TEKNIK-TEKNIK STERILISASI DALAM KULTUR JARINGAN

(Makalah Ini Disusun Untuk Memenuhi Tugas Kelompok Mata Kuliah Kultur Jaringan)

Dosen Pengampu :
Rizki Amelia Nasution, M.Si

Disusun oleh:
Kel.3 /BIOLOGI-1

Cyndy Tri Agatha 0704181045

Devi Siruwahni 0704183102
Nur Khadijah 0704182088

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUMATERA UTARA MEDAN
2021

1
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kami kelompok 3 ucapkan kehadirat Allah Yang Maha Esa yang telah
menganugerahi kami dengan nikmat kesehatan dan kesempatan, sehingga mendukung
terselesainya makalah ini sesuai dengan waktu yang telah direncanakan.
Makalah yang berjudul “Teknik-Teknik Sterilisasi Dalam Kultur Jaringan” ini
disusun dalam rangka memenuhi tugas mata kuliah Kultur Jaringan. Adapun dalam penyusunan
makalah ini, kami mendapat bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, melalui makalah ini kami
hendak menyampaikan terimakasih yang tulus kepada IbuRizki Amelia Nasution, M.Si.selaku
pendidik mata kuliah Kultur Jaringan yang telah membimbing kami dalam penyusunan makalah
ini. Kami juga berterimakasih kepada rekan-rekan yang berpartisipasi dalam pembuatan makalah
ini.
Kami menyadari sebagai manusia dengan pengetahuan yang terbatas dan tidak lepas dari
kesalahan, maka makalah ini mungkin masih memiliki kekurangan. Oleh karena itu, kami
mengharapkan kritik dan saran yang instruktif agar makalah ini dapat menjadi lebih baik dan
bermanfaat ke depannya.

Medan, 02 Oktober 2021

Tim Penulis

2
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR....................................................................................................... 2

DAFTAR ISI...................................................................................................................... 3

BABI: PENDAHULUAN

I. 1. Latar Belakang ...................................................................................................... 4

I. 2. Rumusan Masalah................................................................................................. 4

I. 3. Tujuan ................................................................................................................... 4

BAB II:PEMBAHASAN

II. 1 Pengertian Sterilisasi ............................................................................................. 5

II. 2Sterilisasi Eksplan .................................................................................................. 6

II. 3Sterilisasi Alat Tanam Dan Ruangan ..................................................................... 9

II. 4 Sterilisasi Medium ……………………………………...….……………....…..11

BAB III:PENUTUP

III.1 Kesimpulan………………………………………………………………….…15

DAFTAR PUSTAKA…………….……………………………………………………..16

3
 BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Kegagalan pada teknik kultur jaringan sering disebabkan oleh adanya kontaminan pada
eksplan dan media kultur. Sterilisasi merupakan salah satu upaya untuk menghilangkan
mikoorganisme penyebab kontaminan pada eksplan. Kontaminasi merupakan faktor dominan
yang mempengaruhi keberhasilan dalam teknik kultur jaringan terutama pada eksplan. Beberapa
bahan kimia yang dapat digunakan untuk mensterilkan permukaan eksplan adalah sunligth cair,
clorox (NaOCl), HgCl2, AgNo3 dan alkohol.

Teknik sterilisasi merupakan salah satu proses yang menentukan keberhasilan dalam
kultur jaringan. Sterilisasi bertujuan untuk menciptakan kondisi (baik bahan, media, alat dan
ruangan) yang steril dari mikroorganisme. Berbagai teknik sterilisasi telah dikembangkan
berdasarkan kelompok tertentu. Teknik sterilisasi dapat berupa metode panas basah, panas
kering, kimiawi, filtrasi, dan penyinaran cahaya menggunakan sinar ultraviolet . Ada tiga
kategori sterilisasi, yaitu sterilisasi ringan, sedang dan berat.

