Laporan Praktikum Ke: 8 Hari/Tanggal: Selasa/ 7 April 2020

Teknik Laboratorium Nutrisi dan Tempat Praktikum: Lab Biokimia,

Teknologi Pakan Fisiologi, dan Mikrobiologi Nutrisi
Nama Asisten :
1. Syarifah Aini (D24160007)
2. Martini Sihombing(D24160021)
3. Indri Agustiyani (D24160037)
4. Laily Rinda A (D24160057)

TEKNIK COUNTING BAKTERI ANAEROB

Ester Ayu Nadeak

D24170086
Kelompok 1/ G1

DEPARTEMEN ILMU NUTRISI DAN TEKNOLOGI PAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2020
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Bakteri merupakan salah satu golongan mikroorganisme

prokariotik (bersel tunggal) yang hidup berkoloni dan tidak mempunyai selubung
inti namun mampu hidup dimana saja (Jawetz et al 2004). Bakteri tidak dapat
dilihat oleh mata telanjang, ukuran mereka yang sangat kecil menyebabkan kita
tidak dapat melihat mereka. Kebutuhan oksigen pada bakteri tertentu
mencerminkan mekanisme yang digunakan untuk memenuhi kebutuhan
energinya. Mikroba anaerobik sangat rentan terhadap oksigen sehingga perlu
penggunaan teknik khusus seperti aplikasi teknik hungate atau penggunaan ruang
anaerob (Winiati dan Nurwitri 2012).
Penghitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan beberapa cara
diantaranya metode hitungan preparat (Total Plate Count) dan hitungan
mikroskopis langsung (Direct Count). Cara lain penentuan jumlah sel adalah
dengan menyaring sampel dengan saringan membran kemudian saringan tersebut
diinkubasi pada permukaan media yang sesuai. Koloni-koloni yang terbentuk
berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup (Wijaya et al 2015). Metode
hitungan preparat menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan hidup
berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks bagi
jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik penghitungan ini
membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran dan dipreparatkan hasil
pengenceran. Preparat tersebut kemudian diinkubasi dan kemudian dihitung
jumlah koloni yang terbentuk. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal
dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor
pengenceran pada preparat bersangkutan (Yunita et al 2015).
Total Plate Count (TPC) atau metode hitung cawan memeiliki prinsip
menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada media agar, sehingga mikroba
akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan
dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan
dapat dibedakan atas dua cara yaitu metode tuang (pour plate) dan
metodepermukaan (surface/spread plate) (Wijaya et al 2015). Dalam metode
hitungan cawan, sampel yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel/ml
memerlukan pengenceran sebelum ditumbuhkan di dalam cawan petri. Setelah
inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang masih
dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah diantara 30-300 koloni.
Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dan
seterusnya, atau 1:100, 1:10000, 1:1000000 dan seterusnya. Larutan yang
digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan NaCl 0.9% dan bufer fosfat.
Jumlah koloni dalam contoh yang dihitung atau koloni/ml yaitu jumlah koloni per
cawan dikali faktor pengenceran (Adiprabowo 2008).
 Tujuan

Praktikum ini bertujuan mengetahui cara perhitungan populasi bakteri

anaerob dengan metode cawan hitung atau perhitungan koloni.

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Anaerob

Nama bakteri berasal dari kata “bakterion” (bahasa Yunani) yang

berarti tongkat atau batang. Sejalan dengan pertambahnya pengetahuan, sekarang
bakteri digunakan untuk mikroorganisme bersel satu, berkembang biak dengan
pembelahan diri, serta memiliki ukuran mikron sehingga hanya tampak dengan
mikroskop (Puspitasari et al 2012). Mikroba anaerobic sangat rentan rentan
terhadap oksigen sehingga perlu penggunaan teknik khusus seperyi aplikasi teknik
hungate atau penggunaan ruang anaerob (Winiati dan Nurwitri 2012).
Berdasarkan kebutuhan oksigen tersebut, bakteri anaerob dapat dipisahkan
menjadi tiga kelompok, yaitu anaerob obligat yang tumbuh hanya dalam keadaan
tekanan oksigen sangat rendah dan oksigen bersifat toksik, anaerob aerotoleran
yang tidak mati dengan adanya paparan oksigen, dan anaerob fakultatif, dapat
tumbuh dalam keadaan aerob dan anaerob (Jawetz 2008).

