang komprehensif dari metabolom. Oleh karena itu, beberapa teknologi umumnya
digunakan. Spektrometri massa (MS) dan spektroskopi NMR adalah beberapa
teknik yang paling umum digunakan dalam metabolisme dan menyediakan rute
terpendek untuk identifikasi metabolit. Kinerja penganalisis massa dengan teknik
ionisasi spesifik digabungkan dengan berbagai metode kromatografi telah
dibandingkan [16], dan Ruan dan Teixeira da Silva memberikan ringkasan dan
perbandingan sistem teknologi metabolomik tanaman saat ini dengan penggunaan
metode MS dan NMR [13].
Kromatografi gas (GC) (atau GC-MS) adalah teknik pertama untuk pemfilteran
metabolit metabolit obat dan metabolit primer dalam cairan bio manusia [17,18].
Penerapan paling awal dari teknik untuk sistem tanaman adalah sebagai alat
diagnostik untuk menganalisis respon herbisida pada bibit jelai [19]. GC-MS
adalah salah satu teknik metabolomik yang paling populer, menggabungkan
sensitivitas tinggi dan spesifisitas, untuk menghasilkan metabolit primer hidrofilik
yang mudah menguap, hidrofobik, dan terderivatisasi, seperti asam amino, gula,
dan asam organik, dan beberapa metabolit sekunder polar yang diturunkan,
terutama yang hadir dalam ekstrak tumbuhan yang kompleks. Saat ini, GC-MS
terintegrasi dengan berbagai database MS komersial online untuk mencari senyawa
referensi yang dapat membantu mengidentifikasi senyawa yang terpisah. Namun,
seperti Fiehn et al. dilaporkan,
Analisis metabolom dengan LC-MS adalah metode unik untuk memfilter
tanaman atau metabolit sekunder bioaktif secara farmakologis (misalnya
karotenoid, flavonoid, saponin, alkamida, alkaloid, dan turunan glikosidik) [21-23].
Secara umum, ekstrak kasar yang diperoleh dari ekstraksi sederhana dan prosedur
pemurnian parsial dengan berbagai pelarut organik diperlukan untuk analisis LC-
MS. Kimia kolom yang berbeda dan elusi fase gerak memungkinkan pemisahan
dan analisis dan
 j
8.1 Pendahuluan 157

jenis metabolit tumbuhan yang spesifik. Namun, data terbatas tersedia untuk
menjelaskan struktur metabolit tanaman dengan metode LC-MS. Karena
keragaman senyawa, peneliti biasanya perlu menetapkan massa molekul otentik
mereka sendiri untuk referensi atau pengindeksan senyawa dan informasi
fragmen terionisasi dan database untuk profil spesies tanaman jika tidak ada
data LC-MS untuk ID senyawa fitokimia yang tersedia di domain publik. Satu
laporan menjelaskan protokol untuk metabolisme tanaman tak bertarget skala
besar dengan menggunakan kromatografi cair fase terbalik (LC) - MS [LC-
quadrupole time-of-ight (QTOF) MS] resolusi tinggi yang digabungkan dengan
perangkat lunak khusus (MetAlign;http://www.metalign.nl atau
http://www.pri.wur.nl/UK/products/MetAlign/) untuk memberikan
perbandingan rinci dari kelompok sampel tanaman atau untuk menghubungkan
data metabolomik dengan informasi biologi sistem lain, penanda genetik, dan /
atau parameter kualitas spesifik [24].
Spektroskopi NMR memiliki sejarah panjang digunakan untuk penjelasan
struktural di bidang penelitian kimia produk alami. Sebagai alat metabolisme,
spektroskopi NMR memiliki beberapa keunggulan dibandingkan metode berbasis
MS karena merupakan metode deteksi universal untuk semua molekul yang
mengandung inti aktif NMR. Untuk bahan kimia yang mengandung proton,
intensitas semua sinyal proton sebanding dengan konsentrasi molekul metabolit,
memungkinkan perbandingan langsung dari konsentrasi semua senyawa tanpa perlu
menetapkan kurva kalibrasi untuk masing-masing senyawa. Meskipun pendekatan
metabolomik berbasis NMR memiliki resolusi dan reproduktifitas yang lebih baik
daripada metode MS, mereka memiliki sensitivitas yang relatif rendah (MS 106-
109 kali lipat lebih sensitif). Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) digabungkan
dengan NMR (HPLC – NMR) atau HPLC – NMR dengan antarmuka ekstraksi fase
padat (SPE) otomatis antara unit HPLC dan NMR (HPLC – SPE – NMR), yang
menggantikan pelarut kromatografi dengan pelarut yang berbeda untuk akuisisi
data NMR, memiliki dampak yang berkembang pesat pada penelitian produk alami
dan metabolomik. Penggunaan LC-NMR di laboratorium analitik dimulai pada
akhir tahun 1990-an [25,26]. Baru-baru ini, LC-NMR telah digunakan sendiri atau
dalam kombinasi dengan teknik tanda hubung lainnya di bidang penelitian jamu.
Misalnya, LC-NMR digabungkan dengan LC-MS dan LC-dichroism melingkar
telah digunakan untuk mempelajari biotransformasi senyawa fenolik bioaktif
(tetrahydroprotoberberines) dalam kultur sel tanaman [27].
Bioinformatika memainkan peran kunci dalam memfasilitasi penyimpanan,
penyebaran, dan interpretasi data metabolomik. Sejumlah database spektral,
senyawa, dan bio-fluida yang komprehensif [30-32] dan perangkat lunak untuk
identifikasi dan kuanti fi kasi senyawa dan untuk pemrosesan data tersedia [33-35].
MetaboAnalyst, platform berbasis web terintegrasi untuk analisis komprehensif
data metabolomik kuantitatif, telah dikembangkan untuk digunakan oleh ahli
biologi. Ini mencakup pemrosesan data dan normalisasi, analisis statistik, dan
interpretasi fungsional [4]. Perbandingan fitur rinci MetaboAnalyst dan dua lainnya
berbasis web gratis
alat pengolahan data metabolomik, MetDB [36] dan metaP-Serve [37], dan dua
paket perangkat lunak komersial, SIMCA-Pþ dan SAS, telah dijelaskan [4].
158j 8 Metabolomik dalam Penelitian

Pengobatan Herbal
Deskripsi tersedia dari database dan peranti lunak non-komersial dan komersial,
dan juga situs web untuk menetapkan metabolit yang tidak diketahui, dengan
informasi yang menyertainya (seperti spektrum massa dan tandem massa, informasi
kromatografi, dan metadata lainnya) [6,38].

8.2
Metode dan Protokol

Metode dan protokol untuk profil metabolit atau studi metabolomik tanaman obat
dengan metode kromatografi gas-ionisasi elektron (GC-EI-MS), kromatografi cair-
spektrometri massa ionisasi elektrospray (LC-ESI-MS) dan metode LC-SPE-NMR
telah dijelaskan. Tujuan dari menggunakan teknik analitik bertanda hubung ini
adalah untuk (i) mengklasifikasikan atau membedakan spesies tanaman obat
dengan secara komparatif mengisi metabolit sekunder yang ada dalam jaringan
tanaman tertentu, seperti bagian udara atau akar, dengan GC-MS atau LC-MS; (ii)
menetapkan sidik jari kimia untuk pengendalian kualitas sediaan ekstrak tumbuhan
obat batch-ke-batch dengan GC-MS atau LC-MS yang ditargetkan; (iii) memantau
respon metabolik terhadap cekaman abiotik, luka, proses pascapanen pada tanaman
obat (GC-MS atau LC-MS); (iv) mengasosiasikan dan menyimpulkan
kemungkinan phytocompounds bioaktif dalam ekstrak tanaman obat dengan
aktivitas farmakologis terdeteksi dengan GC-MS atau LC-MS; dan (v) memperoleh
informasi dengan cepat tentang jenis senyawa utama dan / atau bioaktif yang
terdapat dalam ekstrak tumbuhan bioaktif farmakologis atau fraksi turunan dan
penjelasan struktur kimiawi langsung tanpa memerlukan prosedur ekstraksi dan
pemurnian senyawa yang lama (LC-SPE-NMR).
Sebelum melakukan analisis metabolomik tanaman obat, otentikasi tanaman
target dengan taksonomi, genetika, atau alat lain adalah langkah pertama yang
penting untuk memastikan bahwa spesies tanaman yang benar digunakan untuk
penyelidikan. Banyak obat-obatan herbal tradisional memiliki fenotipe yang mirip
atau nama percobaan yang identik tetapi memiliki khasiat farmakologis yang
berbeda, atau padanan yang serupa bahkan mungkin beracun bagi manusia. Tingkat
metabolit atau senyawa bioaktif yang ada pada tanaman dapat bervariasi tergantung
pada tahap perkembangan, kondisi pertumbuhan, dan waktu panen, misalnya. Oleh
karena itu, praktek pertanian yang baik untuk menanam tanaman obat di lapangan
sangat dianjurkan. Selain itu, masalah penggunaan herbisida dan kontaminasi
logam berat harus dijelaskan untuk sampel tanaman obat mentah. Biasanya untuk
studi metabolis tanaman obat,

8.2.1
Bahan

8.2.1.1 Reagen
● Gas CO2 (kemurnian ≤99.5%).
● Gas N2 (kemurnian ≤99.999%).
● Gaseous He (kemurnian ≤99.9999%).
● Metanol (MeOH), anhidrat> 99,9% (Mallinckrodt, St. Louis, MO, USA).
● Etanol (EtOH),> 99,9% (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA).
● Etil asetat (CH3COOC2H5, EA),> 99,5% (Mallinckrodt).
● n-Butanol (C4H10O, BuOH), 99,9% (ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan).
● Asetonitril (MeCN, ACN), 99,9% (JT Baker).
● Asam tri fl uoroacetic (CF3CO2H, TFA) (Mallinckrodt).
● N, O-Bis (trimethylsilyl) tri fl uoroacetamide (BSTFA) dan trimethylchlorosilane
(TMCS) (99: 1) (Supelco, Bellefonte, PA, USA).
● Hexadecane (C16H34), ≤98% (Fluka, Buchs, Swiss).
● Pelarut organik lainnya untuk ekstraksi (reagen atau kelas HPLC).
● Pelarut deuterasi.
● Nitrogen cair untuk sampel pembekuan. Ini harus ditangani dengan hati-hati, dan
sarung tangan serta kacamata harus digunakan untuk perlindungan.
● Nitrogen cair untuk mengaplikasikan gas ke sumber ionisasi spektrometer massa.

