LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA 20211

“Fraksinasi Preparasi Ekstrak dan Pembuatan kolom”

Rabu, 25 November 2020
Dosen Pengampu: Nuri, S.Si., M.Si., Apt

Dilaporkan Oleh:

Nama : Hasnia Pratiwi

NIM : 182210101124

Kelas : C2

Bagian Biologi Farmasi Fakultas

Farmasi Universitas Jember

2020
 1

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI....................................................................................................................................1

BAB I. PENDAHULUAN..................................................................................................................2

1.1 Latar Belakang..............................................................................................................2

1.2 Rumusan Masalah........................................................................................................2

1.3 Tujuan...........................................................................................................................2

1.4 Manfaat........................................................................................................................2

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA..........................................................................................................3

BAB III. METODE...........................................................................................................................5

3.1.1 Alat Dan Bahan.........................................................................................................5

3.1.1 Alat..............................................................................................................................5

3.1.2 Bahan...........................................................................................................................5

3.2 Prosedur Kerja..............................................................................................................6

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN...............................................................................................9

4.1 Hasil Praktikum.............................................................................................................9

4.2 Pembahasan...............................................................................................................11

DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................................................14

LAMPIRAN..................................................................................................................................15
 2

BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Tumbuhan merupakan sumber bahan alam yang digunakan manusia untuk memenuhi
kebutuhan hidup seperti sumber pangan, sandang, papan, pengobatan, dan lain-lain. Pada
umumnya tumbuhan digunakan untuk pengobatan seperti bahan obat tradisional tapi seiring
berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi khususnya pada bidang kimia dan farmasi
mendorong penelitian terhadap tumbuhan dan menggali informasi tentang khasiat dari
tumbuhan untuk mencari alternatif dalam pengadaan bahan baku obat, validasi obat
tradisional, serta mencari potensi senyawa baru yang dapat dimanfaatkan sebagai model.
Meneliti suatu tumbuhan membutuhkan satu proses yang harus dilakukan yaitu proses
ekstraksi, isolasi, fraksinasi, dan identifikasi. Fraksinasi yang merupakan tahapan kedua dari
proses pemisahan senyawa. Fraksinasi adalah tekhnik pemisahan dan pengelompokan
kandungan kimia ekstrak berdasarkan kepolaran. Pada proses fraksinasi digunakan dua pelarut
yang tidak tercampur dan memiliki tingkat kepolaran yang berbeda. Senyawasenyawa yang
terdapat dalam ekstrak akan terpisah menurut kepolarannya. Fraksinasi dapat dilakukan
menggunakan metode kromatografi salah satunya adalah kromatografi kolom. Penggolongan
senyawa ini ditujukan untuk memudahkan proses isolasi dan identifikasi kandungan metabolit
sekunder dalam suatu tumbuhan.
Proses fraksinasi sangat dibutuhkan didunia kefarmasian dalam penentuan kandungan
senyawa metabolit sekunder tumbuhan, oleh karena itu pada praktikum kali ini dilakukan
untuk mengetahui prinsip serta metode fraksinasi menggunkan teknik kromatografi kolom.

1.2 Rumusan Masalah

1.2.1 Bagaimana cara melakukan fraksinasi ekstrak tumbuhan dengan kromatografi
kolom?

1.3 Tujuan
1.3.1 Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi ekstrak tumbuhan dengan
kromatografi kolom

1.4 Manfaat
1.4.1 Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi ekstrak tumbuhan dengan
kromatografi kolom
 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

