PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI Kemampuan pewarna berikatan dengan komponen makromolekul sel,

PEWARNAAN BAKTERI seperti protein atau asam nukleat, tergantung dari muatan listrik dari chromogen
Tim Instruktur Praktikum
Tujuan :
Pada akhir praktikum, mahasiswa diharapkan :
1. Memahami teori dasar pewarnaan dan bahan – bahan yang digunakan.
2. Mengetahui berbagai jenis pewarnaan bakteri.
3. Mampu membuat sediaan bakteri untuk pewarnaan.
4. Mampu melakukan pewarnaan : pewarnaan Gram dan pewarnaan tahan asam.
5. Mampu menjelaskan gambaran morfologi bakteri berdasarkan pewarnaan.
PENDAHULUAN
Melihat mikroba dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena ukurannya
sangat kecil, transparan serta tidak berwarna. Untuk dapat melihatnya perlu
dilakukan pewarnaan. Secara kimiawi, bahan pewarna terdiri dari cincin benzene
ditambah chromophore dan grup auxochrome.
Benzene : suatu pelarut organik yang tidak berwarna.
Chromophore : suatu grup bahan kimiawi yang dapat memberi warna kepada
benzene, yang keduanya disebut sebagai chromogen, tetapi bukan
bahan pewarna.
Auxochrome : bahan kimiawi yang mampu melakukan ionisasi dari chromogen
(untuk membentuk garam) dan berikatan dengan serabut atau
jaringan. Bentuk baru dari ketiga bahan ini barulah merupakan
bahan pewarna.
Misalnya : benzene (tidak berwarna) + nitrit (chromophore) menjadi
trinitrobenzene (chromogen) yang berwarna kuning dan +
auxochrome maka menjadi trinitrohydroxybenzene (picric acid);
suatu bahan pewarna yang berwarna kuning.
dan bagian sel yang akan diwarnai.
Pewarna asam bersifat anion, berarti bahwa chromogennya mempunyai
muatan (-). Protein bakteri mempunyai muatan (+) akan terwarnai dengan pewarna
asam. Sedangkan permukaan bakteri biasanya bermuatan (-) sehingga tidak akan
terwarnai dan bakteri tidak berwarna dengan latar belakang yang berwarna.
Pewarna ini digunakan untuk pewarnaan negatif, misalnya eosin, nigrosin, atau
tinta cina. Dapat digunakan untuk mewarnai bakteri yang sukar diberi pewarna
seperti spirochaeta. Pewarna basa seperti kation, berarti bahwa chromogennya
bermuatan (+) sehingga akan berikatan erat dengan bagian sel yang bermuatan (-),
misalnya asam nukleat. Contoh pewarna ini adalah methylen biru.
Beberapa macam pewarnaan ialah sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana : menggunakan bahan pewarna tunggal. Pewarnaan ini
digunakan untuk menunjukkan morfologi dan susunan
bakteri.
2. Pewarnaan differensial, digunakan untuk :
a. Membedakan kelompok bakteri, misalnya pewarna Gram dan pewarna tahan
asam.
b. Memperlihatkan struktur bakteri, misalnya pewarna untuk flagella, spora,
kapsul dan inti bakteri.
Pewarnaan differensial yang sering digunakan dalam laboratorium
mikrobiologi klinik ialah pewarna Gram, yang penting dalam klasifikasi bakteri dan
merupakan tahapan awal untuk identifikasi. Pewarnaan Gram menggunakan 4
macam reagen yang digunakan secara berurutan. Bahan pertama disebut sebagai
pewarna primer (primary stain), untuk memberi warna semua bagian sel. Bahan
kedua disebut bahan penguat (mordant) untuk mengikat pewarna primer. Bahan
ketiga disebut bahan pelarut (decolorizing agent), tergantung dari susunan kimiawi
sel; akan melarutkan sebagian atau seluruh pewarna primer. Bahan keempat disebut
counterstain yang memberikan warna kontras terhadap pewarna primer. Bila
pewarna primer tidak luntur, maka bagian sel tersebut tidak akan terwarnai lagi,

2021 LABORATORIUM BIOMEDIS CASDIORESPIRATORY DISORDERS 2021

sedangkan bagian yang luntur yang akan terwarnai dengan pewarna ketiga sehingga - Inti (Feulgen)
akan didapatkan kontras dari bagian – bagian sel bakteri. - Fungi (KOH, Tinta Parker)
- Giemsa
- DNA (EtBr)

