RESUME JURNAL

BIOTEKNOLOGI TANAMAN

Dosen Pengampu : Dr. Agr. Ir. Tengku Nurhidayah, Msc

OLEH :

DANIEL GINTING SUKA

2006134990

NO ABSEN 41

JURUSAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS RIAU

PEKANBARU

2022
 Perbanyakan Tanaman Hias Air Bacopa australis Secara In Vitro Pada
Berbagai Formulasi Hormon Media Pertumbuhan

Sejak era 1980 tanaman hias air sudah dikenal di Indonesia untuk kalangan terbatas.
Budidaya komoditas ini mulai popular sekitar tahun 2000 akan tetapi teknologi budidayanya
masih secara konvensional. Pada tahun 2004 Indonesia mampu melakukan ekspor tanaman
hias air ke-28 negara, akan tetapi karena tingginya permintaan dan beragam jenis tanaman
hias, sehingga tidak mampu memenuhi pasar luar negeri, mengakibatkan terjadimya
penurunan terhadap nilai ekspor komoditas ini (Bank Indonesia, 2008). Nugraha et al. (2017)
telah melakukan pembentukan tanaman indukan aseptik (mother plant) untuk tanaman air
Bacopa australis secara in-vitro. Mother plant yang sudah terbentuk ini akan diperbanyak
secara massal; oleh karena itu, perlu dicari suatu formulasi zat pengatur tumbuh yang dapat
menghasilkan bibit yang seragam, cepat dalam jumlah besar.

Bahan tanaman yang digunakan adalah biakan aseptik dari mother plant (induk
tanaman dalam in vitro) Bacopa australis (L.) Koleksi hasil kerja sama Balai Riset Budidaya
Ikan Hias dan BB-Biogen. Biakan in vitro Bacopa australis (L.) disubkultur pada media dasar
MS (Murashige & Skoog, 1962).

Penelitian ini terdiri atas tiga tahapan kegiatan yaitu: (1) induksi tunas, (2) multiplikasi
tunas, (3) induksi perakaran.

Tunas yang telah berukuran 2 cm, yang dihasilkan pada kegiatan induksi tunas
dipindahkan ke media multiplikasi. Media untuk multiplikasi adalah media dasar MS yang
diperkaya dengan BA dan thidiazuron. Dalam satu botol media multiplikasi tunas terdapat tiga
tanaman. Rancangan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap
faktorial. Faktor yang pertama adalah konsentrasi BA yaitu 0,0; 0,5; 1,0; dan 1,5 mg/L dan
faktor yang kedua yaitu konsentrasi thidiazuron yaitu 0,0; 0,1, 0,3; dan 0,5 mg/L. Masing-
masing perlakuan terdiri atas 10 ulangan. Pengamatan dilakukan pada umur satu minggu
setelah tanaman pada seluruh eksplan tanaman. Peubah yang diamati meliputi jumlah tunas
dan jumlah daun. Apabila terdapat pengaruh yang nyata dari perlakuan yang dianalisis secara
statistik terhadap peubah yang diamati, maka dilakukan uji lanjut Duncan pada taraf
kepercayaan 95%.

Pada penelitian multiplikasi tunas, eksplan yang digunakan berasal dari kegiatan
induksi tunas yang berasal dari perlakuan terbaik. Tunas yang disubkultur berukuran ± 1 cm
dan memiliki dua nodus (buku batang). Hasil analisis ANOVA menunjukkan interaksi dari BA
dan thidiazuron memberikan pengaruh yang nyata terhadap jumlah tunas maupun jumlah
daun. Pemberian thidiazuron tanpa kombinasi zat pengatur tumbuh lain mampu
meningkatkan kemampuan tunas untuk bermultiplikasi. Penghitungan jumlah tunas dilakukan
setiap satu minggu sekali pada seluruh eksplan yang dikultur. Peningkatan konsentrasi
thidiazuron hingga 0,1 mg/L mampu meningkatkan jumlah tunas hingga rata-rata 3,5 tunas
(Tabel 1) dan jumlah daun 36 (Tabel 2; Gambar 3A). Peningkatan thidiazuron menjadi 0,3
mg/L dan pada 0,5 mg/L cenderung akan menurunkan kemampuan eksplan membentuk
tunas dan daun walaupun tidak berbeda nyata dengan perlakuan thidiazuron 0,1 mg/L.
Keadaan yang sama juga terjadi pada beberapa jenis tanaman di antaranya Plumbago
zeylanica, Rauwolfia serpentina L., di mana pemberian thidiazuron yang seimbang mampu
menginduksi multiplikasi tunas. Hal ini karena thidiazuron memiliki kemampuan untuk
menginduksi terjadinya proses pembelahan sel (Yunita & Lestari, 2011; Syahid & Kristina,
2008). Pemberian zat pengatur tumbuh BA dan thidiazuron secara bersamaan mampu
meningkatkan kemampuan tunas untuk bermultiplikasi daripada perlakuan BA atau
thidiazuron secara tunggal. Pada percobaan ini pemberian BA dan thidiazuron yang optimum
adalah pada konsentrasi 0,5 mg/L BA dan 0,1 mg/L thidiazuron di mana rata-rata tunas yang
dihasilkan adalah 32,4 tunas sedangkan jumlah daun adalah 137,6 daun (Gambar 3B) dan
memberikan pengaruh yang berbeda nyata dari perlakuan lainnya. Parameter jumlah cukup
penting untuk diamati karena dari ketiak daun dapat muncul tunas sehingga dapat
meningkatkan faktor multiplikasi tunas. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa formulasi
media terbaik untuk multiplikasi tunas adalah MS + 0,5 mg/L BA + 0,1 mg/L thidiazuron.
Pengunaan thidiazuron pada media kultur pada konsentrasi relatif rendah lebih efektif bila
dikombinasi dengan BA, akan tetapi apa bila konsentrasi BA dan thidiazuron relatif lebih tinggi
cenderung akan menurunkan kemampuan tunas untuk bermultiplikasi. Hal ini juga terjadi
pada tanaman yang memiliki khasiat obat seperti Kigelia pinnata, kemampuannya
bermultiplikasi meningkat dengan pemberian thidiazuron 0,5 ìm dan bila konsentrasi terus
ditingkatkan maka kemampuan tunas untuk bermultiplikasi menjadi menurun (Thomas &
Puthur, 2004). Hal ini karena sitokinin eksogen yang diberikan dalam konsentrasi berlebih
akan dapat meningkatkan enzim sitokinin oksidase yang berperan memelihara keseimbangan
sitokinin dalam sel tanaman dengan mengoksidasi kelebihan sitokinin bila tidak diperlukan
sehingga akan menghambat pertumbuhan organ (Staden et al., 2008).