Media BHIA (Brain Heart Infusion Agar)

Media merupakan suat u bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang
digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme baik dalam mengkultur bakteri,
jamur, dan mikroorganisme lain (Juariah dan Sari 2018). BHI agar adalah media
padat yang kaya nutrisi, cocok untuk kultivasi beberapa jenis bakteri, jamur, dan
kapang yang sensitif. BHI agar digunakan untuk kultivasi berbagai jenis
mikroorganisme yang sensitif seperti Streptococci, Meningococci, dan
Pneumococci. BHIA direkomendasikan dalam metode standar pengujian air dan
tes kepekaan mikroba. BHIA dan campuran pepton menyediakan nitrogen,
vitamin, mineral, dan asam amino yang mendukung pertumbuhan
mikroorganisme (Murray et al 2007)

Perhitungan Koloni

Metode TPC merupakan metode untuk menghitung jumlah mikroba yang

terdapat pada sampel makanan dan produk hasil pertanian. Jumlah mikroba harus
dibatasi pada produk makanan dan hasil pertanian harus mengikuti standar-standar
yang sudah ditetapkan. Metode TPC dibedakan atas dua cara, yakni metode tuang
(pour plate), dan metode permukaan (surface / spread plate). Pada metode tuang,
sejumlah sampel (1 ml atau 0,1ml) dari pengenceran yang dikehendaki
dimasukkan kecawan petri, kemudian ditambah agar-agar cair steril yang
didinginkan (47-50˚C) sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya
menyebar. Pada penanaman dengan metode permukaan, terlebih dahulu dibuat
agar cawan kemudian sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan dipipet pada
permukaan agar-agar tersebur. Kemudian diratakan dengan batang gelas
melengkung yang steril (Dwidjoseputro 2005).

Media Pengencer Anerob

Mikroba dapat hidup pada beberapa kondisi tertentu, sehingga medium

pengencer yang digunakan pun berbeda-beda. Pada analisis suatu mikroba
terdapat beberapa pilihan medium pengenceran yang dapat digunakan untuk
mikroba tertentu. Pada metode ini untuk pertumbuhan mikroba anaerobic
diperlukan pengencer yang mampu untuk menjaga potensial oksidasi-reduksi
pengencer tetap rendah. Mikroba anaerobic sangat rentan rentan terhadap oksigen
sehingga perlu penggunaan teknik khusus seperti aplikasi teknik hungate atau
penggunaan ruang anaerob (Winiati dan Nurwitri 2012).

MATERI DAN METODE

Materi

Alat yang diperlukan dalam praktikum ini diantaranya yaitu tabung CO2,
tabung hungate (tabung kultur), inkubator, roller tube, gas CO2 (dalam tabung),
syringe 1 mL. Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini yaitu cairan rumen dan
media BHI.