I.2Rumusan Masalah
1. Apakah pengertian sterilisasi?
2. Apakah sterilisasi eksplan?
3. Bagaimana sterilisasi alat tanam dan ruangan?
4. Bagaimana sterilisasi medium?

I.3Tujuan
1. Untuk mengetahui pengertian sterilisasi
2. Untuk mengetahui sterilisasi eksplan
3. Untuk mengetahui sterilisasi alat tanam dan ruangan
4. Untuk mengetahui sterilisasi medium

4
 BAB II
PEMBAHASAN

II. 1 Pengertian Sterilisasi

Sterilisasi merupakan usaha membersihkan dan membebaskan suatu benda dari

mikroorganisme seperti protozoa, fungi, bakteri, dan virus. Perbanyakan tanaman secara in vitro
bertujuan untuk memperoleh bahan tanaman steril yang akan digunakan untuk perbanyakan
bibit. Oleh karena itu, diperlukan proses sterilisasi yang tepat untuk mematikan mikroorganisme
yang terdapat pada eksplan sehingga tidak mengganggu pertumbuhan tanaman. Sterilisasi
memiliki peranan penting dalam teknik kultur jaringan. Sterilisasi dapat mencegah kontaminasi
pada saat perlakuan kultur.

Pada banyak literatur tahap sterilisasi ini disebut juga tahap inisiasi. Tahap inisiasi pada
dasarnya yaitu inokulasi eksplan pada media steril untuk memulai kultur secara aseptik. Inisiasi
eksplan adalah langkah pertama dalam kultur jaringan secara in vitro. Eksplan yang baik adalah
eksplan yang bersih dan sehat yang terbentuk dalam kondisi aseptik sehingga bias diperbanyak
secara massal. Oleh karena itu, inisiasi eksplan dalam kondisi aseptik harus dianggap sebagai
langkah penting dalam kultur jaringan. Banyak kasus eksplan gagal terbentuk dan tidak
berkembang bukan karena kurangnya media yang sesuai tetapi karena kontaminasi. Eksplan
yang dipindahkan ke lingkungan divitro harus bebas dari kontaminan mikroba. Untuk
mendapatkan kultur yang bersih dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi.

Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang

menempel di permukaan eksplan. Sterilisasi yang dimaksud dalam kegiatan ini adalah bahwa
semua alat, bahan, kondisi laboratorium, eksplan, tempat inisiasi dan pekerja harus dalam
kondisi aseptis.

Sterilisasi alat dan media kultur jaringan dilakukan sebelum perlakuan kultur dimulai.
Kegiatan meliputi sterilisasi ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media tanam, dan sterilisasi
eksplan (Anitasari, 2018).

5
II. 2 Sterilisasi Eksplan

Bahan tanaman dari lapangan mengandung kotoran dan berbagai kontaminan, seperti
cendawan, bakteri, dan spora. Jika tidak dihilangkan, kontaminan akan tumbuh dengan cepat
memenuhi seluruh botol kultur. Oleh karena itu, bahan perlu disterilisasi. Bahan yang biasa
digunakan antara lain alkohol, antibiotik, fungisida, betadin, dan natrium hipoklorit. Bahan-
bahan sterilisasi ini umumnya bersifat racun terhadap jaringan tanaman. Pembilasan berkali-kali
setelah perendaman sangat diperlukan. Sterilisasi bahan tanaman dimulai dengan pencucian
danpembuangan bagian-bagian yang kotor di bawah air mengalir. Pencucian dapat dilakukan
dengan menggunakan detergen. Setelah dibersihkan, bahan diredam dalam larutan fungisida
atau antibiotik (Harjanto, 2007).