Formulasi media yang terbaik untuk induksi tunas Bacopa australis secara in vitro
adalah MS + BA 0,3 mg/ L. Formulasi media yang optimal untuk multiplikasi tunas adalah MS
+ BA 0,5 mg/L + thidiazuron 0,1 mg/ L dan untuk induksi perakaran adalah MS + IBA 0,5 mg/L.
 Media Akuakultur, 13 (2), 2018, 75-82

Tersedia online di: http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/ma

PERBANYAKAN TANAMAN HIAS AIR Bacopa australis SECARA IN VITRO

PADA BERBAGAI FORMULASI HORMON MEDIA PERTUMBUHAN

Rossa Yunita*)#, Endang Gati Lestari*), Mastur*), dan Media Fitri Isma Nugraha**)
*)
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian
Jl. Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111
**)
Balai Riset Budidaya Ikan Hias
Jl. Perikanan No. 13, Pancoran Mas, Depok 16436

(Naskah diterima: 22 Februari 2018; Revisi final: 10 September 2018; Disetujui publikasi: 11 September 2018)

ABSTRAK

Suksesnya pembentukan indukan (mother plant) tanaman hias air Bacopa australis pada penelitian sebelumnya,
mendorong perbanyakan tanaman dengan menggunakan teknik kultur in vitro secara massal untuk
menghasilkan bibit Bacopa australis dalam jumlah yang banyak dan relatif lebih cepat. Tujuan penelitian
adalah mendapatkan formulasi media yang tepat untuk induksi tunas, multiplikasi tunas, dan induksi
perakaran yang cepat secara in vitro dari Bacopa australis. Penelitian ini terdiri atas tiga tahapan kegiatan,
yaitu induksi tunas, multiplikasi tunas, dan induksi akar. Hasil penelitian menunjukkan formulasi media
yang terbaik induksi tunas Bacopa australis secara in vitro adalah MS + BA 0,3 mg/L. Formulasi media yang
optimal untuk multiplikasi tunas adalah MS + BA 0,5 mg/L + Thidiazuron 0,1 mg/L dan induksi perakaran
adalah MS + IBA 0,5 mg/L.
KATA KUNCI: Bacopa australis; benzil adenin; indole butyric acid; perbanyakan tanaman; thidiazuron

ABSTRACT: In vitro propagation of ornamental aquatic plants Bacopa australis in various growth hormon
medium. By: Rossa Yunita, Endang Gati Lestari, Mastur, and Media Fitri Isma Nugraha

The successful establishment of mother plant Bacopa australis in the previously related research opens an opportunity
to produce relatively fast and in large quantities Bacopa australis seeds using in vitro mass culture techniques. The
objective of the study was to determine suitable formulated media for shoot induction, shoot multiplication, and root
induction of Bacopa australis. This study consisted of three research stages, namely shoot induction, shoot multiplication,
and root induction. The results showed that the best formulated media for in vitro Bacopa australis shoot induction
was MS + BA 0.3 mg/L. The optimal formulated media for shoot multiplication was MS + BA 0.5 mg/L +
Thidiazuron 0.1 mg/L and for root induction was MS + IBA 0.5 mg/L.
KEYWORDS: Bacopa australis; benzil adenin; indole butyric acid; plant propagation; thidiazuron

PENDAHULUAN mengakibatkan terjadimya penurunan terhadap nilai

Sejak era 1980 tanaman hias air sudah dikenal di
Indonesia untuk kalangan terbatas. Budidaya komoditas
ini mulai popular sekitar tahun 2000 akan tetapi
teknologi budidayanya masih secara konvensional.
Pada tahun 2004 Indonesia mampu melakukan ekspor
tanaman hias air ke-28 negara, akan tetapi karena
tingginya permintaan dan beragam jenis tanaman hias,
sehingga tidak mampu memenuhi pasar luar negeri,
#
Korespondensi: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian
Jl. Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111, Indonesia.
Tel.: + 62 251 8337975
E-mail: media.nugraha@kkp.go.id
ekspor komoditas ini (Bank Indonesia, 2008).
Bacopa australis merupakan jenis gulma air yang
banyak diminati oleh konsumen baik di dalam maupun
luar negeri. Bacopa australis awalnya ditemukan di
Brasil Selatan. Bacopa australis mudah tumbuh di
akuarium dan pada kondisi tertentu dapat merayap
di bagian dasar akuarium membentuk bantalan hijau
yang elegan dan dekoratif.
Nugraha et al. (2017) telah melakukan
pembentukan tanaman indukan aseptik (mother plant)
untuk tanaman air Bacopa australis secara in-vitro.
Mother plant yang sudah terbentuk ini akan
diperbanyak secara massal; oleh karena itu, perlu dicari