Metode

Pertama siapkan media BHI (5 mL) yang telah disterilisasi dan siapkan
media pengencer atau media putih sebanyak 4.95 mLyang telah distrelisasi. Media
BHI disimpan di waterbath dengan suhu 60 agar tidak memadat. Selanjutnya,
pengenceran berseri dilakukan. Metode kerja pengenceran yaitu dimulai dengan
mengambil cairan rumen sebanyak 0.05 mL kemudian masukkan ke pengencer
10-2 (pengencer 1) dan dihomogenkan dengan cara mebolak-balik tabung ke atas
dan ke bawah, kemudian putar membentuk angka 8. Setelah homogen, 0.05 mL
cairan dari tabung pengencer 10-2 (pengencer 1) diambil dan dan dimasukkan ke
tabung pengencar 10-4 (pengencer 2) lalu dihomogenkan. Setelah homogen, 0.05
mL cairan dari tabung pengencer 10-4 (pengencer 2) diambil dan dan dimasukkan
ke tabung pengencar 10-6 (pengencer 3) lalu dihomogenkan kembali. Setelah
homogen, 0.05 mL cairan dari tabung pengencer 10-6 (pengencer 3) diambil dan
dimasukkan ke tabung pengencar 10-8 (pengencer 4) lalu dihomogenkan kembali.
Setelah pengenceran berseri dilakukan, kemudian dilakukan transfer ke media
BHI. Transfer dilakukan mulai dari pengencer 10-8 (pengencer 4). Pengencer 4
(10-8) diambil 0.1 mL kemudian dimasukkan ke dalam media BHI dan
dihomogenkan setelah itu disimpan di roller tube untuk meratakanmedia BHI di
bagian dinding tabung. Kemudian tranfer dilakukan secara bertahap pada tabung
selanjutnya yaitu pengencer 3, 2, dan 1. Selanjutnya keempat tabung dimasukkan
ke dalam inkubator, diinkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 39 . Setelah 24-
48 jam kemudian dilakukan perhitungan koloni bakteri.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Koloni bakteri anaerob yang terlihat di tabung hungate dihitung dan jumlah
yang masuk dalam range 20-200 digunakan untuk perhitungan jumlah bakteri
anaerob. Berikut disampaikan hasil pehitungan koloni bakteri dari sampel rumen
yang berbeda.
Tabel 1. Hasil pengamatan perhitungan koloni bakteri anaerob
No Sampel Pengenceran Jumlah Koloni Jumlah populasi
bakteri
-2
1 A 10 237
-4
10 102
10.204 x 109
10-6 50
10-8 12
2 B 10-2 212
10-4 96
6.592 x 109
10-6 32
10-8 11