Guajava L.adalah quercetin yang merupakansenyawa golonganflavonoid jenis flavonol
dan flavon. Senyawa quercetin memiliki potensi sebagai agen antidiare dengan menghambat
pelepasan asetilkolin yang dapat meningkatkan kontraksi usus akibat adanya iritasi oleh
bakteri penyebab diare seperti Staphylococcusaureus,Escherichia coli,Salmonella
enteritidis,Bacillus cereus, dan Vibrio cholera. Selain itu, telah dikenal sejumlah kandungan
glikosida flavonol pada daun Psidium guajava L. yang juga merupakan turunan dari quercetin,
diantaranya adalah quercetin–3–L–rhamonoside yang digunakan untuk pewarna tekstil,
quercetin–3–rutinoside yang biasa disebut rutin dan quercetin–3–glukoside atau isoquercetin
yang memiliki peran untuk mengobati kerapuhanpembuluh kapiler pada manusia (Fratiwi, Y.,
2015).
Glikosida flavonol dan aglikon biasanya dinamakan flavonoid. Glikosida ini merupakan
senyawa yang sangat luas penyebarannya. Di alam dikenal adanya sejumlah besar flavonoid
yang berbeda-beda dan merupakan pigmen kuning yang tersebar luas di seluruh tanaman
tingkat tinggi. Rutin, kuersetin ataupun sitrus bioflavonoid (termasuk hesperidin, hesperetin,
diosmin dan maringenin) merupakan kandungan flavonoid yang paling dikenal. Rutin dan
hesperidin dinamakan vitamin P atau faktor permeabilitas. Rutin dan hesperidin pernah
digunakan dalam pengobatan berbagai kondisi yang ditandai oleh pendarahan kapiler dan
peningkatan kerapuhan kapiler. Juga pernah diusulkan penggunaan bioflavonoid sitrus untuk
pengobatan gejala-gejala penyakit demam. Bukti kemanjuran terapetik dari rutin, sitrus,
bioflavonoid dan senyawa sekerabata terutama diarahkan kepada beberapa sediaa penunjang
diet (food supplement) (Endarini, L., 2016).
Fraksinasi yang merupakan tahapan kedua dari proses pemisahan senyawa. Fraksinasi
adalah tekhnik pemisahan dan pengelompokan kandungan kimia ekstrak berdasarkan
kepolaran. Pada proses fraksinasi digunakan dua pelarut yang tidak tercampur dan memiliki
tingkat kepolaran yang berbeda. Senyawasenyawa yang terdapat dalam ekstrak akan terpisah
menurut kepolarannya (Hawkins & Rahn, 1997).
Proses fraksinasi menggunakan metode kromatografi. Kromatografi adalah proses
pemisahan yang tergantung pada perbedaan distribusi campuran komponen antara fase gerak
dan fase diam. Fase diam dapat berupa pembentukan kolom dimana fase gerak dibiarkan
untuk mengalir (kromatografi kolom) atau berupa pembentukan lapis tipis dimana fase gerak
dibiarkan untuk naik berdasarkan kapilaritas (kromatografi lapis tipis). Perlu diperhatikan
bahwa senyawa yang berbeda memiliki koefisien partisi yang berbeda antara fase gerak dan
diam. Senyawa yang berinteraksi lemah dengan fase diam akan bergerak lebih cepat melalui
 4

sistem kromatografi. Senyawa dengan interaksi yang kuat dengan fase diam akan bergerak
sangat lambat (Christian, 1994; Skoog, 1993).
Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan dimana komponen-komponen
campuran yang dipisahkan menggunakan kolom gelas terpaking dengan fase diamnya.
Sedangkan fase geraknya akan mengalir secara kontinu sepanjang kolom. Prinsip
kromatografi kolom antara lain adalah: kromatografi partisi, kromatografi penukar ion,
kromatografi pegecualian/exclusion ukuran atau kromatografi permeasi gel, dan kromatografi
afinitas
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pemisahan dan pemurnian produk sintesis
menggunakan kromatografi kolom adalah sebagai berikut:
a. Pemilihan fasediamFase diam untuk kromatografi kolom sama seperti pada
kromatografi lapis tipis, yaitu alumina dan silika. Yang harus diperhatikan adalah
ukuran partikel, aktivitas, dan variasi asam/basanya fase diam.
b. Pemilihan fase gerak ataupelarutPelarut menentukan keberhasilan pemisahan dan
pemurnian senyawa target. Pelarut dipilih terlebih dahulu dengan percobaan KLT.
Fase gerak biasanyamerupakan kombinasi dari beberapa pelarut organik,
efektivitas pemisahannya dievaluasi dengan KLT yang dilakukan sebelumnya.
c. PengemasankolomAda dua cara yang sering digunakan dalam pengemasan kolom
yaitu cara basahdankering.Carabasahdilakukandenganmelarutkanfasediamdalam
sebagian fase gerak dan dimasukkan perlahan ke dalam kolom yang telah terisi fase
gerak. Cara kering dilakukan dengan memasukkan fase diam sedikit demi sedikit ke
dalam kolom yang telah terisi fase gerak.
d. PenambahansampelSampel dilarutkan dengan sedikit fase gerak, kemudian
dimasukkan ke kolom yang telah siap.
e. MonitoringkolomKolom harus terus diawasi agar tidak terjadi kegagalan
pemisahan. Fase gerak harus terus dialirkan agar proses pemisahan sempurna
dilakukan. Demikian pula dengan penampungan fraksi-fraksi. Fraksi-fraksitersebut
dievaluasi dengan KLT.
f. Isolasi senyawa yangterpisahFraksi-fraksi yang telah dievaluasi dengan KLT, dapat
dikumpulkan sesuai dengan Rf-nya. Diharapkan senyawa target yang murni dapat
diperoleh di akhir proses kromatografi kolom
 5