8.2.1.2 Peralatan
● Freezer (—80 ○ C) untuk penyimpanan sampel (Model 995, Thermo Electron,
Waltham, MA, USA).
● Freeze dryer untuk pengeringan sampel (4,5 l Model 77500, Labconco, Kansas City, MO,
AMERIKA SERIKAT,).
● Ultrasonicator (Bransonic 5510, Transcat, Rochester, NY, USA).
● Sistem konsentrasi tekanan rendah.
● Botol kaca (SUN-SRi, Rockwood, TN, USA).
● Pruner (gunting kebun).
● Membran polytetra fl uoroethylene (PTFE) 0,22 dan 0,45 mm (unit penyaring
yang digerakkan oleh jarum suntik Millex-GP).
● Jarum suntik HPLC 10 ml (Hamilton, Reno, NV, USA).
● Kolom C18 fase terbalik analitik (RP), 150 × 4,6 mm id
● Sistem ekstraksi cairan superkritis (Sistem SFX 1220R, ISCO, Lincoln, NE, USA).
● LCQ Advantage ion-trap mass spectrometer (Thermo Finnigan, San Jose, CA,
USA) digabungkan dengan sistem kromatografi cair Seri 1100 (Agilent, Santa
Clara, CA, USA) (untuk analisis HPLC – ESI-MS) dihubungkan dengan dioda-
detektor larik (AYAH).
● Kolom RP-18 [Fenomeneks (Torrance, CA, AS) Luna 3 mm C18, 150 ×
2.0 mm id].
● Jejak Sistem 2000 GC-MS dengan autosampler A200S (Thermo Finnigan) yang
dilengkapi dengan detektor massa Polaris Q (Thermo Scienti fi c, Waltham, MA,
USA) dan perangkat lunak Xcalibur versi 2.0 (Thermo Scienti fi c).
● Rtx-5MS kolom kapiler silika leburan (Crossbond 5% difenil- / 95% dimetil-
polisiloksan, 30 m × 0,25 mm id, ketebalan film 0,25 mm) untuk analisis GC.
● Sistem HPLC – SPE – NMR, termasuk sistem Agilent HPLC 1100, perangkap SPE
kartrid, antarmuka Prospekt 2 SPE NMR, pompa isokratik, spektrometer 500
atau 600 MHz NMR dengan probe LC 30 ml, dan perangkat lunak Hystar
(Bruker, Billerica, MA, USA).
● Institut Standar dan Teknologi Nasional (NIST) (Gaithersburg, MD, AS;
http://www.nist.gov/srd) sistem perangkat lunak database 2.0.
● Sistem perangkat lunak SIMCA-Pþ 12.0.1 (Umetrics, San Jose, CA, USA).
8.2.2
Prosedur

8.2.2.1 Penanganan Sampel Tanaman Obat

Memanen bahan tanaman segar adalah langkah penting dalam analisis
metabolomik. Untuk menghindari reaksi enzimatis atau kimiawi yang tidak perlu
atau tidak diinginkan dari metabolit, disarankan untuk mengambil sampel tanaman
mentah dengan cepat untuk studi metabolomik. Liofilisasi digunakan untuk
menghilangkan lingkungan berair dan untuk mengendapkan protein atau enzim
untuk mengurangi aktivitas enzimatik, dan membantu mencegah reaksi metabolik
dan degradasi lebih lanjut. Langkah ini membantu memastikan bahwa profil
metabolik yang dihasilkan menunjukkan keadaan fisiologis yang sebenarnya.
1) Kumpulkan tanaman herbal segar sebagai bahan tanaman utuh dan segera
cuci dengan air ledeng untuk menghilangkan kotoran dan kontaminan di
permukaan.
2) Pisahkan seluruh jaringan tanaman menjadi beberapa bagian (mis., Akar dan
bagian udara).
3) Potong jaringan menjadi potongan-potongan kecil dan sesuai dengan
menggunakan alat pemotong rumput dan timbang.
4) Celupkan ke dalam nitrogen cair dalam wadah (wadah Dewar baja tahan karat)
dan masukkan ke dalam kantong dengan kunci zip untuk penyimpanan pada
suhu -80 ○ C hingga beberapa bulan. Namun, degradasi metabolit mungkin
terjadi selama penyimpanan.
5) Jaringan beku dapat langsung mengalami liofilisasi kering.
6) Sampel kering yang lengkap dapat disimpan pada suhu kamar selama beberapa
minggu sebelum ekstraksi atau pada suhu -80 ○ C selama beberapa bulan.
Desikator dapat digunakan untuk penyimpanan sampel kering.

8.2.2.2 Persiapan Sampel untuk Analisis LC-MS

8.2.2.2.1 Pilihan 1
1) Giling sampel beku-kering dengan alu dan mortar di bawah nitrogen cair.
2) Timbang 1 g sampel kering-beku ke dalam botol kaca.
3) Tambahkan 10 ml MeOH 100%.
4) Pusaran dengan kuat selama 1 menit pada suhu kamar (20-25 ○ C).
5) Sonikasi setiap sampel selama 15 menit pada frekuensi maksimum secara terus-
menerus dalam penangas air pada suhu kamar.
6) Saring ekstrak melalui membran PTFE 0,22 mm.
7) Transfer ekstrak ke dalam botol kaca baru yang sesuai untuk autosampler LC-
MS dan melakukan analisis LC-MS.

8.2.2.2.2 pilihan 2

1) Potong bahan mentah segar atau kering menjadi beberapa bagian dengan alat
pemotong rumput.
2) Rendam potongan dalam 10 kali volume 70% EtOH encernya pada suhu
kamar selama 5 hari dan ulangi prosedur ini sekali.
3) Konsentrasikan ekstrak etanol total dalam vakum (dengan evaporator putar).
4) Tangguhkan total ekstrak dalam air suling (dalam 1 l atau volume yang sesuai).
5) Secara berturut-turut, partisi total ekstrak etanol menggunakan EA (1 l, tiga
kali), BuOH (1 l, tiga kali) untuk menghasilkan fraksi EA, BuOH, dan air.
6) Subjek fraksi EA atau BuOH ke kromatografi kolom silika gel RP-18 untuk
fraksinasi terpandu bioaktivitas lebih lanjut atau langsung ke analisis LC-MS.

8.2.2.3 Analisis LC – MS
Operasi LC untuk LC – MS bergantung pada karakteristik kimia dan polaritasnya.
Biasanya, opsi yang disukai adalah sistem fase balik dengan gradien atau campuran
pelarut isokratik air, ACN, atau MeOH. Sejumlah kecil asam, seperti asam format
atau asam asetat, atau amonium asetat dapat digunakan dalam fase gerak. Dua
antarmuka yang paling banyak digunakan adalah ESI dan ionisasi kimia tekanan
atmosfer (APCI), terutama dalam kaitannya dengan analisis produk alami
tumbuhan. Dalam hubungannya dengan antarmuka ini, berbagai jenis penganalisis,
seperti ion-trap, quadrupole, atau time-of-ight (TOF), dapat digunakan. Ekstrak
tumbuhan kasar umumnya mengandung berbagai jenis senyawa yang memiliki sifat
fisiokimia, ukuran molekul, kelarutan, dan stabilitas yang berbeda. Karena itu,
mengoptimalkan kondisi ionisasi untuk semua metabolit dalam ekstrak kasar sulit.
Untuk tanaman obat dan penelitian jamu, LC-MS digunakan sebagai pendekatan
metabolomik untuk menetapkan sidik jari kimia untuk kontrol kualitas ekstrak
tumbuhan dengan menganalisis metabolit aktif secara farmakologis yang ada dalam
fraksi ekstrak yang diperkaya [23]. Fraksinasi yang dipandu bioaktivitas, bersama
dengan analisis LC-MS dari ekstrak bioaktif tertentu dari tanaman obat, diperlukan
[23,30,39,40]. HPLC-ESI-MS atau HPLC-APCI-MS dengan produk alami
tumbuhan obat digunakan untuk analisis fenolat (misalnya, asam caffeic, asam
cichoric, asam klorogenat), fl glikosida avonoid [misalnya, quercetin 3-O-
rhamnosyl-
! (1 ! 6) -galaktosida, kaempferol 3-O-rhamnosyl- (1 6) -galaktosida, dan
rutin] atau alkamida dari tumbuhan Echninacea [23,41],

8.2.2.4 HPLC – Photodiode Array (PDA) MS Setup dan Analisis

1) Siapkan dan buang pelarut fase gerak (minimal 15 menit), pancing pompa dan
selang HPLC.
2) Hubungkan sistem HPLC ke sistem komputer dan mulai program online.
3) Prasyaratkan lampu PDA dan suhu oven kolom setidaknya selama 30 menit
sebelum memulai analisis sampel.
4) Degas sel HPLC dengan kecepatan aliran tinggi (misalnya, 5 ml / menit) selama
setidaknya 15 menit.
5) Mencuci kolom dengan pelarut fase gerak pada laju aliran 1 ml / menit sampai
tekanan dasar mencapai baseline.
6) Program pengaturan untuk pengaturan gradien dan parameter pemisahan
lainnya. Beberapa opsi yang dijelaskan di bawah ini dapat dipertimbangkan.
8.2.2.4.1 Opsi 1 Untuk metabolit target yang mengisi senyawa alkamid
Echinacea, gunakan gradien MeOH dalam air: 40% dari 0 hingga 5 menit,
40–60% dari 5 hingga 15 menit, dan 60–100% dari 15 hingga 60 menit
pada laju aliran 0,2 ml / menit. Puncak eluting dipantau dengan diode-array
detector (DAD) secara bersamaan pada 210 dan 254 nm sebelum injeksi
ke dalam sistem MS.
Untuk Metabolit target yang mengisi senyawa fenolik Echinacea, menggunakan
elusi gradien dengan 0,05% TFA-H2O (pelarut A) dan 0,05% TFA-MeOH (pelarut
B): 5% dari 0 sampai 5 menit, 5-20% dari 5 sampai 30 menit, 20–45% dari 30
hingga 40 menit, dan 45–50% dari 40 hingga 50 menit dengan laju aliran 0,2 ml /
menit. Puncak eluting dipantau dengan DAD secara bersamaan pada 254 dan 330
nm sebelum diinjeksikan ke dalam sistem MS.