Copyright @ 2018, Media Akuakultur, p-ISSN 1907-6762; e-ISSN 2502-9460 75

Perbanyakan tanaman hias air Bacopa australis secara in vitro ..... (Rossa Yunita)
suatu formulasi zat pengatur tumbuh yang dapat
menghasilkan bibit yang seragam, cepat dalam jumlah
besar.
Teknologi yang dapat digunakan untuk penyediaan
bibit dalam jumlah besar dan waktu relatif lebih singkat
adalah teknik kultur in vitro. Teknologi yang sama telah
berhasil untuk perbanyakan Artemisia annua (Yunita &
Lestari, 2008) Baccopa monnieri (Dharishini et al.,
2014), Rauwolfia serpentina L. (Yunita & Lestari, 2011).
Perbanyakan tanaman secara in vitro melalui jalur
organogenesis mampu menghasilkan bibit tanaman
yang seragam baik dari segi morfologi maupun
genetik (Yunita et al., 2012). Teknologi ini mampu
menghasilkan bibit dalam jumlah yang relatif besar
pada areal yang tidak begitu luas dan tidak dibatasi
oleh faktor iklim. Modifikasi media tanam pada
beberapa unsur, teknik ini dapat menghasilkan bibit
yang bebas patogen (jamur, virus, bakteri).
Keberhasilan teknologi kultur jaringan,
dipengaruhi oleh sejumlah faktor yang kompleks, di
antaranya adalah nutrisi dan senyawa organik berupa
zat pengatur tumbuh. Kandungan hara makro dan
mikro sangat dibutuhkan untuk terjadinya proses
morfogenesis. Perbanyakan melalui jalur organogen-
esis, pada tahap pembentukan tunas penambahan
sitokinin tanpa auksin akan memacu penggandaan
tunas karena penambahan sitokinin mampu
menghilangkan dormansi tunas apikal (Zulkarnain,
2011; Hartati et al., 2014).
Benzil adenin (BA) merupakan salah satu jenis
sitokinin yang umum digunakan untuk induksi tunas
karena mampu menginduksi terjadinya pembelahan
sel, pembentukan organ seperti pucuk (Hartati et al.,
2014). Thidiazuron merupakan senyawa difenil urea
yang memiliki sifat hampir sama dengan sitokinin.
Thidiazuron dapat menginduksi multiplikasi tunas
lebih cepat daripada sitokinin jenis lain (Khawar et
al., 2003). Guo et al., (2011) menjelaskan bahwa
thidiazuron berperan menstimulasi produksi sitokinin
endogen sel. Pada pengunaannya umumnya
dikombinasikan dengan BA untuk meningkatkan
multiplikasi tunas. Auksin Indole Butyric Acid (IBA)
merupakan hormon potensial yang banyak direspons
oleh berbagai tanaman untuk indusi akar (Santos et
al., 2003) karena IBA mampu menstimulasi munculnya
tunas akar.
Suksesnya pembentukan mother plant Bacopa aus-
tralis oleh Nugraha et al. (2017) maka penelitian ini
dirasa perlu dilanjutkan dengan tujuan untuk
mendapatkan formulasi zat pengatur tumbuh yang
76 Copyright @ 2018, Media Akuakultur, p-ISSN 1907-6762; e-ISSN 2502-9460
tepat untuk induksi tunas, multiplikasi tunas, dan
induksi perakaran secara in vitro dari Bacopa australis.
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan pada bulan Januari hingga Juni
2017 di laboratorium Biologi Sel dan Jaringan, Balai
Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen), Bogor.
Bahan tanaman yang digunakan adalah biakan aseptik
dari mother plant (induk tanaman dalam in vitro) Bacopa
australis (L.) Koleksi hasil kerja sama Balai Riset
Budidaya Ikan Hias dan BB-Biogen. Biakan in vitro Bacopa
australis (L.) disubkultur pada media dasar MS
(Murashige & Skoog, 1962). Media MS dibuat sesuai
dosis formula dari Murashige & Skoog (1962), yang
diperkaya dengan zat pengatur tumbuh sesuai
perlakuan yang diberikan dan dilengkapi dengan
sukrosa 3% (w/v), serta dibuat padat dengan
menambahkan agar 0,2% (phytagel/Gelrate).
Kemasaman media dibuat 5,8 dengan menambahkan
1N NaOH atau 1N HCl. Media kultur dimasukkan dalam
wadah botol kaca dan di-autoclave pada suhu 121°C
selama 15 menit. Setelah di-autoclave media kultur
diletakkan pada ruang kultur pada suhu 25°C hingga
masa tanam dilakukan. Setelah tiga hari eksplan di
tanaman dengan ukuran 1 cm kemudian disimpan di
luar penyimpanan dengan intensitas penyinaran
sebesar 1.000-2.000 lux selama 16 jam/hari. Setelah
biakan berumur dua bulan, setinggi ± 5 cm dan
menghasilkan daun yang memiliki ukuran yang
memadai sebagai eksplan. Eksplan yang digunakan
adalah batang yang memiliki dua mata tunas dengan
panjang ± 0,7 cm.
Penelitian ini terdiri atas tiga tahapan kegiatan
yaitu: (1) induksi tunas, (2) multiplikasi tunas, (3)
induksi perakaran.
Induksi Tunas
Pada kegiatan induksi tunas ini, eksplan dengan
ukuran 1 cm, yang digunakan berupa ruas batang dari
hasil indukan aseptik. Media yang digunakan adalah
media dasar MS yang diperkaya dengan zat pengatur
tumbuh (ZPT) yaitu BA. Rancangan acak lengkap (RAL)
digunakan dalam penelitian ini dengan perlakuan pada
konsentrasi BA yaitu 0,0; 0,3; 0,5; 0,7 mg/L. Masing
perlakuan terdiri atas 10 ulangan. Pengamatan
dilakukan setelah tujuh hari setelah tanaman, dan
pengamatan dilakukan pada seluruh eksplan tanaman
yang dikultur. Peubah yang diamati adalah, jumlah tu-
nas (banyaknya tunas yang terbentuk) dan jumlah daun
yang terbentuk. Data yang diperoleh dianalisis secara