BAB III. METODE

3.1.1 Alat Dan Bahan

3.1.1 Alat

1. Timbangan analitik

2. Labu alas bulat

3. Hot plate

4. Chamber

5. Mikropiipet

6. Vial/tabung

7. Lampu UV 254nm dan 365 nm

8. Enlemeyer

9. SEperangkat alat kromatografi Kolom

10. Glass woll

3.1.2 Bahan

11. Extrak daun jambu biji

12. Methanol

13. HCl57%

14. HCl pekat

15. Air

16. Etanol 96%

17. Lempemg KLT/Silica Gel F254

18. Kloroform

19. Aseton

20. Asam formiat

 6

3.2 Prosedur Kerja

3.2.1 Preparasi Ekstrak

Sampel sebanyak 0.3 g ditambah 25 ml metanol dan 0.7 ml HCl 57% v/v
(dihitung dari pengenceran HCl pekat dengan air)

Dimasukkan ke dalam labu alas bulat

Dihidrolisis selama 30 menit pada suhu 70 °C

Pemilihan Eluen untuk Fraksinasi

Standar kuersetindan ekstrak daun Jambu Bijiyang telah dicuci dilarutkan

dalam etanol 96% dan ditotolkan2-5 µl pada lempeng KLT

Lempeng KLT selanjutnya dieluasi dengan menggunakan eluen yang sesuai

di dalam bak kromatografi sampai batas yang ditentukan.

Dimatilah lempeng pada lampu UV 254nm dan 365 nm

Eluen dipilih apabila ekstrak yang ditotolkan menghasilkan nodayang

terpisah dengan baik dan memilikiharga Rf yang sama dengan noda standar.

Catatan : eluen terpilih adalah kloroform : aseton : asam formiat = 150 : 33 : 17

 7

3.2.2 Fraksinasidengan Kromatografi Kolom

 Langkah A

Silika gel sebanyak 100 kali bobot ekstrak dimasukkan dalam Erlenmeyer dan
ditambahkan dengan eluen ± 2 cm diatas permukaan silika gel.

dikocok pelan hingga merata dan masukkan dengan hati-hati ke dalam kolom
kromatografi yang pada bagian bawahnya telah diberi glass wool.

Sebelum penuangan, dinding luar kolom kromatografi disemprot dengan etanol.

Kolom tersebut kemudian didiamkan selama 1 hari untuk memampatkan dan melihat
ada tidaknya keretakan (lihat gambar dibawah ini).

Gambar 5. Langkah-langkah pemisahan dengan kromatografi kolom

 Langkah B

Apabila kolom tidak retak, ditambahkan eluen 0,5 cm diatas permukaan silika gel
dan bila retak langkah A diulangi.