8.2.2.4.2 Opsi 2 Untuk metabolit target yang mengisi senyawa fenolik dari
ekstrak tanaman obat lain, seperti fraksi BuOH dari tanaman obat tertentu,
gunakan gradien pelarut 0,05% TFA-ACN (pelarut B) dalam 0,05% TFA-
H2O (pelarut A) : 10–11% dari 0 hingga 10 menit, 11–19% dari 10 hingga
15 menit, 19–21% dari 15 hingga 35 menit, 21–28% dari 35 hingga 47
menit, 28–100% dari 47 hingga 55 menit , dipertahankan pada 100% dari
55 hingga 57 menit, 100-10% dari 57 hingga 60 menit, dan re-ekuilibrasi
dengan 10% dari 60 hingga 62 menit dengan laju aliran 0,2 ml / menit.
Puncak eluting dipantau dengan DAD secara bersamaan pada 330 nm
sebelum injeksi ke dalam sistem MS.

1) Masukkan 1 ml (10 mg / ml) atau 5 ml (1 mg / ml) sampel ke dalam kolom

[misalnya, Phenomenex Luna 3 mm×C18, 150 2.0 mm id] dengan laju aliran 0,2
ml / menit. Sampel dapat disaring melalui membran PTFE 0,22 mm atau diberi
SPE dengan kartrid C18-E (Fenomenex) sebelum disuntikkan ke dalam kolom.
2) Mulailah dengan kondisi gradien untuk profil.
3) Program detektor PDA untuk memperoleh data setiap 2 detik dari panjang
gelombang yang diinginkan dengan resolusi 4 nm.
4) Sistem ESI-MS harus dikondisikan minimal selama 1 jam.
5) Untuk kalibrasi MS, masukkan larutan kalibrasi [kafein, m / z 195; MRFA (L-
methionylarginylphenylalanylalanine acetate), m / z 524; Ultramark 1621, m / z
1022, 1122, 1322, 1422, 1522, 1622, 1722, 1822] ke dalam sumber ESI,
kemudian pantau tampilan real-time dari spektrum massa solusi kalibrasi sesuai
dengan instruksi manual massa spektrometer.
6) Lakukan ESI dalam mode ion positif. Kondisi untuk analisis MS dari setiap
puncak HPLC meliputi tegangan kapiler 4,5 kV, laju aliran gas selubung 40
unit arbitrer, laju aliran gas tambahan 20 unit arbitrer, dan suhu kapiler
perpindahan ion 300 ○ C.

8.2.2.5 Analisis GC-MS

Pemisahan GC dari bahan kimia volatil (misalnya, asam lemak volatil) pertama kali
dijelaskan pada tahun 1952 [44], dan metode profil metabolik berbasis GC-MS
untuk profil metabolit tanaman dikembangkan pada awal 1990-an [19]. GC-MS
sekarang digunakan secara luas untuk analisis online konstituen kimia dalam
ekstrak herbal, memastikan kualitas ramuan, dan klasifikasi atau analisis
filogenetik spesies tanaman obat [23,45]. Pemisahan dengan GC dicapai dengan
awalnya mengadsorpsi analit pada permukaan GC
kolom pada suhu yang sedikit lebih tinggi dan kemudian menaikkan suhu untuk
mendorong analit dari permukaan kolom. Gas pembawa kemudian mengangkut
analit di sepanjang permukaan kolom menuju detektor. Detektor berbasis MS
digunakan untuk keuntungan besar dalam analisis metabolomik. Antarmuka yang
paling banyak digunakan untuk sistem GC-MS adalah mode ionisasi elektron (EI)
dan ionisasi kimia (CI). Spektrum IE sangat dapat direproduksi dari instrumen ke
instrumen, dan perpustakaan spektral komersial tersedia untuk mencari identitas
senyawa yang tidak diketahui berdasarkan m / z dan rasio intensitas ion fragmen
yang diamati, sedangkan CI sangat penting untuk menentukan massa molekul
relatif dari analit yang tidak diketahui. Untuk detektor massa, quadrupole tunggal
adalah penganalisis massa yang digunakan secara luas dan relatif murah; namun,
kecepatan scan rendah dibandingkan dengan jenis detektor lainnya. Instrumen TOF
adalah penganalisis massa yang paling umum digunakan dan memiliki laju
pemindaian tercepat, dan mampu memperoleh jumlah spektrum yang signifikan di
setiap puncak, sehingga mengarah ke sensitivitas yang lebih tinggi dan kualitas
spektral yang lebih baik [46]. GC-MS telah digunakan sebagai metode yang efisien
untuk memisahkan dan mengidentifikasi minyak atsiri, produk alami seperti mono-
dan seskuiterpen, dan oligosakarida dalam beberapa tanaman obat Cina [47,48].
Metabolit tumbuhan mencakup banyak sekali polaritas; Oleh karena itu, untuk
menutupi sebanyak mungkin metabolit dalam satu kali GC-MS, dalam banyak
kasus, langkah derivatisasi diperlukan untuk mendapatkan cakupan senyawa yang
maksimal. Keuntungan yang ditawarkan oleh derivatisasi sampel telah dijelaskan
[46]. Instrumen TOF adalah penganalisis massa yang paling umum digunakan dan
memiliki laju pemindaian tercepat, dan mampu memperoleh jumlah spektrum yang
signifikan di setiap puncak, sehingga mengarah ke sensitivitas yang lebih tinggi dan
kualitas spektral yang lebih baik [46]. GC-MS telah digunakan sebagai metode
yang efisien untuk memisahkan dan mengidentifikasi minyak atsiri, produk alami
seperti mono- dan seskuiterpen, dan oligosakarida dalam beberapa tanaman obat
Cina [47,48]. Metabolit tumbuhan mencakup banyak sekali polaritas; Oleh karena
itu, untuk menutupi sebanyak mungkin metabolit dalam satu kali GC-MS, dalam
banyak kasus, langkah derivatisasi diperlukan untuk mendapatkan cakupan
senyawa yang maksimal. Keuntungan yang ditawarkan oleh derivatisasi sampel
telah dijelaskan [46]. Instrumen TOF adalah penganalisis massa yang paling umum
digunakan dan memiliki laju pemindaian tercepat, dan mampu memperoleh jumlah
spektrum yang signifikan di setiap puncak, sehingga mengarah ke sensitivitas yang
lebih tinggi dan kualitas spektral yang lebih baik [46]. GC-MS telah digunakan
sebagai metode yang efisien untuk memisahkan dan mengidentifikasi minyak atsiri,
produk alami seperti mono- dan seskuiterpen, dan oligosakarida dalam beberapa
tanaman obat Cina [47,48]. Metabolit tumbuhan mencakup banyak sekali polaritas;
Oleh karena itu, untuk menutupi sebanyak mungkin metabolit dalam satu kali GC-
MS, dalam banyak kasus, langkah derivatisasi diperlukan untuk mendapatkan
cakupan senyawa yang maksimal. Keuntungan yang ditawarkan oleh derivatisasi
sampel telah dijelaskan [46]. sehingga mengarah ke sensitivitas yang lebih tinggi
dan kualitas spektral yang lebih baik [46]. GC-MS telah digunakan sebagai metode
yang efisien untuk memisahkan dan mengidentifikasi minyak atsiri, produk alami
seperti mono- dan seskuiterpen, dan oligosakarida dalam beberapa tanaman obat
Cina [47,48]. Metabolit tumbuhan mencakup banyak sekali polaritas; Oleh karena
itu, untuk menutupi sebanyak mungkin metabolit dalam satu kali GC-MS, dalam
banyak kasus, langkah derivatisasi diperlukan untuk mendapatkan cakupan
senyawa yang maksimal. Keuntungan yang ditawarkan oleh derivatisasi sampel
telah dijelaskan [46]. sehingga mengarah ke sensitivitas yang lebih tinggi dan
kualitas spektral yang lebih baik [46]. GC-MS telah digunakan sebagai metode
yang efisien untuk memisahkan dan mengidentifikasi minyak atsiri, produk alami
seperti mono- dan seskuiterpen, dan oligosakarida dalam beberapa tanaman obat
Cina [47,48]. Metabolit tumbuhan mencakup banyak sekali polaritas; Oleh karena
itu, untuk menutupi sebanyak mungkin metabolit dalam satu kali GC-MS, dalam
banyak kasus, langkah derivatisasi diperlukan untuk mendapatkan cakupan
senyawa yang maksimal. Keuntungan yang ditawarkan oleh derivatisasi sampel
telah dijelaskan [46]. Metabolit tumbuhan mencakup banyak sekali polaritas; Oleh
karena itu, untuk menutupi sebanyak mungkin metabolit dalam satu kali GC-MS,
dalam banyak kasus, langkah derivatisasi diperlukan untuk mendapatkan cakupan
senyawa yang maksimal. Keuntungan yang ditawarkan oleh derivatisasi sampel
telah dijelaskan [46]. Metabolit tumbuhan mencakup banyak sekali polaritas; Oleh
karena itu, untuk menutupi sebanyak mungkin metabolit dalam satu kali GC-MS,
dalam banyak kasus, langkah derivatisasi diperlukan untuk mendapatkan cakupan
senyawa yang maksimal. Keuntungan yang ditawarkan oleh derivatisasi sampel
telah dijelaskan [46].