Sterilisasi eksplan atau disinfestasi adalah proses penghilangan kontaminan dari

permukaan eksplan. Tahapan sterilisasi eksplan biasanya dimulai dengan membersihkan
permukaan eksplan dengan cara mengupas dan/atau mencucinya dengan sabun. Pada eksplan
yang banyak membawa mikroorganisme kontaminan seperti umbi pisang atau talas yang berasal
dari media tanah, sebaiknya dicuci dengan air mengalir yang cukup lama. Tahap selanjutnya
adalah mematikan mikroorganisme yang menempel pada eksplan menggunakan desinfektan,
yaitu bahan kimia yang bersifat toksik bagi mikroorganisme tetapi bersifat nontoksik bagi
tanaman. Desinfektan yang banyak dipakai adalah calcium hypochlorite (kaporit) atau sodium
hypochlorite (yang biasa dijual secara komersial sebagai bahan pemutih, misalnya merk Bayclin
atau Sunclin yang mengandung sodium hypochlorite 5,25%.

Larutan pemutih (bleach) ini biasanya diencerkan menjadi 10-50 % sebelum digunakan.
Beberapa tetes surfaktan (tween) atau deterjen sering kali ditambah pada larutan pemutih untuk
meningkatkan peresapan desinfektan pada seluruh permukaan eksplan. Efektivitas desinfektan
dipengaruhi oleh lama perendaman dan konsentrasi desinfektan. Semakin tinggi konsentrasi
desinfektan dan lamanya perendaman, semakin tinggi efektivitas penghilangan mikroorganisme
pada eksplan, tetapi kerusakan jaringan eksplan juga semakin tinggi. Oleh karena itu perlu
dilakukan percobaan untuk mengetahui konsentrasi dan menentukan perendaman desinfektan
yang optimal sehingga didapatkan eksplan yang steril tetapi dapat tumbuh stabil di media kultur.

6
 Fungisida dan bakterisida sering digunakan untuk meningkatkan keberhasilan proses
sterilisasi eksplan. Sebelum dilakukan perendaman dengan pemutih, eksplan terlebih dahulu
direndam berturut-turut dalam larutan fungisida dan bakterisida. Hal ini cukup efektif untuk
mengurangi mikroorganisme yang ada di permukaan eksplan. Jika dilakukan perendaman
dengan fungisida dan bakterisida, penggunaan produk pemutih dapat dilakukan dalam
konsentrasi yang lebih rendah sehingga mengurangi kerusakan jaringan eksplan.

Prosedur sterilisasi eksplan biasanya sangat dipengaruhi oleh tipe eksplan, ukuran
eksplan, kondisi eksplan, dan kualitas desinfektan. Tidak ada prosedur sterilisasi eksplan yang
baku yang dapat diterapkan pada semua jenis tanaman. Prosedur sterilisasi eksplan tunas berbeda
dengan prosedur sterilisasi eksplan biji atau umbi. Prosedur sterilisasi tunas yang kecil dan sehat
akan berbeda dengan sterilisasi tunas yang berukuran besar, walaupun pada jenis tanaman yang
sama. Bahkan waktu dan tempat pengambilan eksplan juga dapat berpengaruh pada hasil
sterilisasi eksplan. Yang jelas, banyaknya mikroorganisme pada eksplan yang paling menentukan
keberhasilan prosedur sterilisasi eksplan. Untuk itu, usahakan dan pilihlah eksplan yang kira-kira
mengandung mikroorganisme paling sedikit untuk dijadikan eksplan pada kultur jaringan.

Jika hasil sterilisasi masih terdapat banyak kontaminasi jamur, kondisi eksplan harus
diperbaiki. Sebaiknya eksplan yang disterilisasi adalah eksplan yang muda, bebas kotoran, dan
penyakit. Hal ini dapat dilakukan dengan cara meningkatkan kebersihan sumber eksplan dan
lingkungan tempat pemeliharaannya, serta menghindari eksplandari serangga hama pengganggu,
seperti semut atau kutu putih. Mengurangi kontaminasi jamur juga dapat dilakukan dengan cara
meningkatkan konsentrasi disinfektan pemutih pada metode sterilisasi eksplannya agar lebih
efektif dalam mematikan jamur yang terdapat pada permukaan eksplan.