Pembahasan

Rumen merupakan alat pencerna fermentatif yang mengandung mikroba

pencerna seperti bakteri, fungi, protozoa. Dan dari ketiga macam mikroba tersebut
bakteri merupakan biomassa terbesar dan berperan penting dalam proses
pencernaan dalam rumen (Prestong dan Leng 1978). Bakteri rumen umumnya
bersifat anaerob yang hidup tanpa adanya oksigen bebas, tetapi masih dapat
ditemukan bakteri yang bersifat fakultatif yang dapat hidup dengan adanya sedikit
oksigen . Penetapan koloni bakteri ini bertujuan untuk mengetahui jumlah koloni
bakteri dalam rumen pada percobaan pakan ternak atau percobaan lainnya .
Perhitungan total bakteri membantu melengkapi hasil percobaan- percobaan
pakan selain dari in vitro dan in vivo.
Media agar termasuk ke dalam media padat. Teknik yang biasa
digunakan dalam media padat biasanya berdasarkan jumlah hitungan koloni pada
lempeng atau colony forming unit (CFU) dari inokulum standar mikroba.
Hitungan koloni dapat digunakan untuk melihat rasio produktifitas yang
mengkuantifikasi pertumbuhan relatif dari mikroba pada media yang diujikan
dengan pertumbuhan mikroba tersebut secara paralel pada media referensi (Corry
et al 2011). Angka Lempeng Total (ALT) merupakan salah satu cara untuk
mempermudah dalam pengujian mikroorganisme dari suatu produk, dan Angka
Lempeng Total (ALT) menunjukkan adanya mikroorganisme pathogen atau non
pathogen yang dilakukan pengamatan secara visual atau dengan kaca pembesar
pada media penanaman yang diteliti, kemudian dihitung berdasarkan lempeng
dasar untuk standart test terhadap bakteri (Arisandi et al 2017).
Kuantifikasi populasi mikroorganisme sering dilakukan untuk
mendapatkan jumlah kuantitatif mikroorganisme target. Kuantifikasi tersebut
dapat berupa penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel. Penentuan jumlah sel
dapat dilakukan pada mikroorganisme bersel tunggal. Penentuan massa sel
dilakukan bagi mikroorganisme bersel tunggal dan mikroorganisme berfilamen.
Penghitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan beberapa cara diantaranya
metode hitungan preparat (Total Plate Count) dan hitungan mikroskopis langsung
(Direct Count). Metode hitungan preparat menggunakan anggapan bahwa setiap
sel akan hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul
menjadi indeks bagi jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel (Wijaya
et al 2015).
Jumlah koloni apabila memenuhi syarat SPC 25–250, koloni dimasukkan
ke dalam pembagian pengenceran tertinggi dibagi dengan pengenceran terendah,
jika hasil bagi pengenceran ≤2 maka SPC yang digunakan adalah perhitungan
rata-rata kedua data, jika >2 maka yang digunakan adalah perhitungan
pengenceran terendah. Jumlah koloni jika <25 koloni maka menggunakan
pengenceran terendah, dan jumlah koloni > 250 koloni menggunakan pengenceran
tertinggi (Andrian et al 2014). Sebaran jumlah koloni tiap sampel dan tiap faktor
pengenceran menunjukkan adanya keragaman data yang seragam dan sesuai
prinsip faktor pengenceran, yang mana semakin rendah konsentrasi sampel hasil
pengenceran (10-8) atau semakin tinggi konsentrasi pengencer dibanding cairan
rumen maka semakin tinggi jumlah koloni mikroba atau faktor pengenceran
berbanding terbalik dengan jumlah koloni mikroba karena koloni bakteri yang
semakin tersebar (Sukmawati dan Hardianti 2018).
Berdasarkan hasil pengamatan pada sampel A dan B tabung pengencer
dengan faktor pengenceran 10-2 dan 10-8 tidak dilakukan analisis data sebab
jumlah koloni tiap sampel melebihi ambang batas maksimum dan minimum
standar penghitungan analisis total plate count, yang mana batas maksimumnya
ialah 250 cfu/g dan batas minimumnya ialah 25 cfu/g (Fardiaz 2004). Pengencer
10-4 dan 10-6 memiliki jumlah koloni yang termasuk dalam range sehingga
diikutkan dalam perhitungan total bakteri.
Sampel A memiliki total bakteri lebih besar dibandingkan sampel B yaitu
sebesar 10.204 x 109 sel/mL. Sampel B memiliki total bakteri sebesar 6.592 x 109
sel/mL. Menurut Arora (1989), konsentrasi bakteri pada rumen sapi dapat
mencapai 21 x 109 per ml cairan rumen. Bakteri dalam rumen dapat berasal dari
bahan pakan maupun adanya kontak langsung dengan bahan lain yang
mengandung bakteri. Bakteri merupakan mikroorganisme rumen yang dominan.
Dilihat dari fungsinya, bakteri dalam rumen dapat dibagi menjadi 7 (tujuh)
kelompok utama, yaitu (1) kelompok pencerna selulosa, (2) kelompok pencerna
hemiselulosa, (3) kelompok pencerna pati, (4) kelompok pencerna gula, (5)
kelompok pemakai laktat, (6) kelompok pembentuk metan, dan (7) kelompok
bakteri proteolitik. Bakteri rumen telah beradaptasi untuk hidup pada kondisi fisik
rumen relatif tetap yakni pH 5,5–7,0 dan dalam keadaan anaerob (ada oksigen,
tetapi sangat sedikit), suhu 39–40 , dan konsentrasi produk fermentasi kontinyu,
walau tidak begitu tinggi (Purbowati et al 2014).
 Bakteri yang normal di saluran pencernaan adalah bakteri golongan
Enterobactericeae seperti Escherichia coli, Proteus, Nitrobacter, Citrobacter,
Shigella, bakteri pencerna selulosa Bacteroides succinogenes, Ruminococcus
flavafaciens, Ruminococcus albus, Butyrivibrio fibrisolvens), bakteri pencerna
hemiselulosa (Butyrivibrio fibrisolvens, Bakteroides ruminocola, Ruminococcus
sp), bakteri pencerna pati (Bakteroides ammylophilus, Streptococcus bovis,
Succinnimonas amylolytica, bakteri pencerna gula (Triponema bryantii,
Lactobasilus ruminus), dan bakteri pencerna protein (Clostridium sporogenus,
Bacillus licheniformis) (Das dan Qin 2012). Bakteri ini hidup secara normal
disaluran pencernaan dari rumen, usus halus, usus besar sampai ke kolon.