stasistik dan apabila terdapat pengaruh yang nyata dari
perlakuan terhadap peubah yang diamati, kemudian
dilakukan uji lanjut Duncan pada taraf kepercayaan 95%.
Multiplikasi Tunas
Tunas yang telah berukuran 2 cm, yang dihasilkan
pada kegiatan induksi tunas dipindahkan ke media
multiplikasi. Media untuk multiplikasi adalah media
dasar MS yang diperkaya dengan BA dan thidiazuron.
Dalam satu botol media multiplikasi tunas terdapat
tiga tanaman. Rancangan yang digunakan pada
penelitian ini adalah rancangan acak lengkap faktorial.
Faktor yang pertama adalah konsentrasi BA yaitu 0,0;
0,5; 1,0; dan 1,5 mg/L dan faktor yang kedua yaitu
konsentrasi thidiazuron yaitu 0,0; 0,1, 0,3; dan 0,5
mg/L. Masing-masing perlakuan terdiri atas 10 ulangan.
Pengamatan dilakukan pada umur satu minggu setelah
tanaman pada seluruh eksplan tanaman. Peubah yang
diamati meliputi jumlah tunas dan jumlah daun. Apabila
terdapat pengaruh yang nyata dari perlakuan yang
dianalisis secara statistik terhadap peubah yang
diamati, maka dilakukan uji lanjut Duncan pada taraf
kepercayaan 95%.
Induksi Perakaran
Tunas dari perlakuan multiplikasi tunas yang telah
tumbuh ± 5 cm, dipindahkan pada media perakaran,
dengan jumlah tiga eksplan per botol kultur. Percobaan
induksi akar menggunakan media MS yang diperkaya
dengan auksin IBA. Penelitian ini menggunakan
rancangan acak lengkap dengan perlakuan konsentrasi
IBA konsentrasi yaitu 0,0; 0,5; 1,0 mg/L. Masing-masing
perlakuan terdiri atas 10 ulangan. Peubah yang diamati
adalah jumlah akar dan panjang akar setelah berumur
delapan minggu. Data dianalisis secara stasistik dan
bila terdapat pengaruh yang nyata dari peubah yang
diamati, kemudian dilakukan uji lanjut Duncan pada
taraf kepercayaan 95 %.
HASIL DAN BAHASAN
Induksi Tunas
Secara umum eksplan Bacopa australis mampu
menghasilkan tunas akan tetapi jumlah yang dihasilkan
bervariasi. Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahawa
perlakuan konsentrasi BA memberikan pengaruh yang
berbeda nyata terhadap jumlah tunas maupun jumlah
daun. Beberapa hasil penelitian menunjukkan umumnya
tanaman Bacopa sp. diperbanyak secara in vitro
menggunakan batang yang memiliki mata tunas
sebagai eksplan (Vijayakumar et al., 2010; Pandiyan &
Selvaraj, 2012; Kapil & Sharma, 2014).
Pemberian BA hingga 0,3 mg/L mampu menginduksi
terbentuknya tunas paling banyak dan memberikan
Copyright @ 2018, Media Akuakultur, p-ISSN 1907-6762; e-ISSN 2502-9460
Media Akuakultur, 13 (2), 2018, 75-82
pengaruh yang berbeda nyata daripada perlakuan 0,0;
0,5; 0,7 mg/L (Gambar 1 dan 2). Selain jumlah tunas
yang lebih banyak, perlakuan BA 0,3 mg/L menghasilkan
rataan jumlah daun yang lebih banyak, serta berbeda
nyata dari perlakuan lainnya. Hal yang sama ditunjukan
dari hasil penelitian induksi tunas Artemisia annua;
menunjukan bahwa media terbaik untuk menginduksi
tunas adalah media yang mengandung BA (Yunita &
Lestari, 2008). Perlakuaan BA 0,3 mg/L juga
menghasilkan jumlah daun yang mempunyai mata tu-
nas pada ketiak daun yang lebih banyak dari perlakuan
lainnya. Dalam perbanyakan tanaman secara in vitro
hal ini sangat penting karena mata tunas yang berada
pada ketiak daun dapat dimanfaatkan sebagai sumber
eksplan baru.
Eksplan yang dikultur pada media tanpa BA
menghasilkan jumlah rataan tunas yang paling rendah
yaitu 1,1 dengan jumlah rataan daun 9,2 (Gambar 1).
Eksplan yang dikulturkan pada media yang
mengandung BA hingga konsentrasi tertentu mampu
meningkatkan terbentuknya tunas dan daun. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa pemberian sitokinin
terutama BA pada media sangat penting dalam induksi
tunas secara in vitro pada berbagai jenis tanaman di
antaranya Bacopa monnieri (L.) (Pandiyan & Selvara,
2012; Kapil & Sharma, 2014), Withania somnifera
(Chandran et al., 2007), Sarcostemma brevistigm (Tho-
mas & Shankar, 2009).
Pada Gambar 1 juga dapat diamati bahwa pemberian
BA lebih besar dari 0,5 mg/L akan menurunkan
kemampuan eksplan membentuk tunas, di mana pada
konsentrasi 0,5 mg/L jumlah rata-rata tunas yang
terbentuk adalah 1,4 dengan jumlah rata-rata daun 9,4.
Pada perlakuan BA 0,7 mg/L terjadi penurunan jumlah
rata-rata tunas dan daun. Konsentrasi BA yang relatif
tinggi pada media kultur akan menghambat
pembentukan tunas dan daun pada eksplan Bacopa
australis. Pemberian BA pada konsentrasi relatif tinggi
akan menghambat pembentukan organ pada kultur.
Aplikasi sitokinin pada konsentrasi tinggi dapat
mengganggu penyerapan unsur hara, serta
menghambat pertumbuhan eksplan (Karyanti, 2017).
Respons zat pengatur tumbuh yang terekspresi
tergantung pada kemampuan eksplan dalam menyerap
dan menggunakan zat pengatur tumbuh endogen yang
ada dan ZPT eksogen yang diserap dari media tumbuh
(Tuhuteru et al., 2012).
Multiplikasi Tunas
Pada penelitian multiplikasi tunas, eksplan yang
digunakan berasal dari kegiatan induksi tunas yang
berasal dari perlakuan terbaik. Tunas yang disubkultur
berukuran ± 1 cm dan memiliki dua nodus (buku
batang). Hasil analisis ANOVA menunjukkan interaksi
77
Perbanyakan tanaman hias air Bacopa australis secara in vitro ..... (Rossa Yunita)

16
Jumlah
Jumlah tunas
tunas (Number
(Number ofofshoots)
shoots)
14 12.2a
Jumlah daun
Jumlah daun (Number
(Number ofofleaves)
leaves)
12 9.4b
9.2b
10
6.6c
8
6
4
2.2a
2 1.1b 1.4a 1.1b

0
BA-0 BA-0.3 BA-0.5 BA-0.7

Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf sama pada baris dan kolom yang sama
tidak berbeda nyata pada taraf 5%, uji jarak berganda Duncan
Remarks: Values followed by the same letter in the same row and column are not
significantly different at the 5% level, according to Duncan’s multiple-range
test
Gambar 1. Pengaruh konsentrasi BA terhadap jumlah tunas dan jumlah
daun pada eksplan Bacopa australis.
Figure 1. Effect of BA concentration on shoot number and number of leaves
on explant Bacopa australis.

A B

Gambar 2. Induksi tunas pada media MS (A); induksi tunas pada media MS + BA
0,3 mg/L (B).
Figure 2. Shoot induction on MS medium (A); on MS + BA 0.3 mg/L (B).

dari BA dan thidiazuron memberikan pengaruh yang thidiazuron menjadi 0,3 mg/L dan pada 0,5 mg/L
nyata terhadap jumlah tunas maupun jumlah daun. cenderung akan menurunkan kemampuan eksplan
membentuk tunas dan daun walaupun tidak berbeda
Pemberian thidiazuron tanpa kombinasi zat
nyata dengan perlakuan thidiazuron 0,1 mg/L. Keadaan
pengatur tumbuh lain mampu meningkatkan
yang sama juga terjadi pada beberapa jenis tanaman
kemampuan tunas untuk bermultiplikasi. Penghitungan
di antaranya Plumbago zeylanica, Rauwolfia serpentina
jumlah tunas dilakukan setiap satu minggu sekali pada
L., di mana pemberian thidiazuron yang seimbang
seluruh eksplan yang dikultur. Peningkatan konsentrasi
mampu menginduksi multiplikasi tunas. Hal ini karena
thidiazuron hingga 0,1 mg/L mampu meningkatkan
thidiazuron memiliki kemampuan untuk menginduksi
jumlah tunas hingga rata-rata 3,5 tunas (Tabel 1) dan
terjadinya proses pembelahan sel (Yunita & Lestari,
jumlah daun 36 (Tabel 2; Gambar 3A). Peningkatan
2011; Syahid & Kristina, 2008).