8.2.2.6 Persiapan Ekstrak Tanaman untuk Analisis GC-MS

8.2.2.6.1 Opsi 1 Ekstraksi Cairan Superkritis (SFE)

1) Timbang 3–6 g sampel kering-beku dan masukkan ke dalam kartrid ekstraksi 10
ml. Filter cadangan (0,5 mm) ditempatkan di kedua ujung kartrid untuk
mencegah perpindahan partikel.
2) Letakkan kolom ekstraksi ke dalam ruang pengatur suhu dari ekstraktor fluida
superkritis dan setarakan ke suhu ekstraksi yang telah ditentukan (misalnya, 60
○ C).
3) Pompa bertekanan tinggi memampatkan CO2 ke tekanan prasetel yang
diinginkan (mis. 3500 psi). Fase superkritis pada saluran keluar ekstraktor fluida
superkritis dilewatkan melalui dua katup otomatis sehingga tekanan dikurangi
secara perlahan melalui botol penampung.
4) Jaga suhu katup pembatas pada 10–15 ○ C lebih tinggi dari suhu di
ruang ekstraktor.
5) Siapkan kondisi ekstraksi: 60 ○ C, 3500 psi, laju aliran 1,5 ml / menit selama 30 menit 1)
6) Kumpulkan ekstrak dalam EA (atau MeOH) dan keringkan udara di atas gas nitrogen.
7) Transfer ekstrak ke dalam botol kaca baru yang sesuai untuk autosampler GC-
MS dan melakukan analisis GC-MS atau melakukan derivatisasi senyawa yang
dijelaskan di bawah ini.

1) Persentase perolehan senyawa nabati oleh SFE dapat dioptimalkan dengan

memvariasikan variabel ekstraksi seperti suhu (misalnya, 40, 50, atau 60 ○ C),
tekanan (misalnya, 2500, 3000, atau 3500 psi), laju aliran pelarut superkritis (misalnya, 1,
1,5, atau 2 ml / menit), dan waktu kontak.
8.2.2.6.2 Opsi 2 Ekstraksi Metanol

1) Giling sampel beku-kering dengan menggunakan dari alu dan lesung di bawah
nitrogen cair.
2) Timbang 1 g sampel kering-beku ke dalam botol kaca.
3) Tambahkan 10 ml MeOH 100%.
4) Pusaran dengan kuat selama 1 menit pada suhu kamar (20-25 ○ C)
5) Sonikasi setiap sampel selama 15 menit pada frekuensi maksimum secara terus-
menerus dalam penangas air pada suhu kamar.
6) Saring ekstrak melalui membran PTFE 0,22 mm.
7) Tambahkan 25 ml hexadecane (10 ml / ml larutan stok dalam air suling) sebagai
standar kuantitatif internal dan pusaran selama 10 detik.
8) Transfer ekstrak ke dalam botol kaca baru yang sesuai untuk autosampler GC-
MS dan melakukan analisis GC-MS atau melakukan derivatisasi senyawa yang
dijelaskan di bawah ini.

8.2.2.6.3 Contoh Derivatisasi

1) Timbang 1–10 mg residu ekstrak kering udara nitrogen ke dalam botol kaca 5 ml
2,3)
dan tambahkan 200 ml larutan piridin. 4)
2) Aduk rata menggunakan penangas ultrasonik.
3) Tambahkan 800 ml BSTFA dan TMCS yang baru dibuka. Tambahkan ribitol
standar internal (20 ml larutan stok 0,2 mg / ml dalam air suling) untuk
trimetilsilasi secara bersamaan. Alkana [49], asam lemak [50], atau ester [51]
dapat digunakan sebagai standar indeks waktu retensi.
4) Inkubasi selama 60 menit pada suhu 70 ○ C dalam bak air. 5)
5) Letakkan botol reaksi pada pelat autosampler GC – MS.

8.2.2.7 Parameter dan Analisis GC-MS

1) Letakkan botol sampel pada pelat autosampler selama beberapa menit untuk
kesetimbangan termal.
2) Lagu spektrometer massa sesuai dengan rekomendasi pabrikan.
3) Lakukan GC pada kolom kapiler silika leburan Rtx-5MS (Crossbond 5%
difenil- / 95% dimetilpolisiloksan, id 30 m × 0,25 mm, ketebalan film
0,25 mm) atau kolom kapiler silika leburan Supelcowax-10 (30 mm0.25 × mm,
ketebalan film 0,25 mm).

2) Lima atau enam ulangan biologis

4) Reagen ini sangat beracun, dan
direkomendasikan; namun, jumlah
ulangan bisa lebih tinggi tergantung pada
analisis kekuatan yang ditentukan dari
tingkat varians dalam populasi.
3) Sampel kosong (atau kontrol non
5) Derivatisasi waktu dan suhu
sampel), yang tidak mengandung
ekstrak metabolit dalam botol sampel,
harus diderivatisasi bersama dengan
sampel lainnya. Sampel kosong harus
dijalankan di setiap percobaan untuk
mengidentifikasi kontaminan.
harus ditangani dengan hati-hati di
bawah sungkup kimia dengan
menggunakan sarung tangan dan
kacamata.
mempengaruhi hasil dari hasil [51]; oleh
karena itu, waktu dan suhu dapat
diubah, tergantung pada senyawa
tertentu atau jenis senyawa yang akan
diderivatisasi; suhu yang lebih tinggi,
waktu yang lebih lama dan / atau
konsentrasi reagen yang lebih tinggi
harus dievaluasi.
4) Masukkan 1 ml sampel6) ke kolom dalam mode split atau splitless. Suhu
injektor dan antarmuka disetel pada 230 ○ C dan suhu sumber ion pada 200 ○ C.
Helium digunakan sebagai gas pembawa dengan laju aliran 1 ml / menit.
5) Lakukan analisis GC dengan program suhu berikut: mulai dengan suhu kolom
80 ○ C, 5 menit isotermal, kemudian naikkan suhu oven pada 5 ○ C / menit
hingga 330 ○ C, lakukan pemanasan isotermal pada 330 ○ C selama 5 min,
kemudian setarakan sistem pada 80 ○ C selama beberapa menit sebelum injeksi
sampel berikutnya.
6) Deteksi analit pada energi pelapis sumber ion 70 eV.
7) Rekam spektrum massa dalam mode pemindaian penuh dengan rentang
pemindaian m / z 50–650 dan waktu kejadian pemindaian 0,58 detik.

8.2.2.8 LC-MS dan Analisis Data GC-MS

1) Pencacahan puncak: langkah pertama dalam pemrosesan data. Ekstraksi
puncak intensitas rendah dari gangguan spektral.
2) Penyelarasan puncak: setiap kromatogram dikoreksi untuk waktu retensi
secara terpisah karena campuran kompleks yang ada dalam ekstrak
tumbuhan dapat menghasilkan kromatogram yang sangat kompleks yang
dapat menyebabkan penetapan puncak yang salah.
3) Dekonvolusi spektral komponen murni yang diduga dari puncak yang tumpang tindih.
4) Cocokkan dan sejajarkan puncak yang mewakili analit yang sama dari sampel yang
berbeda.
5) Identifikasi waktu retensi untuk setiap standar internal atau metabolit
tumbuhan asli dengan ID yang diketahui dan tetapkan indeks waktu retensi
untuk setiap puncak masing-masing.
6) Tentukan konsentrasi absolut beberapa metabolit dengan perbandingan dengan
kurva kalibrasi rasio respons dari berbagai konsentrasi larutan senyawa
standar.
7) Hasilkan data yang terdiri dari tiga dimensi: titik waktu retensi (RT), nilai m /
z, dan intensitas (kelimpahan ion). Masukkan data ke dalam sistem perangkat
lunak Xcalibur.
8) Cocokkan dan selaraskan data di kumpulan data yang berbeda.
9) Identifikasi atau beri keterangan ID metabolit dengan menggunakan database
NIST dari spektrum EI atau dengan perbandingan dengan data GC-MS dari
literatur. Perpustakaan spektral massa senyawa nabati internal yang dibangun
dengan teknik GC-MS atau LC-MS sangat penting untuk identifikasi senyawa,
terutama untuk senyawa dengan aktivitas farmakologis.
10) Untuk mengklasifikasikan komponen spektral massa yang tidak diketahui,
perpustakaan spektral massa dari sejumlah perwakilan teridentifikasi dan
komponen yang tidak diketahui telah disusun dari profil GC-MS atau LC-MS
dari substansi referensi dan matriks tanaman [23]. Setiap metabolit tunggal
dibandingkan secara terpisah dengan perpustakaan massal built-in yang
lengkap. Untuk menghindari kesalahan penggunaan yang unik