Ke dalam kolom ditambahkan ekstrak (1% bobot silika) yang telah dicampur dengan
silika gel.
 8

 Langkah C

Eluen dialirkan dan tampung sebanyak ±50 ml dalam Erlenmeyer (eluen ini
belum membawa zat kimia tanaman sehingga dapat dibuang).

kran dibuka dan diatur penetesannya (1 tetes/detik) dan ditampung dalam

vial atau tabung yang telah diberi nomor masing-masing vial 25 ml (10 vial)
(lihat gambar dibawah ini).

 Langkah D

Pada setiap vial dilakukan uji KLT untuk melihat noda yang dihasilkan.

Apabila menghasilkan noda yang sama, vial-vial tersebut digabung. Penetesan

dihentikan apabila vial sudah tidak memberikan noda saat diuji KLT.
 9

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Praktikum

Penimbangan Ekstrak

Ekstrak ditambahkan 25 ml metanoldan 0,7 ml HCl 57%

v/v

Ekstrak ditambahkan 25 ml metanol dan 0,7 ml HCl 57%

v/v

Ekstrak dimasukkan ke dalam labualas bulat

Ditambahkan batu didih pada labu alas bulat

Dilakukan proses hidrolisis dengan suhu 70◦C

Ekstrak yang telah dihidrolisis dipekatkan dalam
rotavapour
 10

Dibuat eluen kloroform : aseton : asam formiat

(150:33:17)

Glass wool dicelupkan kedalam eluen

Glass wool yang telah basah dimasukkan ke dalam dasar

kromatografi kolom dan dipastikan tidak terdapat udara

Ditimbang silica gel sebanyak 100x bobot ekstrak lalu

dibasahi eluen hingga tinggi eluen 2 cm diatas
permukaan silica. Dikocok pelan hingga merata.

Dimasukkan ke dalam kromatografi kolom. Setelah silica

masuk ke dalam kolom, ditambahkan eluen dan ditutup
dengan kapas dan alumunium foil agar eluen dalam
kolom tidak menguap

Kolom didiamkan semalaman. Keesokan harinya bila

kolom tidak retak, dikeluarkan eluen hingga mencapai 0,5
cm diatas permukaan
Disiapkan ekstrak yang sudah dipekatkan dan
ditambahkan silica gel. Ekstrak yang sudah ditambahkan
silica gel dimasukkan ke dalam kolom
Kolom dialiri eluen terus menerus dan ditampung 50 ml
eluen dalam Gelas ukur (eluen yang ditampung belum
membawa zat kimia pada ekstrak)
 11

Ketika eluen dikeluarkan, terus tambahkan eluen ke

dalam kolom (silica tidak boleh kering)

Kran dibuka dan diatur tetesannya (1 tetes/detik) dan

ditampung dalam 10 vial yang telah dikalibrasi 25 ml
sebelumnya

Vial dimasukkan kedalam lemari asam untuk uji KLT

berikutnya

4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan proses fraksinasi ekstrak daun jambu biji
menggunakan teknik kromatografi kolom dan yang dilakukan terlebih dahulu adalah
preparasi ekstrak dan pembuatan kolom. Sebelum dilakukan fraksinasi terlebih dahulu
dilakukan proses preparasi ekstrak setelah penimbangan ekstrak, ekstrak ditambahkan 25 ml
methanol dan 0,7 HCl 57% v/v kemudian ditambahkan ke dalam labu alas bulat dan dilakukan
proses hidrolisis dengan suhu 70ºC.
Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan dimana komponen-komponen
campuran yang dipisahkan menggunakan kolom gelas terpaking dengan fase diamnya.
Sedangkan fase geraknya akan mengalir secara kontinu sepanjang kolom. Prinsip
kromatografi kolom antara lain adalah: kromatografi partisi, kromatografi penukar ion,
kromatografi pegecualian/exclusion ukuran atau kromatografi permeasi gel, dan kromatografi
afinitas
Proses pemilihan fase gerak, pertama kali menggunakan fase gerak yang harus
diperhatikan adalah komposisinya. Dipilih komposisi fase gerak yang terbaik artinya, fase
gerak bisa memisahkan senyawa- senyawa yang diinginkan dengan baik biasanya yang dipilih
adalah yang bisa memisahkan paling banyak senyawa dan pemisahannya baik caranya
dengan digunakan cara KLT terlebih dahulu. Sampel disluasi dengan berbagai macam
komposisi fase gerak dan dibandingkan hasilnya. Apabila dihasilkan noda paling banyak dan
pemisahan paling baik, maka fase gerak itu yang terpilih pada praktikum kali ini eluan atau
fase gerak yang digunakan adalah kloroform : aseton : asam formiat (150:33:17).
Preparasi kolom terpaking pertama kali dilakukan adalah dibuat dahulu fase geraknya
 12