78 Copyright @ 2018, Media Akuakultur, p-ISSN 1907-6762; e-ISSN 2502-9460

 Media Akuakultur, 13 (2), 2018, 75-82

Tabel 1. Pengaruh kombinasi BA dan thidiazuron terhadap rata-rata jumlah tunas

eksplan Bacopa australis
Table 1. The influence of combination of BA and thidiazuron on the average number of
shoot of explant Bacopa australis

Konsentrasi BA Konsentrasi thidiazuron

BA concentration Thidiazuron concentration (mg/L)
(mg/L) 0 0.1 0.3 0.5

0 1.3 ± 0.48 e 3.5 ± 0.84 e 2.7 ± 0.94e 2.2 ± 1.14 e

d a c
0.5 11.2 ± 0.9 32.4 ± 4.91 20.9 ± 8.94 10.4 ± 1.84 d
1.0 4.0 ± 0.82 c 24.3 ± 7.95b 12.2 ± 2.53 d 1.1 ± 0.56 e
1.5 3.5 ± 1.14 e 21.8 ± 7.55 bc 9.8 ± 2.20 d 1.0 ± 0.67 e
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf sama pada baris dan kolom yang sama tidak berbeda
nyata pada taraf 5%, uji jarak berganda Duncan
Remarks: Values followed by the same letter in the same row and column are not significantly
different at the 5% level, according to Duncan’s multiple-range test

Tabel 2. Pengaruh kombinasi BA dan thidiazuron terhadap rata-rata jumlah daun eksplan
Bacopa australis
Table 2. The influence of combination of BA and thidiazuron on the average number of leaves
of explant Bacopa australis

Konsentrasi BA Konsentrasi thidiazuron

BA concentration Thidiazuron concentration (mg/L)
(mg/L) 0 0.1 0.3 0.5

0 7.3 ± 3.13 g 36.0 ± 7.15 cd 26.4 ± 7.26 de 23.4 ± 3.78 ef

0.5 24.1 ± 2.51ef 137.6 ± 14.3 a 40.1 ± 17.6 c 29.2 ± 13.37 de
1.0 38.9 ± 8.97 c 49.4 ± 15.7b 24.0 ± 6.49 ef 16.0 ± 10.33 fg
1.5 35.20 ± 6.91 cd 43.7 ± 16.6 bc 20.1 ± 7.65 ef 14.2 ± 10.86fg
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf sama pada baris dan kolom yang sama tidak berbeda nyata
pada taraf 5%, uji jarak berganda Duncan
Remarks: Values followed by the same letter in the same row and column are not significantly
different at the 5% level, according to Duncan’s multiple-range test

A B

Gambar 3. Tunas yang dimultiplikasi pada media MS + thidiazuron 0,1 mg/L (A);
tunas yang dimultiplikasi pada media MS + BA 0,5 + thidiazuron
0,1 mg/L (B).
Figure 3. Shoot multiplication in medium of MS + thidiazuron 0.1 mg/L (A); MS +
BA 0.5 + thidiazuron 0.1 mg/L (B).

Copyright @ 2018, Media Akuakultur, p-ISSN 1907-6762; e-ISSN 2502-9460 79

Perbanyakan tanaman hias air Bacopa australis secara in vitro ..... (Rossa Yunita)

Pemberian zat pengatur tumbuh BA dan thidiazuron
secara bersamaan mampu meningkatkan kemampuan
tunas untuk bermultiplikasi daripada perlakuan BA atau
thidiazuron secara tunggal. Pada percobaan ini
pemberian BA dan thidiazuron yang optimum adalah
pada konsentrasi 0,5 mg/L BA dan 0,1 mg/L thidiazuron
di mana rata-rata tunas yang dihasilkan adalah 32,4
tunas sedangkan jumlah daun adalah 137,6 daun
(Gambar 3B) dan memberikan pengaruh yang berbeda
nyata dari perlakuan lainnya. Parameter jumlah cukup
penting untuk diamati karena dari ketiak daun dapat
muncul tunas sehingga dapat meningkatkan faktor
multiplikasi tunas. Hasil penelitian ini menunjukkan
bahwa formulasi media terbaik untuk multiplikasi tu-
nas adalah MS + 0,5 mg/L BA + 0,1 mg/L thidiazuron.
Pengunaan thidiazuron pada media kultur pada
konsentrasi relatif rendah lebih efektif bila
dikombinasi dengan BA, akan tetapi apa bila
konsentrasi BA dan thidiazuron relatif lebih tinggi
cenderung akan menurunkan kemampuan tunas untuk
bermultiplikasi. Hal ini juga terjadi pada tanaman yang
memiliki khasiat obat seperti Kigelia pinnata,
kemampuannya bermultiplikasi meningkat dengan
pemberian thidiazuron 0,5 ìm dan bila konsentrasi
terus ditingkatkan maka kemampuan tunas untuk
bermultiplikasi menjadi menurun (Thomas & Puthur,
2004). Hal ini karena sitokinin eksogen yang diberikan
dalam konsentrasi berlebih akan dapat meningkatkan
enzim sitokinin oksidase yang berperan memelihara
keseimbangan sitokinin dalam sel tanaman dengan
mengoksidasi kelebihan sitokinin bila tidak
diperlukan sehingga akan menghambat pertumbuhan
organ (Staden et al., 2008).
Induksi Perakaran
Memproduksi bibit memerlukan plantlet utuh yang
memiliki batang, daun, dan akar; untuk itu, diperlukan
formulasi yang tepat untuk induksi perakaran. Hasil
yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan bahwa
secara umum pemberian IBA dapat memicu
terbentuknya akar pada kultur in vitro. Hasil analisis
ANOVA menunjukkan bahwa perlakuan IBA
memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap
jumlah dan panjang akar. Perlakuan IBA yang terbaik
untuk induksi perakaran adalah pada konsentrasi 0,5
mg/L; di mana pada konsentrasi tersebut mampu
menghasilkan akar sebanyak 2,9 dan rataan panjang
akar 2,92 cm (Gambar 4 dan 5). IBA merupakan salah
satu zat pengatur tumbuh jenis auksin yang umum
digunakan untuk menginduksi perakaran tanaman
secara in vitro. Hasil penelitian Bohidar et al. (2008)
dengan menggunakan pelakuan IAA (Indole-3-acetic
acid), IBA dan NAA (Naphthaleneacetic acid) pada
konsentrasi 0,25-1 mg/L menunjukkan bahwa IBA
memberikan respons tercepat dalam menginduksi
panjang akar Ruta graveolens.
Peningkatan perlakuan konsentrasi IBA menjadi 1
mg/L menurunkan kemampun tunas untuk membentuk
akar; di samping itu, akar yang dihasilkan lebih pendek