6) Jika standar internal yang digunakan tidak diperlukan untuk derivatisasi, maka standar
internal ditambahkan dan dicampur dengan sampel senyawa sebelum diinjeksikan ke
kolom GC.
 massa untuk identifikasi senyawa karena kemunculan senyawa baru dengan
jejak massa yang sama dalam jendela waktu retensi yang sama dengan
senyawa lain, pemeriksaan manual kromatogram sangat disarankan.
11) Analisis klaster: metode tanpa pengawasan, analisis komponen prinsip
(PCA), dan analisis klaster hierarki digunakan dengan perangkat lunak
SIMCA-P mengikuti panduan pengguna yang tersedia dari beranda
Umetrics (http: // www. umetrics.com/). Sebagai alternatif, bioplot [52] dan
plot terkait umum [53] untuk analisis statistik multivariat dan metode
visualisasi digunakan [23]. Metode yang diawasi (misalnya, analisis
diskriminan kuadrat-terkecil parsial (PLS-DA), prosedur kemometri yang
diawasi) digunakan untuk mendefinisikan klasifikasi maksimum dan
pemisahan sampel independen.
12) Analisis statistik: intensitas metabolit disajikan sebagai standar T rata-rata
deviasi (SD). Analisis statistik dilakukan dengan SAS v9.0 (SAS Institute,
Cary, NC, USA). Signifikansi statistik metabolit yang ada dalam kelompok
atau perlakuan yang berbeda ditentukan oleh analisis varian (ANOVA) dengan
uji post-hoc Fisher. Nilai p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

8.2.2.9 Analisis LC – SPE – NMR

Di antara metode analitik bertanda hubung dalam studi metabolomik, spektroskopi
NMR memberikan informasi struktural yang paling berguna untuk elusi struktural
produk alami tumbuhan. Metode konvensional penelitian produk alam atau analisis
metabolit dengan spektroskopi NMR adalah dengan menggunakan tabung NMR
silinder 5 mm yang membutuhkan jumlah relatif besar (kisaran miligram) senyawa
yang diinginkan. Selain itu, proses tersebut membutuhkan waktu yang cukup lama
dan membutuhkan bahan tanaman awal berskala kilogram untuk melakukan isolasi
dan pemurnian bahan kimia penyusunnya. Namun, Tantangan yang cukup besar
untuk studi metabolomik metabolit tanaman dengan spektroskopi NMR muncul
jika senyawa target yang akan dianalisis terdapat sebagai komponen minor dalam
campuran tanaman yang kompleks dan tidak dapat diatasi dengan baik oleh LC
atau tidak stabil selama proses pemisahan. Oleh karena itu pengembangan
metodologi NMR yang sangat efisien dan sensitif untuk menyaring atau
membedakan senyawa baru, yang dikenal, atau senyawa minor sangat penting
untuk menghindari konsumsi waktu, bahan tanaman, dan tenaga staf yang tidak
perlu, dan untuk mempercepat kemajuan penelitian [54].
Untuk meningkatkan batas deteksi NMR, CryoFlowProbe (Bruker) dan SPE online
(LC–
SPE-NMR) dikembangkan [55]. Dibandingkan dengan LC-NMR, LC-SPE-NMR
menawarkan keuntungan sebagai berikut: (i) beberapa perangkap puncak dari
metabolit yang ditargetkan pada kartrid SPE untuk meningkatkan sensitivitas dan
kualitas pengukuran NMR;
(ii) mengeringkan kartrid dengan menggunakan gas inert (N2) untuk mengurangi
efek pelarut / penyangga pada data NMR dan untuk mencegah dekomposisi
senyawa yang terperangkap yang labil terhadap oksigen [54]. Teknik HPLC-SPE-
NMR menggunakan kepala probe aliran LC-NMR berguna dalam mengidentifikasi
beberapa unsur alami dan metabolit obat dengan mengizinkan penentuan struktur
produk alami langsung dari sejumlah kecil ekstrak [56]. Ini mempercepat
dereplikasi ekstrak dan membantu menghindari proses panjang isolasi ulang dari
konstituen ekstrak yang sudah diketahui.
Baru-baru ini, sidik jari metabolik berbasis NMR telah digunakan untuk kontrol
kualitas bahan fitofarmasi dan herbal [57,58]. Metode HPLC-SPE-NMR telah
digunakan untuk mengidentifikasi senyawa nabati yang baru dengan cepat
(misalnya, lignan, glikosida iridoid isobarik, turunan asam kuinat, dan konstituen
alkaloid) dari ekstrak kasar tanaman obat [54,59-62].
Sebelum memulai analisis online HPLC-SPE-NMR, kondisi HPLC yang
dioptimalkan yang dapat memberikan pemisahan terbaik dari metabolit tanaman
dalam ekstrak mentah atau yang diperkaya sangat penting untuk analisis NMR
dengan tanda hubung. Untuk sebagian besar operasi LC-NMR atau LC-SPE- NMR,
kolom fase terbalik digunakan, dengan campuran pelarut biner atau tersier dengan
elusi isokratik atau gradien dan eluen yang memiliki resonansi 1H-NMR sesedikit
mungkin (misalnya, ACN, MeOH , atau H2O, yang dapat diganti dengan D2O).

8.2.2.10 Persiapan Sampel dan Analisis LC-SPE-NMR

1) Pemanenan dan pengambilan sampel bahan tanaman dijelaskan di Bagian 8.2.2.1.
2) Giling tanaman hingga menjadi bubuk dan rendam 2 g bahan bubuk dengan 10
ml pelarut organik (disarankan MeOH) selama 1-3 hari pada suhu kamar.
3) Saring ekstrak dengan kertas saring (misalnya, kertas penyaring Advantec No.
2) dan kemudian kumpulkan dan konsentrasikan ekstrak di bawah vakum
untuk menghasilkan residu.
4) Larutkan 100 mg residu ekstrak dalam 10 ml ACN grade HPLC dan saring dengan a
Membran PTFE 0,45 mm.
5) Masukkan 5 ml filtrat ke dalam kolom HPLC dengan kondisi gradien yang
telah ditetapkan sebelumnya dan dioptimalkan untuk pemisahan dan
×
pemfilteran puncak senyawa yang baik. Misalnya, kolom RP C18 analitik (150
4.6 mm id), air murni, dan ACN grade HPLC digunakan; laju aliran 0,8 ml /
menit dan kondisi gradien bisa 0 menit 5% ACN sampai 30 menit 100%
asetonitril. 7) Kromatogram direkam dengan detektor PDA (atau spektrometer
massa). Kondisi HPLC seperti kolom, pelarut elusi dan gradien, dan laju aliran
dapat diubah tergantung pada jenis senyawa yang ada dalam ekstrak tumbuhan
mentah atau diperkaya.
6) Aliran tambahan air murni dengan laju aliran 2–2,4 ml / menit ditambahkan ke
eluen kolom pos dengan menggunakan pompa isokratik.
7) Analit yang ada di puncak kromatografi dihubungkan dengan penggunaan
perangkat lunak Hystar (Bruker) untuk beberapa perangkap pada kartrid SPE
individu [misalnya, kartrid resin GP HySphere (10 × 2 mm)] 3–10 kali.
Perangkap puncak ganda dapat memberikan peningkatan substansial dalam
jumlah analit yang tersedia untuk analisis NMR.

7) Analisis HPLC-SPE-NMR lebih sensitif

8) Kondisi untuk kromatografi kolom RP
terhadap pengotor kecil yang umumnya
dan pilihan kartrid SPE dalam studi
ada dalam pelarut organik, yang dapat
kasus yang berbeda dan kompleksitas
terakumulasi dalam proses beberapa
efisiensi penjebakan dan pemulihan
penjebakan. Oleh karena itu, ACN-air
analit sebagai fungsi fase diam SPE dan
harus digunakan sebagai fase gerak atau
pelarut elusi telah dilaporkan [56,60].
pelarut pengiriman untuk kondisi HPLC
untuk menghindari kemungkinan
kontaminasi.
 8) Keringkan kartrid SPE dengan aliran gas nitrogen semalaman.
9) Elusi analit yang terperangkap di setiap kartrid dengan pelarut deuterasi
(misalnya, ACN) ke dalam probe aliran LC-NMR 30 ml.
10) Spektrum 1D 1H-NMR untuk setiap senyawa yang dipisahkan dicatat dengan
menggunakan program pulsa penekan pelarut ganda untuk proton sisa dan
sinyal air dalam pelarut deuterasi. Semua spektrum diukur pada 300 K, dan
untuk setiap pengukuran, 1024 pindaian diakumulasikan.9)
11) Spektrum NMR 2D direkam dengan menggunakan program pulsa standar
(HSQC, COZY, dan NOESY) .10)

8.2.2.11 Analisis Data HPLC – SPE – NMR

1) Dapatkan data NMR dan digitalisasi nilai numerik untuk analisis statistik lebih
lanjut.
2) Bagilah spektrum NMR menjadi serangkaian wadah kecil (ember). Jumlah
intensitas sinyal di setiap nampan dihitung dengan intensitas relatif sehubungan
dengan area referensi atau jumlah total intensitas setelah penghapusan sinyal
yang tidak diinginkan dari pelarut sisa atau air. Rinciannya dijelaskan oleh Kim
et al. [63]. Spektrum NMR dapat diproses dengan menggunakan program
komersial seperti ACD NMR Manager (Advanced Chemistry Development,
Toronto, Kanada) atau AMIX-TOOLS (Bruker Biospin, Rheinstetten, Jerman).
3) Impor data NMR ke dalam sistem perangkat lunak SIMCA-Pþ 12.0.1. Datanya
mean-centered dan diskalakan ke varian Pareto [57,64]. Metode PCA dan
PLS-DA digunakan untuk pengelompokan dan klasifikasi sampel atau
variabel independen.

