Sifat katalitik dari enzim tirosinase jamur yang terimobilisasi: Sebuah

studi kinetik untuk pengembangan masa depan biosensor amperometri

biomimetikbiomimetik

Abstrak

Tirosinase jamur diimobilisasi dengan penyematan langsung ke bahan elektroda

(elektroda pasta karbon termodifikasi), penggabungan agregat enzim ikatan silang ke dalam
membran polimer (elektroda karbon kaca yang dilapisi lapisan tipis Nafion), dan penempelan
kovalen menggunakan lapisan tunggal yang dirakit sendiri (emas elektroda dengan enzim
yang terikat secara kimiawi). Spektrofotometri UV-Vis standar dan amperometri dengan
konfigurasi batch disajikan sebagai metode pelengkap untuk mempelajari kinetika enzim
tirosinase, yang aktivitas katekolase menghasilkan produk elektroaktif (orto-kuinon). Karena
sensitivitas deteksi amperometrik yang lebih tinggi, keuntungan nyata dalam konsumsi enzim
diperoleh. Biosensor tirosinase amperometri yang telah disiapkan dikarakterisasi
menggunakan voltametri siklik dan mikroskop gaya atom. Nilai konstanta Michaelis dari
tirosinase terimobilisasi dan tak terikat (larutan enzim bebas) terhadap dopamin dan katekol
dibandingkan. Nilai konstanta Michaelis yang tampak untuk tirosinase amobil secara
signifikan lebih rendah daripada nilai yang dinyatakan 0,840 mmol L -1 dopamin untuk enzim
tidak terikat. Enzim tirosinase yang tersusun dalam monolayer yang dirakit sendiri berfungsi
sebagai sensor yang efisien karena konstanta Michaelis semu rendah dopamin 0,061 mmol L-1
dan kecepatan reaksi maksimum tinggi 0,458 μA s-1. Fakta ini mencerminkan pengaturan
ideal molekul enzim yang menyebabkan ketersediaan tinggi situs pengikatan. Elektroforesis
gel poliakrilamida natrium dodesil sulfat tris-glisin dan mikroskop gaya atom menjelaskan
bahwa protein dengan berat molekul 25 kDa lebih disukai terikat pada elektroda emas yang
dimodifikasi secara kimia. Sensor yang dibuat dengan imobilisasi tirosinase pada elektroda
emas menghasilkan aktivitas katekolase yang lebih tinggi terhadap dopamin dibandingkan
dengan elektroda CPE dan GC, di mana enzim diimobilisasi secara fisik.

Kata Kunci: amperometri; neurotransmiter; imobilisasi enzim; kinetika enzim; tirosinase