3.5 Jumlah
Jumlahakar
akar(Number
(Numberofofroots)
roots)
2.9a 2.92a
3 Panjangakar
Panjang akar(Length
(Lengthofofroots)
roots)
2.5ab
2.5 2.2b
2.02b
1.82b
2

1.5

0.5

0
IBA-0 IBA-0.5 IBA-1
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf sama berbeda nyata pada taraf 5%, uji jarak
berganda Duncan
Remarks: Values followed by the same letter are not significantly different at the 5% level,
according to Duncan’s multiple-range test

Gambar 4. Pengaruh konsentrasi IBA terhadap jumlah dan panjang akar pada
eksplan Bacopa australis.
Figure 4. The influence of IBA concentration on the number and length of roots
on Bacopa australis explant.

80 Copyright @ 2018, Media Akuakultur, p-ISSN 1907-6762; e-ISSN 2502-9460


Gambar 5. Akar yang dihasilkan dari media MS + IBA 0,5 mg/L.
Figure 5. Root produced from MS + IBA medium 0.5 mg/L.
yaitu rata-rata jumlah akar yang dihasilkan adalah 2,2
akar dengan rata-rata panjang akar 2,02 cm.
Penambahan auksin pada konsentrasi yang optimal
pada media biakan dapat menginduksi pembentukan
akar lebih baik, akan tetapi apabila konsentrasi yang
diaplikasikan relatif tinggi cendrung akan menghambat
pembentukan dan pertumbuhan akar tersebut
(Srivastava, 2002; Davies, 2004). Aplikasi auksin
eksogen dalam konsentrasi tinggi pada media kultur
cenderung menstimulasi diferensiasi jaringan
pembuluh dengan lebih cepat, sehingga akan
meningkatkan jumlah dan ukuran jaringan.
KESIMPULAN
Formulasi media yang terbaik untuk induksi tunas
Bacopa australis secara in vitro adalah MS + BA 0,3 mg/
L. Formulasi media yang optimal untuk multiplikasi
tunas adalah MS + BA 0,5 mg/L + thidiazuron 0,1 mg/
L dan untuk induksi perakaran adalah MS + IBA 0,5
mg/L.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada Program Insentif Riset Inovasi
Nasional (Insinas) tahun 2017-2018, Kementerian Riset
Teknologi Dan Pendidikan Tinggi yang telah mendanai
penelitian ini, melalu program Insinas Kemitraan.
DAFTAR ACUAN
Bohidar, S., Thirunavookkasasu, M., & Ro, T.V. (2008).
Effect of plant growth regulators on in vitro
micropropagation of “Garden Rue” (Ruta graveolens
L.). International Journal of Integrative Biology, IJIB(3),
36-43.
Bank Indonesia. (2008). Pola pembiayaan usaha kecil
industri tanaman air. www.bi.go.id.
Chandran, C., Karthikeyan, K., & Kulothungan, S.
(2007). In vitro propagation of Withania somnifera
(L.) Dunal. from shoot tip and nodal explants.
Copyright @ 2018, Media Akuakultur, p-ISSN 1907-6762; e-ISSN 2502-9460
Media Akuakultur, 13 (2), 2018, 75-82
Journal of Scientific Transactions in Environment and
Technovation, 1(1), 15-18.
Davies, P.J. (2004). The plant hormones: Their nature,
occurrence, and functions. In Davies, P.J. (Ed.).
Plant hormones biosynthesis, signal transduction, ac-
tion!. London: Kluwer Academic Publisher, p. 1-
35.
Dharishini, M.P., Balasubramanian, K., & Radha, A.
(2014). In Vitro micropropagation of Bacopa
monnieri and detection of bacosides from second-
ary callus. Journal of Academia and Industrial Re-
search, 3(5), 233-235.
Guo, B., Abbasi, B.H., Zeb, A., Xu, L.L., & Wei, Y.H.,
(2011). Thiadiazuron: A multi-dimensional plant
growth regulator. Afr. J. Biotechnol., 10, 8984-9000.
Hartati, S., Triana, E., Yunus, A., & Susilowati, A.
(2014). kajian sitokinin benzilaminopurin (BAP)
terhadap organogenesis hasil persilangan
Dendrobium merbelianum dengan Dendrobium
liniale. El-Vivo, 2(2), 22-33.
http://tropica.com/fr/guide/r%C3%A9ussir-son-
aquarium/engrais-et-co2/. Acces 1 Maret 2017.
Kapil, S.S. & Sharma, V. (2014). In vitro propagation
of Bacopa Monneri: An important medicinal plant.
Int. J. Curr. Biotechnol., 2(1), 7-10.
Karyanti. (2017). Pengaruh beberapa jenis sitokinin
pada multiplikasi tunas anggrek Vanda douglas
secara in vitro. J. Bioteknol. Biosains Indonesia, 4(1),
36-42.
Khawar, K.M., Sevimay, C.S., & Yuzbasioglu, E. (2003).
Adventitious shoot regeneration from different
explant of wild lentil (Lens Culinaris Subsp.
Orientalis). University of Ankara, Ankara. Turkey.
Murashige, T. & Skoog, F. (1962). A revised for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiol. Plant, 15, 473-497.
Nugraha, M.F.I., Yunita, R., Lestari, E.G., & Ardi, I.
(2017). Pembentukan mother plant Bacopa austra-
81
Perbanyakan tanaman hias air Bacopa australis secara in vitro ..... (Rossa Yunita)
lis secara in vitro pada berbagai dosis zat pengatur
tumbuh dan media aklimatisasi. Media Akuakultur,
12(2), 85-94.
Pandiyan, P. & Selvaraj, T. (2012). In vitro multiplica-
tion of Bacopa monnieri (L.) Pennell from shoot
tip and nodal explants. Journal of Agricultural Tech-
nology, 8(3), 1099-1108.
Santos, C.V., Brito, G., Pinto, G., Fosiseca, M., &
Henrique. (2003). In vitro plantlet regeneration of
Olea eruopaea spp. maredenis. Scientia Hort., 97,
83-87.
Srivastava, L.M. (2002). Plant growth and develop-
ment, hormon and environment. London: Aca-
demic Press, 772 pp.
Staden, J., Van, E., Zazimalova, E., & George, E.F.
(2008). Plant growth regulator II: Cytokinin, their
analogues and antagonists. In George, E.F., Hall,
M.A., & de Klerk, G.J. (Eds.). Plant propagation by
tissue culture Vol. I. The background. Springer.
Dordrecht, p. 205-226.
Syahid, S.F. & Kristina, N.N. (2008). Multiplikasi tu-
nas, aklimatisasi dan analisis mutu simplisia daun
encok (Plumbago zeylanica L.) asal kultur in vitro
periode panjang. Bul. Littro., XIX(2), 117-128.
Thomas, T.D. & Puthur, J.T. (2004). Thidiazuron in-
duced high frequency shoot organogenesis in cal-
lus from Kigelia pinnata L. Bot. Bull. Acad. Sin., 45,
307-313.
82 Copyright @ 2018, Media Akuakultur, p-ISSN 1907-6762; e-ISSN 2502-9460
Thomas, T.D. & Shankar, S. (2009). Multiple shoot in-
duction and callus regeneration in Sarcostemma
brevistigma Wight & Arnott, a rare medicinal plant.
Plant Biotechnologi Report, 3(36), 7-12.
Tuhuteru, S., Hehanussa, M.L., & Raharjo, S.H.T.
(2012). Pertumbuhan dan perkembangan anggrek
Dendrobium anosmum pada media kultur in vitro
dengan beberapa konsentrasi air kelapa. Agrologia,
1, 1-12.
Vijayakumar, M., Vijayakumar, R., & Stephen, R. (2010).
In vitro propagation of Bacopa monnieri L. - a mul-
tipurpose medicinal plant. Indian Journal of Science
and Technology, 3(7), 781-786.
Yunita, R. & Lestari, E.G. (2008). Perbanyakan tanaman
Artemisia annua secara in vitro. Jurnal Agro Biogen,
4(1), 41-44.
Yunita, R. & Lestari, E.G. (2011). Perbanyakan tanaman
pulai pandak (Rauwolfia serpentina L.) dengan teknik
kultur jaringan. Jurnal Natur Indonesia, 14(1), 68-
72.
Yunita, R., Mariska, I., & Tumilisar, C. (2012).
Perbanyakan tanaman jambu mete (Anacardium
occidentale L.) melalui jalur organogenesis. Jurnal
Agro Biogen, 8(3), 113-119.
Zulkarnain. (2011). Kultur jaringan tanaman, solusi
perbanyakan tanaman budi daya. Jakarta: PT Bumi
Aksara, 272 hlm.
 Isolasi Dan Kultur Protoplas Mesofil Daun Dari Beberapa Genotip Ubi Kayu