SIMPULAN

Perhitungan total bakteri anaerob dilakukan dengan penrhitungan koloni

yang menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan hidup berkembang menjadi
satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks bagi jumlah oganisme
yang terkandung di dalam sampel. Koloni yang dimasukkan dalam perhitungan
adalah yang nilainya termasuk dalam range 20-200. Total Bakteri anaerob cairan
rumen hasil perhitungan menunjukkan bahwa hasil yang diperoleh sesuai dengan
literatur.

DAFTAR PUSTAKA

Adiprabowo H. 2008. Potensi antibakteri campuran propolis trigona spp dan

garam kelapa terhadap Streptococcus mutans. [Skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Andrian BG, Fatimawati, Kojong SN. 2014. Analisis cemaran bakteri coliform
dan identifikasi escherichia coli pada air isi ulang dari depot di Kota
Manado. Jurnal Ilmiah Farmasi-UNSRAT. 3(3): 325–334.
Arisandi A, Tamam B, Yuliandari R. 2017. Jumlah koloni pada media kultur
bakteri yang berasal dari thallus dan perairan sentra budidaya
Kappaphycus alvarezii di Sumenep. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan.
9(1): 57-64.
Arora SP. 1989. Pencernaan Mikroba pada Ruminansia. Diterjemahkan oleh:
Retno Murwani. Yogyakarta (ID): Gadjah Mada University Press.
Corry JE, Curtis GD, Baird RM. (2011). Handbook of Culture Media for Food
and Water Microbiology. Royal Society of Chemistry.
Das KC, Qin W. 2012. Isolation and characterization of superior rumen bacteria
of cattle (Bos taurus) and potential application in animal feedstuff. J Anim
Sci. 2(4): 224
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta (ID): Djambatan.
Fardiaz S. 2004. Analisa Mikrobiologi Pangan. Jakarta (ID): PT. Raja Grafindo
Persada.
Jawetz E, Melnick J, Adelberg. 2004. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 23. Jakarta
(ID): EGC.
Jawetz A, Melnick. 2008. Medical Microbiology. Edisi 23. Jakarta(ID): Penerbit
Kedokteran EGC.
Juariah S. Sari WP. 2018. pemanfaatan limbah cair industri tahu sebagai media
alternatif pertumbuhan Bacillus sp. Jurnal Analisis Kesehatan Klinikal
Sains. 6(1):24-29.
Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA. 2007. Manual of
Clinical Mikrobiology. Edisi 9. Washington DC (US): ASM Press.
Prestong TR, Leng RA. 1978 . Matching Ruminants Production Sistem with
Available Resource in Tropic and Sub Topics. Armidele (AU): Penambul
Books.
Purbowati E, Rianto E, Dilaga WS, Lestari CMS, Adiwinarti R. 2014.
Karakteristik cairan rumen, jenis, dan jumlah mikrobia dalam rumen sapi
Jawa dan peranakan Ongole. Buletin Peternakan. 38(1): 21-26.
Puspitasari FD, Shovitri M, Kuswytasari ND. 2012. Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik. Jurnal Sains dan Seni ITS.
1(1):1-4.
Sukmawati, Hardianti F. 2018. Analisis total plate count (TPC) mikroba pada ikan
asin kakap di kota Sorong Papua Barat. Jurnal Biodjati. 3 (1): 72-78.
Wijaya RC, Utari EL, Yudianingsih. 2015. Perancangan alat penghitung bakteri.
Jurnal Teknologi Informasi. 10(9): 21-30.
Winiati, Nurwitri. 2012. Mikrobiologi Pangan. Bogor (ID): IPB Press.
Yunita M, Hedrawan Y, Yulianingsih R. 2015. Analisis kuantitatif mikrobiologi
pada makanan penerbangan (Aerofood ACS) Garuda Indonesia
berdasarkan TPC (Total Plate Count) dengan metode pour plate. Jurnal
Keteknikan Pertanian Tropis dan Biosistem 3(3):237-248.
LAMPIRAN