Bahan pertama

CARA PEMBUATAN SEDIAAN UNTUK PEWARNAAN

Bahan kedua 1. Gunakan gelas obyek yang kering dan bersih, minyak dapat dibersihkan dengan

Bahan ketiga
dicuci menggunakan sabun dan air kemudian dibilas dengan alkohol 95% atau
dapat dilakukan dengan diatas api lampu spirtus 2-3 kali dan dilap dengan kertas
Bahan keempat
tisu sampai lemak hilang.
‘ 2. sterilkan ose (inceneration) dengan cara memanaskan di atas nyala api sampai
Gambar 1. Pewaranaan Gram merah membara, jauhkan dari api tunggu sampai dingin, setelah dingin
KLASIFIKASI PEWARNAAN menggunakan ose tersebut.
1. Pewarnaan sederhana (simple staining) : 3. Pewarnaan
a. Pewarnaan negatif (negative staining) A. Dari biakan bakteri cair (suspensi), secara aseptis ambil satu atau dua tetes
- Burri (Tinta Cina/Tinta India) letakkan pada permukaan glas objek, ratakan 1x1 cm/ ϴ 1 cm dan letakkan
- Nigrosin diatas meja porslein hingga kering.
- Congo red B. Dari biakan koloni bakteri pada media agar, dengan cara letakkan 1 tetes
b. Pewarnaan positif (positive staining) NaCl steril ditengah glas objek, dan ambil bakteri menggunakan
- Methylen blue menggunakan ujung ose steril kemudian dilarutkan pada NaCl Fisiologi 0,9
- Air Fuchsin % pada glas objek.
- Carbol Fuchsin 4. Pewarnaan BTA
- Crystal violet Ambil Spesimen sputum bagian yang menggumpal menggunakan batang lidi
2. Pewarnaan kompleks : dan letakkan pada objek glass, kemudian diratakan dengan cara memutar
a. Pewarnaan differensial ose/batang lidi sampai 2/3 objek glass terpenuhi (untuk pewarnaan BTA)
- Gram 5. Fiksasi sediaan dengan cara melalukan sediaan (yang sudah kering di udara) 2 –
- Ziehl Nielsen 3 kali di atas nyala api. Fungsi fiksasi untuk melekatkan bakteri pada objek glass
b. Pewarnaan khusus (dengan terjadi koagulasi protein) dan mematikan bakteri.
- Spora (Klein) 6. Sediaan siap diberi warna
- Flagella (Gray)
- Granula (Neisser)
- Kapsul (Gin Burri)