(Manihot esculenta Crantz)

Bibit ubi kayu dengan sifat unggul yaitu produktivitas tinggi, kaya nutrisi, tahan
terhadap cekaman abiotik (terutama kekeringan) dan cekaman biotik (hama dan
penyakit), serta umbi dengan daya simpan lama atau tahan terhadap pembusukan
yang dikenal dengan istilah PPD (postharvest physiological deterioration) sangat
dibutuhkan oleh petani atau penggiat ubi kayu. Bibit ubi kayu dengat sifat unggul dapat
diperoleh melalui teknik fusi protoplas. Teknik fusi protoplas merupakan salah satu
metode yang digunakan pada perakitan tanaman untuk mendapatkan sifat unggul
yang diinginkan. Metode fusi protoplas atau hibridisasi somatik merupakan salah satu
metode yang dapat mengatasi permasalahan dalam pemuliaan tanaman dengan sifat
unggul yang disandi oleh banyak gen (Milliam et al., 1995). Menurut Suryowinoto
(1996), isolasi protoplas adalah teknik untuk menghasilkan protoplas yang utuh dan
viable dari jaringan tanaman hidup dengan cara menghilangkan dinding selnya.
Teknik ini merupakan tahap awal dari beberapa tahapan dalam melakukan fusi
protoplas atau hibridisasi somatik untuk merakit bibit unggul (Suryowinoto, 1989;
Kanchanapoom et al., 2001). Kultur protoplas telah dimanfaatkan untuk memanipulasi
genetik tanaman melalui fusi protoplas, transformasi protoplas dan variasi
somaklonal/protoklonal pada tingkat protoplas.

Material tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur ubi kayu
genotip Mentega 2, Gajah dan Ubi Kuning yang merupakan koleksi Pusat Penelitian
Bioteknologi LIPI. Larutan enzim yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari empat
variasi, yaitu kombinasi dari enzim selulase, maserozim dan pektoliase. Keempat
kombinasi larutan enzim tersebut disterilisasi dengan filter syringe (Millipore)
berukuran 0,22 µM (Gorsser et al., 2010). Media dasar yang digunakan untuk kultur
protoplas ubi kayu adalah media 0,4 M BH3 (Grosser et al., 2010) yang telah
dimodifikasi.

Penelitian ini terdiri atas tiga tahapan kegiatan yaitu: (1) isolasi protoplas, (2)
purifikasi protoplas, (3) kultur protoplas, (4) pengolahan data.

Media dasar yang digunakan adalah media dasar MS dengan penambahan

vitamin KM (Kao & Michayluk, 1975), bahan organik KM serta diperkaya dengan zat
pengatur tumbuh (ZPT), 2 mg/L BAP, 1 mg/L IAA, 2 µM CuSO4, 2% sukrosa dengan
variasi agar Phytagel 0,5% (M1) dan 1% (M2). Kedua media tersebut diatur hingga
memiliki osmolaritas 0,4 M dan pH 5,8. Media disterilisasi dengan filter ukuran 0,22
µM. Masing-masing medium (M1 dan M2) diambil dengan mikropipet dan
dicampurkan dengan larutan protoplas hasil purifikasi. Kultur protoplas disimpan pada
cawan petri plastik steril (Corning® ) ukuran 60 mm x 15 mm dan diinkubasi pada
keadaan gelap dengan suhu 25 oC.