8.3
Aplikasi

Sifat pengobatan tumbuhan yang digunakan dalam sistem pengobatan tradisional

seperti pengobatan Cina tradisional (TCM) dikaitkan dengan adanya berbagai jenis
senyawa aktif biologis. Namun, efek farmakologis dari obat-obatan herbal biasanya
tidak hanya bergantung pada konstituen utama, tetapi juga pada yang minor. Oleh
karena itu, kendali mutu, penemuan unsur aktif, dan bukti khasiat telah lama
dianggap sebagai tugas penelitian yang kritis dan menantang untuk memodernisasi
obat-obatan herbal tradisional. Dalam pendekatan reduksionistik, terkadang
mengidentifikasi

9) Dalam banyak kasus, 1H-NMR cukup

untuk menghasilkan data metabolomik
untuk sampel dalam waktu yang relatif
singkat (5–10 menit untuk 64–128 scan).
Jika sinyal yang tidak diinginkan
disebabkan oleh sisa air, metode
penekanan seperti iradiasi frekuensi radio
lemah (pra-sat) sering digunakan [63].
10) Dalam banyak kasus, kompleksitas
spektral dan sinyal yang tumpang tindih
dalam spektrum 1H-NMR terlalu tinggi
untuk diidentifikasi, terutama
untuk struktur kimiawi dari metabolit
sekunder tumbuhan spesifik spesies. Akses
ke eksperimen 2D NMR (misalnya,
NOESY, ROESY) dan pengumpulan
pergeseran kimia 13C dari eksperimen
HSQC dan HMBC memungkinkan
penjelasan struktur yang ketat dari produk
alami yang kompleks langsung dari
ekstrak tumbuhan mentah atau campuran
senyawa.
 8.4 Perspektif j169
phytocompounds aktif kelimpahan rendah dari tanaman obat hampir tidak dapat
dicapai atau menguraikan tindakan sinergis dari beberapa bahan dalam satu
tanaman atau beberapa formulasi tanaman obat sangat sulit [64,65]. Dalam studi
metabolomik, membuat sidik jari kromatografi dengan analisis online GC-MS, LC-
MS, atau LC-NMR sebagai representasi karakteristik dari komponen aktif kimia
atau farmakologis dalam obat-obatan herbal merupakan kriteria penting untuk
kontrol kualitas dan standarisasi obat herbal. produk, dan telah menarik minat yang
sangat besar [66]. LC – ESI-TOF-MS telah digunakan untuk menjelaskan
komposisi kimiawi PHY906, formulasi pengobatan Cina yang dibuat dari empat
tumbuhan obat yang efektif untuk mengurangi toksisitas gastrointestinal akibat
kemoterapi atau sebagai kemoterapi kanker adjuvan dalam uji klinis [67,68]. Cheng
dan rekan kerjanya mendirikan platform PhytomicsQC termasuk penggunaan LC-
MS untuk karakterisasi kimiawi dan sidik jari kimia, ekspresi gen seluler
diferensial untuk sidik jari bioresponse, dan farmakologi hewan untuk validasi in
vivo. Platform ini memungkinkan kontrol kualitas yang ketat dari produk jamu
[69]. Kontrol kualitas di TCM dengan metabolomik berbasis NMR telah diteliti di
tanaman Ephedra [70] dan produk ginseng [71,72]. Kami menggunakan studi
metabolomik komparatif [23] mengintegrasikan ekstraksi cairan superkritis, GC-
MS, dan data mining untuk mengklasifikasikan dengan mudah tiga spesies obat
Echinacea yang paling banyak digunakan, E. purpurea, E. pallida, dan E.
angustifolia, yang sering salah diidentifikasi atau diganti dalam produk Echinacea
komersial [73,74]. Kami memberikan wawasan baru tentang penggunaan
metabolomik yang muncul ditambah dengan tes bioaktivitas untuk klasifikasi
spesies tanaman obat / nutrisi, kontrol kualitas, dan identifikasi agen botani baru
untuk gangguan inflamasi [23].

8.4
Perspektif

Penerapan teknologi metabolomik throughput tinggi dalam penelitian obat herbal

diharapkan dapat membantu farmaseutika botani berbasis bukti dan mengarah pada
perubahan paradigma menuju pengembangan dan penerapan tanaman kompleks
atau campuran senyawa nabati dalam pengobatan modern [3,75]. Mengembangkan
keterkaitan langsung antara profil kromatografi berbasis senyawa penanda
(bioaktif) atau spektral dengan khasiat produk herbal merupakan tugas penting
dalam penelitian dan pengembangan obat herbal untuk kesehatan manusia.
Kemajuan lebih lanjut dalam teknologi metabolomik, seperti jumlah komponen
yang terdeteksi dalam metode analitik konvensional, throughput metode,
identifikasi senyawa, dan perhitungan yang akurat dalam profil kimia kompleks
dalam kelompok sampel, diperlukan untuk mencakup beragam senyawa fitokimia.
Selain itu, perlu untuk memperkuat basis data spektral dan mengembangkan
analisis data baru dan alat pertambangan untuk menetapkan secara efisien dan
akurat sejumlah besar sinyal analisis dari profil metabolit yang komprehensif untuk
anotasi senyawa tertentu, dan untuk transformasi data, normalisasi, dan integrasi
[76] . Metabolomik adalah pendekatan yang efisien untuk mencari senyawa
phytocompounds atau timbal aktif
 170j 8 Metabolomik dalam Penelitian

Pengobatan Herbal
calon dari jenis tumbuhan, jaringan, atau sediaan fitoplankton, yang juga penting
untuk mengevaluasi kualitas tumbuhan obat secara komprehensif. Seiring dengan
serangkaian uji bioaktivitas dalam sistem mamalia, mengintegrasikan data dan
informasi metabolomik untuk memvalidasi tanda tangan biologis dan kemanjuran
farmakologis tanaman obat akan memfasilitasi pengembangan fitomedis modern
yang dimurnikan dengan metabolom untuk kesehatan manusia.

Referensi

1 Dixon, RA dan Strack, D. (2003)

9 van Breemen, RB, Fong, HHS, dan
Fitokimia memenuhi analisis genom, dan
Farnsworth, NR (2008) Memastikan
seterusnya. Fitokimia, 62,
keamanan suplemen makanan nabati.
815–816.
Saya. J. Clin. Nutr., 87, 509–513.
2 Benderoth, M., Textor, S., Windsor, AJ,
10 Catchpole, GS, Beckmann, M., Enot, DP,
Mitchell-Olds, T., Gershenzon, J., dan
Mondhe, M., Zywicki, B., Taylor, J.,
Kroymann, J. (2006) Seleksi positif
Hardy, N., Smith, A., King, RD, Kell,
mendorong diversi fi kasi dalam
DB, Fiehn, O. , dan Draper, J. (2005)
metabolisme sekunder tanaman. Proc. Natl.
Metabolomik hierarkis menunjukkan
Acad. Sci. AS, 103, 9118–9123.
kesamaan komposisi yang substansial
3 Shyur, LF dan Yang, NS (2008)
antara tanaman kentang yang
Metabolomics untuk penelitian fitomedis
dimodifikasi secara genetik dan
dan pengembangan obat. Curr. Opin.
konvensional. Proc. Natl. Acad. Sci.
Chem. Biol., 12, 66–71.
USA, 102, 14458–14462.
4 Xia, J. dan Wishart, DS (2011) inferensi
11 Kusano, M., Redestig, H., Hirai, T.,
pola biologis, fungsi dan jalur berbasis web
Oikawa, A., Matsuda, F., Fukushima, A.,
dari data metabolomik menggunakan
Arita, M., Watanabe, S., Yano, M.,
MetaboAnalyst. Nat. Protoc., 6, 743–760.
Hiwasa- Tanase, K ., Ezura, H., dan Saito,
5 Sarker, SD dan Nahar, L. (2005) teknik
K. (2011) Meliputi keragaman kimiawi
Hyphenated, dalam Natural Products
tomat yang dimodifikasi secara genetik
Isolation, edisi ke-2 (eds SD Sarker,
menggunakan metabolomik untuk
L. Zatif, dan AI Gray), Metode dalam
penilaian ekivalensi substansial yang
Bioteknologi, Vol. 20, Humana Press,
objektif. PLoS ONE, 6, e16989.
Totowa, NJ, hlm. 233–267.
12 Shao, HB, Chu, LY, Jaleel, CA,
6 Weckwerth, W. dan Morgenthal, K. (2005)
Manivannan, P., Panneerselvam, R., dan
Metabolomics: dari pengenalan pola hingga
Shao, MA (2009) Memahami perubahan
interpretasi biologis. Drug Discov.
yang disebabkan oleh tekanan defisit air
Hari ini, 10, 1551–1558.
dalam metabolisme dasar tanaman tingkat
7 Schauer, N. dan Fernie, AR (2006)
tinggi - secara bioteknologi dan
Metabolomik tumbuhan: menuju fungsi
berkelanjutan meningkatkan pertanian dan
dan mekanisme biologis. Trends Plant
lingkungan hidup di daerah kering di
Sci., 11, 508–516.
dunia. Crit. Rev. Biotechnol., 29, 131–151.
8 Schauer, N., Semel, Y., Roessner, U.,
13 Ruan, CJ dan Teixeira da Silva, JA (2011)
Gur, A., Balbo, I., Carrari, F., Pleban, T.,
Metabolomics: menciptakan potensi baru
Perez-Melis, A., Bruedigam, C., Kopka,
untuk mengungkap mekanisme dalam
J., Willmitzer, L., Zamir, D., dan Fernie,
menanggapi garam dan stres kekeringan
AR (2006) Profil metabolik komprehensif
dan untuk perbaikan bioteknologi xero-
dan fenotipe garis introgresi interspesifik
halophytes. Crit. Rev. Biotechnol., 31, 153–
untuk tomat perbaikan. Nat. Biotechnol.,
169.
24, 447–454.
14 Hall, RD, Brouwer, ID, dan Fitzgerald,
MA (2008) Metabolomik tanaman dan
potensi aplikasinya untuk nutrisi manusia.
Physiol. Plant., 132, 162–175.
15 Manach, C., Hubert, J., Llorach, R., dan 16 Weckwerth, W. (2009) Metabolomics:
Scalbert, A. (2009) Hubungan kompleks mengintegrasikan metabolome dan proteome
antara fitokimia makanan dan kesehatan untuk sistem biologi, dalam Annual Plant
manusia diuraikan oleh metabolomik. Reviews, Vol. 35. Biologi Sistem Tanaman (eds
Mol. Nutr. Food Res., 53, 1303–1315. GM Coruzzi dan RA Guti´errez), Wiley-