Apabila hasil sterilisasi tidak terjadi kontaminasi jamur, tetapi kontaminasi bakteri, yang
harus dilakukan adalah meningkatkan lamanya perendaman disinfektan. Untuk menghilangkan
kontaminasi bakteri, dapat juga dilakukan perendaman dengan Bethadine setelah perendaman
dengan larutan pemutih. Bethadine adalah larutan antiseptik yang mengandung povidone iodine
10%. Lamanya perendaman antara 15-30 menit.

Disinfektan lain yang dapat digunakan untuk sterilisasi eksplan adalah hydrogen
peroxidase, silver nitrate, benzalkonium chloride, dan mercuric chloride. Penggunaan bahan

7
disinfektan ini harus sangat hati-hati, terutama merkuri klorida, baik saat sterilisasi maupun saat
membuang bahan tersebut setelah digunakan. Merkuri chloride bersifat sangat, korosif, dan
toksik pada alat reproduksi, mutagen, dan berbahaya bagi lingkungan. Oleh karena itu, sebaiknya
gunakan bahan-bahan tersebut harus dihindari.

Contoh prosedur sterilisasi pada eksplan tunas pada tanaman gaharu (Aquilaria
malaccensis) adalah sebagai berikut:

a. Bagian tunas yang akan disterilisasi meliputi tunas apek, tunas lateral pertama, dan
tunas lateral kedua. Tunas-tunas tersebut dimasukkan ke dalam botol steril. Tunas
apek disterilisasi dalam botol yang terpisah dari tunas lateral.
b. Tunas-tunas dalam botol dicuci dengan akuades steril ditambah tween 2-4 tetes
dengan cara dikocok secara perlahan-lahan selama 5 menit. Kemudian, tunas dibilas
dengan akuades steril hingga busa tween habis.
c. Eksplan tunas direndam dalam larutan fungisida Benlate pada konsentrasi 2 g/liter
selama 60 menit. Kemudian, eksplan dibilas dengan akuades steril 3-4 kali hingga
bersih.
d. Eksplan tunas direndam dalam larutan bakterisida Agrept pada konsentrasi 2 g/liter
selama 60 menit. Kemudian eksplan dibilas dengan akuades steril 3-4 kali hingga
bersih.
e. Tahapan berikutnya dilakukan di dalam laminar air flow. Eksplan tunas apek
direndam dalam larutan NaOCI2 (Bayclin) 10% selama 10 menit. Sementara eksplan
tunas lateral direndam dalam larutan NaOCI2 (Bayclin) 15% selama 15 menit.
Kemudian, eksplan dibilas dengan akuades steril 3-4 kali hingga bersih.
f. Dengan menggunakan scalpel dan pisau steril, ujung-ujung potongan tunas dipotong
untuk membuang bagian tunas yang putih terkena NaOCI2. Setelah itu, eksplan
direndam dalam Betadine (larutan antiseptik mengandung povidone iodine 10%)
selama 30 menit. Kemudian, eksplan dibilas dengan akuades steril 3-4 kali hingga
bersih.

8
 g. Eksplan yang sudah bersih kemudian ditanam di media inisiasi tunas.

Gambar: Tahapan sterilisasi eksplan tunas tanaman gaharu (Aquilaria malaccensis)

(Sulistiani, 2019)

II. 3 Sterilisasi Alat Tanam Dan Ruangan

• Sterilisasi Ruangan

Ruangan penanaman kultur (transfer area) harus pada kondisi steril. Semua alat dan bahan
yang digunakan dalam perlakuan kultur harus disterilkan sebelum memasuki ruang penanaman.
Ruang pembuatan media terpisah dengan ruang penimbangan dan penyimpanan bahan kimia.
Ruangan penanaman kultur biasanya tidak begitu besar bertujuan agar proses sterilisasinya tidak
lama dan mudah dilakukan (Anitasari, 2018)