jamur; Spektrofotometri UV-vis

1. PENDAHULUAN
Secara umum, masa pakai biosensor enzimatik elektrokimia dipengaruhi oleh metode
imobilisasi enzim yang digunakan ke permukaan transduser biosensor dan kondisi
penyimpanan. Imobilisasi biasanya menyebabkan peningkatan yang signifikan pada stabilitas
dan efektivitas enzim karena pengikatan enzim ke matriks membuatnya lebih tahan terhadap
agen denaturasi dan panas. Ini berlaku dalam kasus biosensor enzimatik, terutama yang
mengandung tirosinase (TYR). Aktivitas katalitik dari enzim tirosinase amobil berkurang
kurang dari tirosinase bebas di bawah kondisi penyimpanan yang sama. Sampai saat ini,
banyak biosensor amperometrik tirosinase telah dikembangkan untuk memantau
katekolamin, terutama dopamin (DA). Namun, aplikasi praktis rutin mereka dalam analisis
klinis cukup bermasalah karena masa pakai yang singkat yang mencapai beberapa minggu
meskipun upaya untuk menekan penurunan aktivitas enzim dengan mengembangkan metode
imobilisasi yang lebih canggih. Metode ini melibatkan penanaman langsung ke bahan
elektroda, penggabungan ke dalam struktur polimer dan pemasangan kovalen menggunakan
lapisan tunggal 2-aminoethanethiol (AET, juga dikenal sebagai sistein) dan penaut silang.
Masalah masa pakai yang singkat mungkin dapat diselesaikan dengan mengganti enzim
dengan kompleks biomimetik. Perkembangan mereka termasuk dalam topik terbaru.
Pengetahuan tentang metode imobilisasi yang digunakan diasumsikan dapat mempengaruhi
kinetika tirosinase yang dapat digunakan dalam karakterisasi kompleks tembaga berbasis
binuklir yang menunjukkan aktivitas katekolase. Parameter seperti kecepatan reaksi
maksimum (𝑉max), konstanta Michaelis (aplikasi 𝐾m) dan rasio di antaranya, relatif terhadap
efisiensi katalitik enzim. Konstanta Michaelis sesuai dengan konsentrasi substrat pada
setengah saturasi dan merupakan ukuran afinitas pengikatan substrat ke enzim. Nilai rendah
(𝐾m) yang diinginkan sesuai dengan ikatan erat antara substrat dan enzim, dan nilai tinggi
berarti ikatan longgar. Semua parameter biasanya ditentukan dengan spektrofotometri UV-
Vis standar. Hasil dari beberapa penelitian menunjukkan bahwa amperometri juga dapat
digunakan, asalkan produk reaksi enzimatik adalah elektroaktif. Kecuali metode imobilisasi
yang digunakan, parameter dipengaruhi oleh beberapa faktor lain, seperti yang disebutkan di
bawah ini.

2. Metodologi Penelitian
2.1 Material dan Reagen
Tirosinase (EC 1.14.18.1) bubuk padat terliofilisasi dari jamur (Agaricus bisporus)
aktivitas enzim ≥1000 U mg-1 (TYR), 98% dopamin (3,4-dihydroxyphenethylamine; DA),
≥99% catechol (benzene-1 , 2-diol), 2-aminoethanethiol hydrochloride (AET), 50% aqueous
glutaraldehyde (GTA), 99,8% anhydrous acetonitrile, 99% disodium hydrogen phosphate
dodecahydrate dan 99% sodium dihydrogen phosphate dibeli dari Sigma-Aldrich. Bahan
kimia lain seperti etanol 96,5%, metanol 99,5%, 99% N, N-dimetilformamida, ≥99%
stabilisasi 1 4-dioksan, dan asam fosfat 85% diperoleh dari Lach-Ner (Neratovice, Republik
Ceko). Semua bahan kimia yang digunakan memiliki kemurnian tingkat analitik. Larutan
berair yang diinginkan dibuat menggunakan air deionisasi (resistivitas listrik minimum 18,2
MΩ cm, maksimum 3 μg L-1 dari total karbon organik) yang dihasilkan oleh sistem air ultra
murni Milli-Q dari Merck Millipore (Burlington, USA).

2.2 Immobilisasi Enzim

Sebanyak 0,4 g serbuk grafit (ukuran partikel> 2 μm) dari Graphite Týn (Týn nad
Vltavou, Republik Ceko), 0,1 g minyak parafin dari Merck dan 25 mg enzim tirosinase
dicampur selama 20 menit. Pasta karbon homogen yang dihasilkan dikemas ke dalam
dudukan yang digerakkan piston Teflon dengan diameter dalam 3,0 mm (i). Volume larutan
enzim 5 μL (2.0 mg mL-1) dalam buffer fosfat (PB) diaplikasikan ke permukaan GCE.
Enzim dihubungkan silang dengan penambahan 5 μL dari 1% glutaraldehyde (GTA).