Blackwell, Oxford, hlm. 258-289.
17 Pauling, L., Robinson, AB, Teranishi, R.,
dan Cary, P. (1971) Analisis kuantitatif
uap urin dan napas dengan gas-cair
kromatografi partisi. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 68, 2374–2376.
18 Horning, EC dan Horning, MG (1971)
Profil metabolit manusia diperoleh
oleh GC dan GC-MS. J. Chromatogr. Sci.,
9, 129–140.
19 Sauter, H., Lauer, M., dan Fritsch, H.
(1991) Pemfilteran metabolik tanaman:
teknik diagnostik baru, dalam Sintesis dan
Kimia Agrokimia II (eds DR Baker, JG
Fenyes, dan WK Moberg), Simposium
ACS Seri, Vol. 443, American Chemical
Society, Washington, DC,
hlm. 288–299.
20 Fiehn, O., Kopka, J., Dormann, P.,
Altmann, T., Trethewey, RN, dan
Willmitzer, L. (2000) Metabolite yang
menghasilkan genomik fungsional
tanaman. Nat. Biotechnol., 18, 1157–
1161.
21 Matsuda, F., Yonekura-Sakakibara, K.,
Niida, R., Kuromori, T., Shinozaki, K., dan
Saito, K. (2009) anotasi berbasis tag
spektral MS / MS dari profil non-target
tanaman metabolit sekunder. Plant J., 57,
555–577.
22 Moco, S., Schneider, B., dan Vervoort,
J. (2009) Mikrometabolomik tumbuhan:
analisis metabolit endogen yang ada
dalam sel atau jaringan tumbuhan. J.
Proteome Res., 8, 1694–1703.
23 Hou, CC, Chen, CH, Yang, NS, Chen,
YP, Lo, CP, Wang, SY, Tien, YJ, Tsai,
PW, dan Shyur, LF (2010) Pendekatan
metabolomik komparatif digabungkan
dengan
tes berbasis sel dan gen untuk klasifikasi
spesies dan anti-inflamasi validasi
bioaktivitas tanaman Echinacea. J. Nutr.
Biochem., 21, 1045–1059.
Database Metabolom Manusia. Nuklir
Res asam., 35521–526.
31 Lundberg, P., Vogel, T., Malusek, A.,
Lundquist, PO, Cohen, L., dan Dahlqvist,
Referensi j171
24 De Vos, RCH, Moco, S., Lommen, A.,
Keurentjes, JJB, Bino, RJ, dan Hall, RD
(2007) Metabolomik tanaman skala besar
tanpa target menggunakan kromatografi
cair yang digabungkan dengan
spektrometri massa. Nat. Protoc., 2, 778–
791.
25 Mutlib, AE, Strupczewski, JT, dan
Chesson, SM (1995) Penerapan teknik LC
/ NMR dan LC / MS dengan tanda
penghubung dalam identifikasi cepat
metabolit in vitro dan in vivo dari
iloperidone. Obat Metab. Dispos., 23,
951–964.
26 Hostettmann, K., Wolfender, JL, dan
Rodriguez, S. (1997) Deteksi cepat dan
isolasi selanjutnya dari konstituen
bioaktif dari ekstrak tumbuhan mentah.
Planta Med., 63, 2–10.
27 Iwasa, K., Cui, W., Takahashi, T.,
Nishiyama, Y., Kamigauchi, M., Koyama,
J., Takeuchi, A., Moriyasu, M., dan
Takeda,
K. (2010) Biotransformasi fenolik
tetrahydroprotoberberines dalam sel
tumbuhan kultur diikuti oleh LC-NMR,
LC-MS, dan LC-CD. J. Nat. Prod., 73,
115–122.
28 Kang, SW, Kim, CY, Lagu, DG, Pan, CH,
Cha, KH, Lee, DU, dan Um,
BH (2010) Identifikasi cepat
furanocoumarins di Angelica dahurica
menggunakan LC-MMR-MS online dan
aktivitas penghambatan oksida nitratnya
di RAW
264,7 sel. Fitokem. Anal., 21, 322–327.
29 Zehl, M., Braunberger, C., Conrad, J.,
Crnogorac, M., Krasteva, S., Vogler, B.,
Beifuss, U., dan Krenn, L. (2011)
Identifikasi dan kuantifikasi flavonoid dan
elagik turunan asam dalam spesies Drosera
yang penting secara terapi oleh LC-DAD,
LC-NMR, NMR, dan LC-MS. Anal.
Bioanal. Chem., 400, 2565–2576.
30 Wishart, DS, Tzur, D., Knox, C., Eisner,
R., Guo, AC, Young, N., Cheng, D.,
Jewell, K., Arndt, D., Sawhney, S., Fung,
C., Nikolai, L., Lewis, M., Coutouly, MA,
Forsythe, I., Tang, P., Shrivastava, S.,
Jeroncic, K., Stothard, P., Amegbey, G.,
Block, D ., Hau, DD, Wagner, J., Miniaci,
J., Clements, M., Gebremedhin, M., Guo,
N., Zhang, Y., Duggan, GE, Macinnis,
GD, Weljie, AM, Dowlatabadi, R.,
Bamforth, F., Clive, D., Greiner, R., Li,
L., Marrie, T., Sykes, BD, Vogel, HJ, dan
Querengesser, L. (2007) HMDB: the
O. (2005) MDL - The
Magnetic
Database Metabolomik Resonansi
(mdl.imv. liu.se), ESMRMB,
 172j 8 Metabolomik dalam Penelitian
Pengobatan Herbal
Basel.
32 Smith, CA, O'Maille, G., Want, EJ, Qin,
C., Trauger, SA, Brandon, TR, Custodio,
DE, Abagyan, R., dan Siuzdak, G. (2005)
METLIN: massa metabolit database
spektral. Ada. Drug Monit., 27, 747–751.
33 Weljie, AM, Newton, J., Mercier, P.,
Carlson, E., dan Slupsky, CM (2006)
Profil yang ditargetkan: analisis
kuantitatif dari data metabolomik 1H
NMR. Anal. Chem., 78, 4430–4442.
34 Smith, CA, Want, EJ, O'Maille, G.,
Abagyan, R., dan Siuzdak, G. (2006)
XCMS: memproses data spektrometri
massa untuk pengisian metabolit
menggunakan penyelarasan puncak
nonlinier, pencocokan, dan identifikasi.
Anal. Chem., 78, 779–787.
35 Cui, Q., Lewis, IA, Hegeman, AD,
Anderson, ME, Li, J., Schulte, CF,
Westler, WM, Eghbalnia, HR, Sussman,
MR, dan Markley, JL (2008) Identifikasi
Metabolit melalui Madison Database
Konsorsium Metabolomics. Nat.
Biotechnol., 26, 162–164.
36 Neuweger, H., Albaum, SP, Dondrup, M.,
Persicke, M., Watt, T., Niehaus, K., Stoye,
J., dan Goesmann, A. (2008) MeltDB:
platform perangkat lunak untuk analisis dan
integrasi data percobaan metabolomik.
Bioinformatics, 24, 2726–2732.
37 Kastenmuller, G., Romisch-Margl, W.,
Wagele, B., Altmaier, E., dan Suhre, K.
(2011) metaP-server: alat analisis data
metabolomik berbasis web. J. Biomed.
Biotechnol., 2011, 2011.
38 Dieterle, F., Riefke, B., Schlotterbeck, G.,
Ross, A., Senn, H., dan Amberg, A. (2011)
metode NMR dan MS untuk
metabonomics. Metode Mol. Biol., 691,
385–415.
39 Lee, KH (2010) Penemuan dan
pengembangan agen kemoterapi yang
diturunkan dari produk alami
berdasarkan pendekatan kimia obat. J.
Nat. Prod., 73, 500–516.
40 Shyur, LF, Chen, CH, Lo, CP, Wang,
SY, Kang, PL, Sun, SJ, Chang, CA,
Tzeng, CM, dan Yang, NS (2004)
49 Roessner, U., Luedemann, A., Brust, D.,
Fiehn, O., Linke, T., Willmitzer, L., dan
Fermie, A. (2001) Profil metabolik
memungkinkan fenotipe komprehensif
sistem tanaman yang dimodifikasi secara 51 Gullberg, J., Jonsson, P., Nordstrom, A.,
genetik atau lingkungan. Plant Cell, 13, 11–
29.
50 Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J.,
Induksi apoptosis pada MCF-7 manusia
sel kanker payudara oleh fitokimia dari
Anoectochilus formosanus. J. Biomed. Sci.,
11, 928–939.
41 Wang, CY, Staniforth, V., Chiao, MT,
Hou, CC, Wu, HM, Yeh, KC, Chen, CH,
Hwang, PI, Wen, TN, Shyur, LF, dan
Yang, NS (2008) Genomik dan
proteomik dari modulator imun efek dari
fraksi butanol Echinacea purpurea dalam
sel dendritik manusia. BMC Genomics, 9,
479–498.
42 Hou, CC, Chen, YP, Wu, JH, Huang,
CC, Wang, SY, Yang, NS, dan Shyur,
LF (2007) Galaktolipid memiliki efek
kemopreventif kanker baru dengan
menekan mediator inflamasi dan
melanoma B16 tikus. Cancer Res., 67,
6907–6915.
43 Chiang, YM, Chuang, DY, Wang, SY,
Kuo, YH, Tsai, PW, dan Shyur, LF
(2004) Pemfilteran metabolit dan
bioaktivitas kemopreventif dari
ekstrak tumbuhan dari Bidens pilosa.
J. Ethnopharmacol., 95, 409–419.
44 James, AT dan Martin, AJ (1952)
Kromatografi partisi gas-cair: pemisahan
dan estimasi mikro asam lemak volatil
dari asam format menjadi asam
dodekanoat. Biochem. J., 50, 679–690.
45 Jiang, H., Xie, Z., Koo, HJ, McLaughlin,
SP, Timmermann, BN, dan Gang, DR
(2006) Metabolic pro fi ling dan analisis
filogenetik obat spesies Zingiber: alat untuk
otentikasi jahe (Zingiber of fi cinale
Rosc.) . Fitokimia, 67, 1673–1685.
46 Fancy, SA dan Rumpel, K. (2008)
metabolomik berbasis GC-MS, dalam
Metode Biomarker dalam Penemuan dan
Pengembangan Obat (ed F. Wang), Humana
Press, Totowa, NJ, hal. 317-340.
47 Tung, YT, Chua, MT, Wang, SY, dan
Chang, ST (2008) Aktivitas antiradang
minyak atsiri dan konstituennya dari
ranting kayu manis (Cinnamomum
osmophloeum). Bioresour. Technol.,
99, 3908–3913.
48 Qureshi, MN, Stecher, G., Sultana, T.,
Abel, G., Popp, M., dan Bonn, GK (2011)
Penentuan karbohidrat pada tanaman obat
- perbandingan antara TLC, mf-MELDI-
MS dan GC– MS. Fitokem. Anal., 22,
296–302.
Willmitzer, L., dan Fernie, AR (2006) Gas
kromatografi massa berbasis spektrometri
metabolit yang mengisi tanaman. Nat. Protoc., 1,
387–396.
Sjostrom, M., dan Moritz, T. (2004) Desain
percobaan: strategi yang efisien untuk
mengidentifikasi faktor-faktor yang