2021 LABORATORIUM BIOMEDIS CASDIORESPIRATORY DISORDERS 2021

PEWARNAAN SEDERHANA 3. Dengan ujung gelas obyek yang lain letakkan di depan tetesan pewarna dengan
Bahan pewarna : sudut 30°, buatlah preparat seperti membuat preparat darah apus sampai
1. Pewarna Loffler Methylen blue yang terdiri dari : terbentuk preparat yang rata dan tipis. Biarkan di udara sampai kering. Jangan
Larutan A : methylen blue 0,3 g dan ethyl alkohol 30 ml. difiksasi.
Larutan B : KOH 0,01 g dan aquadest 100 ml. 4. Setelah kering periksa dengan mikroskop menggunakan minyak emersi
Kedua larutan di atas kemudian dicampur. Dapat juga menggunakan pewarna (pembesaran lensa obyektif 100x).
yang lain yaitu :
2. Carbol fuchsin atau PEWARNAAN GRAM
3. Crystal violet Pewarna pertama yang dipakai adalah crystal violet yang memberi warna
biru – keunguan (purple – blue). Dengan penambahan larutan iodine yang berfungsi
Cara Kerja : sebagai mordant, akan terbentuk ikatan crystal violet – iodine yang berwarna hitam
1. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan, genangi dengan pewarna selama waktu – keunguan (purple – black) yang melekat pada komponen magnesium – nucleic
tertentu. Bila menggunakan : acid dari dinding bakteri yang sulit lepas. Mordant berarti dapat membuat bentuk
- Methylen blue selama 1 – 2 menit. tak terlarut (insoluble) karena berikatan dengan pewarna pertama. Alkohol aseton
- Carbol fuchsin selama 15 – 30 detik. 5% sebagai bahan pelarut berfungsi sebagai pelarut lemak dan protein dehydrating
- Crystal violet selama 2 – 60 detik. agent. Aktifitasnya tergantung dari keberadaan lipid. Pada bakteri Gram (+)
2. Cuci dengan air sampai bersih, ditiriskan (letakkan dalam posisi miring) supaya dindingnya mengandung sedikit lipid (1-4%) sehingga terlarutkan juga sedikit dan
cepat kering atau dikeringkan menggunakan kertas saring. terbentuk lubang kecil yang dapat ditutup oleh protein yang mengalami dehidrasi,
3. Setelah kering periksa dengan mikroskop menggunakan minyak emersi sehingga warna pertama tetap. Sedangkan pada bakteri Gram (-), dindingnya
(pembesaran lensa obyektif 100x). mengandung banyak lipid (11-22%) sehingga yang dilarutkan juga banyak dan
terbentuk lubang yang besar yang tidak dapat ditutup oleh protein yang dehidrasi.
Selain lipid kebedaan peptidoglikan yang ada pada diding sel bakteri merupakan
PEWARNAAN NEGATIF penjelasan dasar yang lain pada pewarnaan Gram. Dinding sel bakteri Gram (-)
Pada pewarnaan ini tidak diperlukan pemanasan dan fiksasi pada gelas mengandung pedtidoglikan yang tipis (10-15 nm) yang mengakibatkan ikatan
obyek sehingga tidak mempengaruhi morfologi. Karenanya morfologi dan ukuran silang yang kurang ekstensif dibandingkan dengan bakteri Gram (+) yang lebih
sebenarnya dapat dilihat dengan cara ini. tebal (15-80 nm). Hal-hal tersebut mengakibatkan pelepasan warna pertama
Bahan pewarna : Tinta Cina. sehingga bakterinya menjadi tidak berwarna. Tahapan paling kritikal adalah
tahapan dekolorisasi ini karena kalau berlebihan akan menyebabkan
Cara Kerja overdecolorization. Counterstain yang digunakan dapat safranin atau air fuchsin,
1. Teteskan bahan pewarna pada salah satu ujung gelas obyek. yang akan memberikan warna merah.
2. Secara aseptis menggunakan ose steril, ambil bakteri dalam biakan suspensi atau
biakan coloni dan letakkan di tempat pewarna tersebut dan campur sampai rata.

2021 LABORATORIUM BIOMEDIS CASDIORESPIRATORY DISORDERS 2021

Bahan pewarna Gram PEWARNAAN TAHAN ASAM (ZIEHL NEELSEN)

A. Crystal violet : Crystal violet 10 ml. Mikobakterium mempunyai dinding menyerupai lilin (waxy = lipoidal) yang
B. Larutan lugol : Iodida 1 g. tebal sehingga sukar sekali ditembus oleh pewarna, kecuali cara tahan asam. Tetapi
Kalium Yodida 2 g. sekali pewarna dapat masuk akan sulit sekali dilarutkan dengan alkohol asam,
Aquadest 300 ml. disebut sebagai bakteri tahan alkohol asam (acid fast). Sedangkan bakteri lain, akan
C. Alkohol aseton 5% mudah dilarutkan dengan alkohol asam sehingga disebut sebagai tidak tahan asam
D. Larutan safranin atau air fuchsin alkohol (non acid fast).
Pewarna tahan asam terdiri dari 3 macam bahan. Carbol fuchsin adalah
Cara kerja pewarna fenol yang larut dalam bahan lipoidal yang dapat menembus dinding
1. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan/ meja porslein, Sediaan diteteskan bakteri tuberkulosis, yang lebih dipermudah lagi penetrasinya dengan pemanasan.
Crystal violet menggunakan pipet hingga menutupi sediaan/menggenang Sedangkan cara tanpa pemanasan dengan penambahan bahan pembasah (wetting
selama 1-2 menit. agent) seperti turgitol, yang berfungsi menurunkan tegangan permukaan antara
2. Sediaan dicuci dengan air mengalir. dinding bakteri dan pewarna. Asam alkohol terdiri dari HCl 3% dan ethanol 95%,
3. Sediaan diteteskan sedian dengan larutan Gram’s iodine menggunakan pipet sedangkan sebagai pewarna kedua digunakan methylen biru/malachite green
hingga menutupi sediaan/menggenang selama 30 detik.
4. Sediaan dicuci dengan air mengalir. .
5. Sediaan diteteskan alkohol aseton 5% (dekolorisasi) hingga Crystal violet tidak
terlarut lagi. Hati – hati jangan sampai overdecolorize (over dekolorisasi)
6. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
7. Sediaan diteteskan dengan larutan safranin menggunakan pipet hingga
menutupi sediaan/menggenang selama 1-2 menit. acid fast
Non acid
8. Sediaan dicuci dengan air mengalir. fast