atau eluen menggunakan kloroform : aseton : asam formiat (150:33:17). Setelah eluen
dibuat disiapkan glass wool dan dicelupkan kedalam eluen, glass wool yang telah basah
dimasukkan ke dalam dasar kromatografi kolom dan dipastikan tidak terdapat udara, glass
woll ini berfungsi sebagai bagian penahan pada bagian bawah kolom supaya fase diam tidak
ikut turun kebawah bersama dengan senyawa yang akan dipisahkan. Pembuatan fase diam
dipaking bubur dari fase diam atau silika gel dengan ditimbang silica gel sebanyak 100x bobot
ekstrak adsorben/silika gel dibuat suspensi di dalam fase gerak lalu dibasahi eluen hingga
tinggi eluen 2 cm diatas permukaan silica, dikocok pelan hingga merata atau diaduk sampai
terlihat larut/homogen hingga gelempung air hilang. Kemudian bubur adsorben dituang ke
dalam kromatografi kolom. Setelah silica masuk ke dalam kolom, ditambahkan eluen dan
ditutup dengan kapas dan alumunium foil agar eluen dalam kolom tidak menguap, Kolom
didiamkan semalaman untuk mengetahui adanya keretakan kolom/tidak. Keesokan harinya
bila kolom tidak retak, dikeluarkan eluen hingga mencapai 0,5 cm diatas permukaan. Tapi jika
ada bagian kolom yang retak terlihat seperti ada lubang diantara kolom yang dibuat, akan
terlihat jelas. Solusinya membuat kolom lagi dari awal. Untuk bubur fase diam yang sudah
dimasukkan pada kolom awal bisa digunakan kembali.
Cara menambahkan sampel ke dalam kolom ada dua yaitu cara basah dan cara kering:
a. Cara basah/ wet application
Dilarutkan sampel pada fase gerak diletakkan pada bagian atas kolom dengan
menggunakan pipet. Metode ini mudah, namun pada bebererapa kasus sampel
tidak larut pada fase gerak, jadi harus digunakan cara kering.
b. Cara Kering/ dry loading
Dilakukan dengan melarutkan sampel pada pelarut yang mudah menguap
kemudian diadborbsi dengan adsorben, atau bisa juga dengan menambahkan
langsung adsorben pada sampel. Misal sampel ektrak bisa langsung di tambahkan
adsorben karena meskupun sudah diuapkan/dikeringkan di oven sering kali masih
tersisa pelarutnya (tidak benar-benar kering) supaya benar-benar kering maka
ditambahkan adsorben.
Pada praktikum kali ini dilakukan cara kering/dry loading dengan cara disiapkan
ekstrak yang sudah dipekatkan dan ditambahkan silica gel. Ekstrak yang sudah
ditambahkan silica gel dimasukkan ke dalam kolom pemenambah silica gel adsorben akan
menyerap sisa-sisa pelarut didalam sampel, sampel yang sudah bercampur dg adsorben
diletakkan dalam kolom yaitu disebarkan secara merata tidak boleh menumpuk di satu
bagian saja. Kolom dialiri eluen terus menerus dan ditampung 50 ml eluen dalam Gelas ukur
(eluen yang ditampung belum membawa zat kimia pada ekstrak. Ketika eluen dikeluarkan,
 13