mempengaruhi ekstraksi dan derivatisasi
sampel Arabidopsis thaliana dalam studi
metabolomik dengan kromatografi gas /
spektrometri massa. Anal. Biochem., 331,
283–295.
52 Gower, JC dan Hand, DJ (1996) Biplots,
Chapman & Hall, London.
53 Chen, CH (2002) Plot asosiasi umum untuk
visualisasi informasi: aplikasi konvergensi
matriks korelasi yang terbentuk secara
berulang. Stat. Dosa., 12, 1–23.
54 Lee, SS, Lai, YC, Chen, CK, Tseng, LH,
dan Wang, CY (2007) Karakterisasi
alkaloid isoquinoline dari Neolitsea sericea 62 Chen, CK, Lin, FH, Tseng, LH, Jiang, CL,
var. aurata oleh HPLC – SPE – NMR. J.
Nat. Prod., 70, 637–642.
55 Corcoran, O. dan Spraul, M. (2003)
LC-NMR-MS dalam penemuan obat.
Drug Discov. Hari ini, 8, 624–631.
56 Jaroszewski, JW (2005) metode
Hyphenated NMR dalam penelitian
produk alami. Bagian 1. Tanda
hubung langsung. Planta Med., 71,
691–700.
57 van der Kooy, F., Maltese, F., Choi,
YH, Kim, HK, dan Verpoorte, R.
(2009) Kontrol kualitas bahan herbal
dan fitofarmasi dengan sidik jari
metabolik berbasis MS dan NMR.
Planta Med., 75, 763–775.
58 Verpoorte, R., Choi, YH, dan Kim, HK
(2007) metabolomik berbasis NMR bekerja
dalam fitokimia. Fitokem. Wahyu, 6, 3–14.
59 Wang, CY dan Lee, SS (2005) Analisis dan
identifikasi lignan di Phyllanthus urinaria
oleh HPLC-SPE-NMR. Fitokem. Anal., 16,
120–126.
60 Seger, C., Godejohann, M., Tseng,
LH, Spraul, M., Girtler, A., Sturm, S.,
dan
Huangqin Tang (HQT) dan PHY906. Dagu.
Med., 5, 30.
70 Kim, HK, Choi, YH, Erkelens, C., Lefeber,
AW, dan Verpoorte, R. (2005) Pencetakan
sidik jari spesies Ephedra menggunakan
spektroskopi 1H-NMR dan analisis
komponen utama. Chem. Pharm. Banteng.
(Tokyo), 53, 105–109.
Referensi j173
Stuppner, H. (2005) LC – DAD – MS / SPE–
Tanda hubung NMR. Alat untuk analisis
ekstrak tumbuhan yang digunakan secara
farmasi: identifikasi regioisomer glikosida
iridoid isobarik dari Harpagophytum
procumbens. Anal. Chem., 77, 878–885.
61 Sprogoe, K., Staerk, D., Jager, AK,
Adsersen, A., Hansen, SH, Witt, M.,
Landbo, AKR, Meyer, AS, dan
Jaroszewski, JW (2007) Isolasi produk
alami yang ditargetkan dengan panduan
HPLC –SPE– NMR: konstituen spesies
Hubertia. J. Nat. Prod., 70, 1472–1477.
dan Lee, SS (2011) Studi komprehensif
alkaloid dari Crinum asiaticum var. sinicum
dibantu oleh HPLC – DAD – SPE– NMR.
J. Nat. Prod., 74, 411–419.
63 Kim, HK, Choi, YH, dan Verpoorte, R.
(2010) analisis metabolomik berbasis
NMR tanaman. Nat. Protoc., 5, 536–549.
64 Winnike, JH, Busby, MG, Watkins, PB,
dan O'Connell, TM (2009) Pengaruh diet
standar yang berkepanjangan pada
normalisasi metabolisme manusia. Saya.
J. Clin. Nutr., 90, 1496–1501.
65 Williamson, EM (2001) Sinergi dan
interaksi lain dalam phytomedicines.
Phytomedicine, 8, 401–409.
66 Okada, T., Afendi, FM, Altaf-Ul-Amin, M.,
Takahashi, H., Nakamura, K., dan Kanaya,
S. (2010) Metabolomik tanaman obat:
pentingnya analisis multivariat data kimia
analitik. Curr. Comput. Aided Drug Des.,
6, 179–196.
67 Kamu, M., Liu, SH, Jiang, Z., Lee, Y.,
Tilton, R., dan Cheng, YC (2007)
Analisis kromatografi cair / spektrometri
massa PHY906, formulasi pengobatan
Cina untuk terapi kanker. CepatKomun.
Spektrom Massa., 21, 3593–3607.
68 Lam, W., Bussom, S., Guan, F., Jiang, Z.,
Zhang, W., Gullen, EA, Liu, SH, dan
Cheng, YC (2010) Empat ramuan obat
Cina PHY906 mengurangi kemoterapi-
toksisitas gastrointestinal yang diinduksi.
Sci. Terjemahan. Med., 2, 45ra59.
69 Tilton, R., Paiva, AA, Guan, JQ, Marathe,
R., Jiang, Z., van Eyndhoven, W., Bjoraker,
J., Prusoff, Z., Wang, H., Liu, SH, dan
Cheng , YC (2010) Sebuah platform
komprehensif untuk kendali mutu obat-
obatan nabati (PhytomicsQC): studi kasus
71 Kang, J., Lee, S., Kang, S.,
Kwon, HN, Park, JH, Kwon,
SW, dan Park, S. (2008)
Pendekatan metabolomik
berbasis NMR untuk
diferensiasi akar ginseng
(Panax ginseng) dari asal yang
berbeda. Lengkungan. Pharm.
174j 8 Metabolomik dalam Penelitian
Pengobatan
Res.,Herbal
31, 330–336.
72 Yang, SY, Kim, HK, Lefeber, AW,
Erkelens, C., Angelova, N., Choi, YH, dan
Verpoorte, R. (2006) Penerapan
spektroskopi resonansi magnetik nuklir dua
dimensi untuk pengendalian kualitas
ginseng
produk komersial. Planta Med., 72,
364–369.
73 Raloff, J. (2003) lotere Herbal: apa
yang ada di label suplemen
makanan mungkin
bukan apa yang ada di dalam botol. Sci.
News, 163, 359–361.
74 Gilroy, CM, Steiner, JF, Byers, T.,
Shapiro, H., dan Georgian, W. (2003)
Echinacea dan kebenaran dalam
pelabelan. Lengkungan. Magang.
Med., 163, 699–704.
75 Ulrich-Merzenich, G., Zeitler, H., Jobst,
D., Panek, D., Vetter, H., dan Wagner, H.
(2007) Penerapan teknologi "-omic-"
dalam phytomedicine. Phytomedicine, 14,
70–82.
76 Saito, K. dan Matsuda, F. (2010)
Metabolomics untuk genomik fungsional,
biologi sistem, dan bioteknologi. Annu.
Rev. Plant Biol., 61, 463–489.
 Referensi j175

Lihat statistik publikasi