Ruangan penanaman kultur diusahakan tidak lembab dan menggunakan AC serta lampu
UltraViolet (UV). Bahan-bahan yang digunakan dalam sterilisasi rungan penanaman adalah
alkohol 70-96 %, formalin, dan larutan kaporit (Habibah, 2021)

Sterilisasi tuangan dilakukan dengan penyemprotan formalin pada tembok ruangan

dilanjurkan dengan menyemprotkan alkohol 96 %. Lantai ruangan juga dipel menggunakan kain
yang dibasahi dengan alcohol 96%. Lampu UV dinyalakan sebelum perlakuan kultur dan
dimatikan saat masuk dalam ruangan ini. Lampu UV harus diwaspadai karena dapat berdampak

9
bahaya jika salah penggunakan dan membahayakan orang dalam ruangan kultur, dapat melukai
kulit dan retina mata.

• Sterilisasi Alat Tanam

Alat-alat yang digunakan pada perlakuan kultur jaringan harus disterilisasikan di luar
ruangan kultur, dalam arti tidak boleh mensterilkan benda asing di dalam ruangan kultur. Semua
alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoclave pada temperature 121 derajat celcius dan
tekanan 1 atm, dalam waktu 30 menit, sedangkan sterilisasi bahan atau media kultur
membutuhkan waktu hanya 15 menit. Alat-alat seperti pinset dan scalpel selain disterilkan
dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran diatas api Bunsen salam Laminar air
flow. Botol-botol yang akan disterilkan sebelumnya ditutupi dengan kertas, aluminium foil atau
plastic dan kemudian diikat dengan karet. Alat disemprot terlebih dahulu menggunakan alcohol
70% sebelum dimasukkan ke Laminar air flow (LAF) (Anitasari, 2018).
Alat-alat seperti botol kultur juga dapat disterilkan dengan oven. Bahan-bahan sterilisasi
selama penanaman diantaranya alcohol atau larutan kaporit. Umumnya setelah pencelupan pada
alcohol, alat-alat logas disterilkan lagi dengan pembakaran.

Autoclave

10
 Laminar air flow(Habibah, 2021).

II.4 Sterilisasi Medium

Media atau medium merupakan tempat jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi
yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang
diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media
tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti
agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air (Mahmoud, 2013).

Media tanam kultur jaringan terdiri dari dua jenis yaitu, media cair dan media padat.
Media cair digunakan untuk menumbuhkan eksplan sampai terbentuk PLB (protocormlikebody)
yaitu eksplan yang akan tumbuh jaringan seperti kalus berwarna putih. Media padat digunakan
untuk menumbuhkan PLB sampai terbentuk planlet (Rahardja dan Wahyu, 2003).

Macam-macam media menurut Rahardja (2003), yaitu :

- Heller

- White

- Nitsch & Nitsch

- Hilderbrandt, Riker dan Duggar

11
- Gantheret

- Knudson

- Vacin & Went

- Miller

- Linsmaier dan Skoog

- Gamborg

- Murashige & Skoog

Media gamborg (B5) terdiri dari :

1. Micronutrients (mg/100 ml)

- MnSO4.H2O

- H3BO3

- ZnSO4.7H2O

- Na2MO4.2H2O

- CuSO4.5H2O

2. Vitamin (mg/100 ml)

- Nicotine acid

- Thiamin HCl

- Prridoxine HCl

- Myo-inositol

3. Calcium chloride (g/100 ml)

4. Potassium Iodide (mg/100 ml)

12
 Sterilisasi merupakan upaya yang dilakukan untuk menghilangkan semua
mikroorganisme (bakteri, jamur, parasit, dan virus) termasuk endospora bakteri dari benda-benda
mati atau instrument yang menempel (Rahayu, 2016)

Sterilisasi media diantaranya :

✓ Sterilisasi uap

Merupakan proses sterilisasi thermal yang menggunakan uap jenuh dibawah tekanan selama
15 menit pada suhu 121°C, berlangsung di suatu bejana yang disebut autoklaf, dan merupakan
proses sterilisasi paling banyak dilakukan. Dalam sterilisasi media di autoklaf pastikan bahwa
pengaturan suhu tetap terjaga yaitu 121°C dengan waktu 30 menit. Apabila waktu sterilisasi
bahan terlalu lama maka akan menyebabkan media rusak dan kandungan hara didalam media
hilang sehingga saat ditumbuhi tanaman tidak akan berkembang.