terus tambahkan eluen ke dalam kolom (silica tidak boleh kering). Kran dibuka dan diatur
tetesannya (1 tetes/detik) dan ditampung dalam 10 vial yang telah dikalibrasi 25 ml
sebelumnya, Vial dimasukkan kedalam lemari asam untuk uji KLT berikutnya
Proses pengembangan kolom merupakan proses dimana komponen-komponen dalam
sampel akan berpindah sesuai dengan kemampuan afinitasnya. Analisis eluasi adalah metode
umum yang digunakan dalam kromatografi kolom. Dalam metode ini sejumlah kecil
campuran/sampel yang akan dipisahkan ditambahkan di bagian atas kolom dan fase gerak
ditambahkan terus menerus melalui bagian atas kolom dibiarkan mengalir melalui kolom.
Setelah didiamkan kolom yang diawal saat membuat kolom tidak ada retakan bisa
meletakkan sampel setelah didiamkan beberapa waktu supaya terjadi proses pengembangan
baru kemudian dilakukan eluasi dengan menambahkan fase gerak terus menerus sambil
meneteskan hasil pemisahan dari proses fraksinasi. Campuran yang dimasukkan pada kolom
dipisahkan/terpisah menjadi individu-individu (bebrapa bagian) tergantung afinitasnya
terhadap adsoeben/silica gel/fase diam yang digunakan saat komponen campuran
teradsorpsi ke bahan kolom pada tingkat yang berbeda sehingga akan terbentuk hasil gradasi
warna yang menunjukkan adanya pemisahan berdasarkan afinitasnya terhadap fase diam.
Pada fase gerak lain, setiap komponen campuran dielusi sebagai komponen terpisah (disebut
eluat). Karena dialirkan fase gerak terus menerus maka akan dilakukan pengaliran fraksi
dibagian bawah jadi di kolom pada bagian bawah ada kran jadi fraksi yang dihasilkan bisa di
alirkan atau di sebut eluate
Deteksi dan pemulihan komponen dilakukan dengan cara fraksi-fraksi dikumpulkan
dengan analisis eluasi. Kemudian fraksi-fraksi tadi di analisis dengan KLT. pada praktikum
proses awalnya sekitar 50 ml fase gerak dikeluarkan dianggap belum mengandung senyawa
yang dipisahkan setelah itu baru diteteskan 1 tetes per detik di alirkan pada erlenmeyer atau
vial untuk jumlah vial volume yang dikumpulkan tergantung pada peneliti jika di praktikum
digunakan 5/10 vial untuk proses pemisahan Kemudian lempeng KLT nya dilihat noda-
nodanya dan Rfnya jika nilai Rfnya sama untuk vial yang menghasilkan noda sama maka bisa
dianggap sebagai fraksi yang sama jadi isinya bisa disatuakan, jika noda berbeda maka
dianggap fraksi yang berbeda karena kandungan senyawa berbeda. Jika ingin menganalisis
lebih lanjut maka setelah diambil fraksinya bisa dilakukan analisis spektra misal menggunakan
NMR, MS, X-RD. dsb untuk mengidentifikasi kira2 senyawa apa yang ada di dalam fraksi
 14

DAFTAR PUSTAKA

Christian, Gary D. 1994. Analytical Chemistry. Fifth Edition. University of Washington.USA: John
Wiley & Sons.
Endarini, L. 2016. Farmakognisi dan Fitokimia. Jakarta: Kemenkes RI.
Fratiwi, Y. 2015. The Potential Of Guava Leaf (Psidium guajava L.) For Diarrhea. J MAJORIT.
Volume 4 Nomor 1.
Hawkins, D. W & D. W. Rahn. 1997. Pharmacoteraphy A Phatophysiologic Approach, 3 th Ed.
Stampfor: Appleton and Lange.
Skoog, D. A. 1998. Principles of Instrumental Analysis Fifth Edition. USA: Brookscole-Thomson
Learning.
 15

LAMPIRAN

Penimbangan Penambahan Penambahan HCl

bahan metanol 57% v/v

Penambahan batu Sampel di masukkan Proses penguapan/

didih labu alat bulat pemekatan

Pembuatan eluen Pencelupan glass wol Penempatan glass

dalam eluen wol pada kolom

Pembuatan fase Pemasukan fase diam Pengaliran kolom

diam ke dalam kolom dengan eluen

Kolom terus dialiri Penampungan zat Hasil pemisahan

eluen yang dipisahkan