9. Sediaan dikeringkan dengan meletakkan miring objek glass diatas kertas saring
dan setelah kering diamati dengan mikroskop pada pembesaran lensa obyektif
Gambar 2. Pewarnaan Ziehl Neelsen
100x menggunakan minyak emersi.

Bahan pewarna
Carbol fuchsin : Basic fuchsin 4 g.
Larutan fenol 5% (dalam air) 1000 ml.
Alkohol absolut 100 ml.
Larutan alkohol asam 3% (HCl dalam alkohol absolut).
Methylen Blue 1%.

2021 LABORATORIUM BIOMEDIS CASDIORESPIRATORY DISORDERS 2021

 merata, ketebalan preparat tidak selalu sama sehingga kemungkinan terdapat
Cara kerja kesalahan. Walaupun demikian, sistem ini akan dapat digunakan untuk melihat
1. Genangi sediaan dengan carbol fuchsin, panaskan di atas nyala api sampai kecenderungan bakteri yang dikeluarkan oleh setiap pasien.
beruap (tidak mendidih) selama 5 menit. Usahakan jangan sampai pewarna 4. Skala WHO
kering, kalau perlu pewarna ditambah serta jangan sampai mendidih. Pemeriksaan dilakukan dengan memeriksa pada 4 garis menurut bagan di bawah
2. Tunggu sampai sediaan dingin, kemudian dicuci dengan air. ini, yang diperkirakan sudah mewakili seluruh slide.
3. Sediaan diteteskan alkohol asam 3% (dekolorisasi) hingga tidak terlarut lagi.
4. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
5. Sediaan diteteskan dengan larutan methylen blue menggunakan pipet hingga DAFTAR PUSTAKA
menutupi sediaan/menggenang selama 2 menit.
6. Sediaan dicuci dengan air mengalir. Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-dasar mikrobiologi. Penerbit Djembatan. Jakarta
7. Keringkan dengan kertas saring dan setelah kering diperiksa dengan Jawetz, Melnick, Adelbergs. 2007. Medical microbiology:
mycobacteria. 24th ed. The McGraw-Hill companies.
mikroskop menggunakan minyak imersi (pembesaran lensa obyektif 100x).
Pelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
World Health Organization. 1998. Laboratory Services in Tuberculosis Control:
Hasil pengamatan mikroskopis diwarnai dan dihitung berapa bakteri tiap Microscopy Part II. WHO
Willey, J. M, L. M. Sherwood, C. J. Woolverton. 2008. Microbiology. 7th ed.
lapangan pandang, misalnya terdapat 10 basil dalam 100 lapangan pandang maka
McGraw Hill Companies Inc., New York
ditulis 10/100. Ada beberapa cara pencatatan/pengkodean pemeriksaan basil tahan
asam atas dasar skala tertentu.
1. Skala IUAT (International Union Against Tuberculosis).
Pemeriksaan ini dilakukan sepanjang satu garis pada slide yang diperkirakan
meliputi 100 lapangan pandang. Bila hasilnya negatif maka dikategorikan
sebagai negatif. Hasil berikutnya lihat pada skala di bawah ini:
1. 1-9 BTA dalam 100 lapang pandang, ditulis jumlah kuman yang ditemukan.
2. 10-99 BTA dalam 100 lapang pandang disebut + atau (1+).
3. 1-10 BTA dalam 1 lapang pandang, disebut ++ atau (2+).
4. > 10 BTA dalam 1 lapang pandang, disebut +++ atau (3+).
2. Skala NTA (National Tuberculosis Association of USA).
Merupakan koding untuk pembacaan slide b.t.a.
3. Skala Gaffky
Di sini lebih bersifat kuantitatif dari pada dua skala di atas, sering digunakan di
Jepang. Banyak kritik tentang skala ini, diantaranya bahwa yang diperiksa
hanyalah sebagian kecil dari sputum, distribusi bakteri di dalam sputum tidak

2021 LABORATORIUM BIOMEDIS CASDIORESPIRATORY DISORDERS 2021