Betrikut merupakan tabel minimal waktu sterilisasi dengan autoklaf yang dibutuhkan media
kultur :

Volume Media Lama Sterilisasi (Menit)

(ml)

25 20

50 25

100 28

250 31

500 35

1000 40

2000 48

4000 63

13
 ✓ Sterilisasi dengan penyaringan

Sterilisasi larutan atau media yang labil terhadap panas sering dilakukan dengan penyaringan

menggunakan bahan yang dapat menahan mikroba, hingga mikroba yang dikandungnya dapat

dipisahkan secara fisika. Efektivitas penyaring media atau penyaring subtrat tergantung pada

ukuran pori matriks, daya adsorpsi bakteri dari matriks dan mekanisme pengayakan.Penyaringan

berupa cairan dengan menggunakan prinsip melewatkan larutan pada membran selulosa asetat

atau selulosa nitrat. Sterilisasi dengan penyaringan (dengan menggunakan membrane filter yang

terbuat dari nitrat sellulosa atau asetat sellulosa dengan diameter pori 0.45-0.22μm) yang

diperuntukan untuk Bahan-bahan yang tidak tahan terhadap pemanasan (thermolabile) seperti zat

pengatur tumbuh asam amino, vitamin dan enzim.

14
 BAB III
PENUTUP

III. 1 Kesimpulan
Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang
menempel di permukaan eksplan. Sterilisasi eksplan atau disinfestasi adalah proses penghilangan
kontaminan dari permukaan eksplan. Desinfektan yang banyak dipakai adalah calcium
hypochlorite (kaporit) atau sodium hypochlorite (yang biasa dijual secara komersial sebagai
bahan pemutih, misalnya merk Bayclin atau Sunclin yang mengandung sodium hypochlorite
5,25%.

Ruangan penanaman kultur (transfer area) harus pada kondisi steril. Semua alat dan bahan
yang digunakan dalam perlakuan kultur harus disterilkan sebelum memasuki ruang penanaman.
Alat-alat yang digunakan pada perlakuan kultur jaringan harus disterilisasikan di luar ruangan
kultur, dalam arti tidak boleh mensterilkan benda asing di dalam ruangan kultur. Sterilisasi
media diantaranya : sterilisasi uap, sterilisasi gassterilisasi dengan penyaringan.

15
 DAFTAR PUSTAKA

Anitasari, dkk. 2018. Dasar Teknik Kultur Jaringan Tanaman. Yogyakarta: CV Budi Utama.
Habibah, dkk. 2021. Buku Ajar Kultur Jaringan Tumbuhan. Yogyakarta: CV Budi Utama.
Harjanto, Hari. 2007. Memperbanyak Tanaman Hias Favorit. Jakarta: Penebar Swadaya
Mahmound, O., & Kosar, M. (2013). RegenerationandHistologicalofplants
DerivedFromLeafExplants In VitroCultureofStrawberry. Agricultural
BiotechnologyResearchInstituteof Iran.
Rahardja, P. C., & Wahyu, W. (2003). Aneka Cara Memperbanyak Tanaman. Jakarta:
Agromedia Pustaka.
Rahayu, T. (2016). Modul Praktek Kultur Jaringan Tanaman. Surakarta: Universitas
Muhammadiyah Surakarta.
Sulistiani, Erina. 2019. Produksi Bibit Tanaman Dengan Menggunakan Teknik Kultur Jaringan.
Bogor: Seameo Biotrop.

16