2.3 Evaluasi parameter kinetik

Kinetika Michaelis-Menten merupakan salah satu model kinetika enzim yang paling
umum diterapkan dalam biokimia. Model yang diusulkan biasanya disajikan sebagai
persamaan (1) yang menggambarkan laju reaksi enzimatik, dengan menghubungkan
kecepatan reaksi (V) pembentukan produk [P] dengan konsentrasi substrat [S].
 Plot Lineweaver-Burk tradisional (lihat persamaan 2) [41] termasuk salah satu
kemungkinan untuk penentuan istilah penting dalam kinetika enzim, seperti konstanta
Michaelis semu (aplikasi 𝐾m) dan kecepatan reaksi maksimum semu (aplikasi 𝑉maks) dalam
kondisi ditentukan pada konsentrasi substrat jenuh ketika semua molekul enzim terlibat
dalam reaksi katalitik. Aplikasi 𝐾m yang disebutkan mewakili konsentrasi media yang
dibutuhkan untuk mencapai setengah dari 𝑉maks.

3. Hasil dan Pembahasan

Konstanta yang diperoleh (𝐾m) dan 𝑉maks dari enzim amobil dihitung untuk dopamin
sebagai substrat (Tabel 1). Untuk demonstrasi, amperogram khas yang diukur pada biosensor
tirosinase yang diselidiki dengan grafik kinetika yang sesuai dan plot Lineweaver-Burk yang
disisipkan ditunjukkan pada Gambar 4-6.
 HASIL PERHITUNGAN ULANG

a. Kurva Lineweaver-Burk
Berikut diperoleh data 1/[S] dan 1/V yang diperoleh dari grafik pada jurnal (Fig 4).
1/[S] 1/Vs
0,11 250,00
0,10 166,67
0,05 8,33
0,02 5,26
0,01 2,78
0,00 2,44
0,11 250,00
300.00

250.00

200.00 f(x) = 2176.76 x − 34.39

R² = 0.87
150.00

100.00

50.00

0.00
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12

Gambar 1. Plot Lineweaver-Burk untuk Enzim tyrosinase pada substrat CPE

Persamaan Lineweaver-Burk adalah:

Dari grafik Lineweaver-Burk diperoleh persamaan: y = 2176,8 x – 34,386

 1 1
= -34,386 maka Vmax = = -0,029081603
Vmax −34,386
Km
= 2176,8 maka Km = Vmax × 2176,8
Vmax
= -0,029081603 x 2176,8
= -63,30483336 µmol /L
= -0,063304833 mmol/L
b. Kurva Eadie-Hofstee
Berikut diperoleh data V/[S] dan V yang diperoleh dari grafik pada jurnal (Fig 4).
V/[S] V
0,00044444 0,004
4
0,0006 0,006
0,006 0,12
0,00365384 0,19
6
0,00342857 0,36
1
0,00203980 0,41
1
0,00044444 0,004
4
0.45

0.4

0.35

0.3

0.25 f(x) = 24.85 x + 0.11

R² = 0.09
0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 0 0 0 0 0.01 0.01 0.01

Gambar 3. Plot Eadie-Hofstee untuk Enzim tyrosinase pada substrat CPE

Persamaan Eadie-Hofstee adalah:

Dari grafik Eadie-Hofstee diperoleh persamaan: y = 24,851x + 0,1147

Maka diperoleh nilai Km = 24,851 µmol/L dan Vmax = 0,1147

c. Kurva Hanes-Wolff
Berikut diperoleh data [S] dan V yang diperoleh dari grafik pada jurnal (Fig 4).
[S] V [S]/V
0 0
9 0,004 2250
10 0,006 1666,666667
20 0,12 166,6666667
52 0,19 273,6842105
105 0,36 291,6666667
201 0,41 490,2439024
2500

2000

1500

1000 f(x) = − 5.5 x + 1220.28

R² = 0.22

500

0
0 50 100 150 200 250
Gambar 4. Plot Hanes-Wolff untuk Enzim tyrosinase pada substrat CPE.

Persamaan Hanes-Wolff adalah:

Dari grafik di atas diperoleh persamaan: y = -5,4981 x + 1220,3

1 1
= -5,4981 maka Vmax = = -0,181881013
Vmax −5,4981
Km
= 1220,3 maka Km = Vmax × 1220,3
Vmax
= -0,181881013 x 1220,3
= -221,9494007µmol /L
= -0,221949401 mmol/L