Setelah protoplas genotip Mentega 2, Ubi Kuning dan Gajah diinkubasi tanpa
pencahayaan di ruang dengan suhu 25±2 oC selama 4 minggu pada larutan 0,4 M
BH3 dengan perbandingan 1:1 antara komposisi protoplas dan larutan BH3, protoplas
menunjukkan pertumbuhan dan mengalami proses mitosis beragregasi (Gambar 3A-
B) sehingga terdapat penambahan jumlah protoplas. Protoplas dari mesofil daun ubi
kayu Mentega 2 tidak berkembang, kemungkinan dikarenakan viabilitas protoplas
rendah atau mengalami lisis selama masa inkubasi pada media kultur. Media semi
padat perlakuan M2 yaitu media MS yang mengandung 2 µM CuSO4, 2 mg/L BAP, 1
mg/L NAA dan larutan 0,4 M BH3 serta pemadat Phytagel 1% mampu membentuk
koloni protoplas menjadi bentuk mikrokalus yang kompak padat berwarna putih seperti
kapas (Tabel 3; Gambar 3C). Mikrokalus genotip Gajah berkembang menjadi kalus
berwarna kuning dan membentuk nodul-nodul pada media kultur semipadat (Gambar
4A). Mikrokalus dari protoplas ubi kayu genotip Gajah mengalami perkembangan
mulai dari bentuk seperti selaput putih hingga adanya bentuk yang menyerupai
nodulnodul berwarna kuning bening pada 8 HST (hari setelah tanam) dan jumlah
nodulnodul ini semakin bertambah pada 10 minggu setelah tanam (MST). Mikrokalus
genotip Ubi Kuning yang terbentuk di media kultur protoplas semipadat masih tetap
berbentuk mikro kalus dan bersih dari kontaminan.

Protoplas utuh dari mesofil ubi kayu genotip Mentega 2, Ubi Kuning dan Gajah
telah diisolasi menggunakan larutan enzim dengan komposisi 2% selulase, 1%
maserozim dan 0,1% pektoliase menghasilkan protoplas berkisar antara 0,197-0,6 x
106 protoplas/mL. Protoplas dapat tumbuh membentuk mikrokalus pada media
semipadat MS mengandung 2 µM CuSO4, 2 mg/L BAP, 1 mg/L IAA, 2% sukrosa dan
pemadat 1% Phytagel. Mikrokalus selanjutnya dapat berkembang menjadi kalus pada
delapan media perlakuan yang terdiri dari empat media padat dan empat media cair
yaitu media Gresshoff and Doy (GD); MS dan GD masing-masing dengan konsentrasi
setengah; MS dengan penambahan 2,4-D (0,1 dan 0,5 mg/L) dan BAP 2 mg/L.
Kedelapan media pertumbuhan kalus dapat membuat mikrokalus tumbuh dan
berkembang secara kuantitas dan ukuran menjadi nodul-nodul menyerupai kalus.
Mikrokalus tumbuh lebih cepat pada media padat dibandingkan pada media cair.
Media perlakuan P4 yang mengandung media dasar MS dengan penambahan 1,0
mg/L 2,4-D dan 2,0 mg/L BAP menunjukkan pertumbuhan kalus yang lebih baik
dimana kalus yang diperoleh terlihat berukuran lebih besar dibanding media lainnya.
Perkembangan pembentukan mikrokalus yang berasal dari mesofil daun ubi kayu ke
tahap selanjutnya merupakan suatu kemajuan yang sangat penting bagi penelitian
protoplas ubi kayu terutama genotip lokal Indonesia.
 Isolasi dan Kultur Protoplas Mesofil…… (H. Fitriani, dkk.)

ISOLASI DAN KULTUR PROTOPLAS MESOFIL DAUN DARI

BEBERAPA GENOTIP UBI KAYU (Manihot esculenta Crantz)
(Isolation and Protoplas Culture of Leaf Mesophyll from Some Genotypes of
Cassava (Manihot Esculenta Crantz))

Hani Fitriani, Nurhamidar Rahman, Siti Kurniawati, Pramesti Dwi

Aryaningrum dan N. Sri Hartati
Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Jl. Raya Bogor KM 46, Cibinong 16911, Bogor, Indonesia
e-mail: hfitriani76@yahoo.com
Naskah diterima 29 Agustus 2018, revisi akhir 12 November 2018, setuju diterbitkan 15 Februari 2019

ABSTRAK. Bibit ubi kayu unggul sangat dibutuhkan oleh petani atau penggiat ubi
kayu dan dapat diperoleh melalui teknik fusi protoplas. Penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan protoplas dari mesofil daun tiga jenis ubi kayu yaitu Gajah, Mentega 2
dan Ubi Kuning koleksi in vitro dengan perlakuan komposisi enzim selulase, maserozim
dan pektoliase serta media kultur protoplas. Isolasi protoplas dilakukan dengan
menginkubasi daun ubi kayu in vitro dari genotip Mentega 2, Ubi Kuning dan Gajah
pada media cair yang terdiri dari beberapa campuran enzim. Protoplas berhasil
diperoleh dari ketiga genotip ubi kayu setelah inkubasi pra-plasmolisis sel pada larutan
campuran enzim perlakuan LE3 yaitu 0,4 M manitol, 2% selulase, 1% maserozim dan
0,1% pektoliase selama 18 jam. Protoplas berhasil membentuk mikrokalus pada media
semi padat Murashige & Skoog (MS) dengan penambahan vitamin Kao & Michayluk
(KM) dan bahan organik KM serta diperkaya dengan 2 µM CuSO4, 2 mg/L BAP, 1
mg/L IAA, 2% sukrosa dengan variasi agar Phytagel 0,5% (M1) dan 1% (M2).
Pembentukan kalus dari mikrokalus terjadi pada semua media perlakuan. Secara
keseluruhan, perlakuan terbaik ditunjukkan pada media P4, yaitu media MS yang
mengandung 1,0 mg/L 2,4-D dan 2 mg/L BAP, dimana kalus yang diperoleh berukuran
lebih besar dibanding media lainnya.
Kata kunci: mikrokalus, protoplas, selulase, ubi kayu

ABSTRACT. Superior cassava seedlings can be obtained through protoplast fusion

techniques. This study aimed to obtain protoplasts from leaf mesophyll of three types of
cassava namely Mentega 2, Ubi Kuning and Gajah. Protoplast was successfully
obtained from three cassava genotypes after incubation of pre-plasmolysis cells in a
mixture of LE3 treatment enzymes, i.e 0.4 M mannitol, 2% cellulase, 1% maserozyme
and 0.1% pectoliase for 18 hours. Protoplast succeeded in forming microcaluses in
Murashige & Skoog (MS) semi-solid media with the addition of vitamin Kao &
Michayluk (KM) and KM organic matter and enriched with 2 µM CuSO4, 2 mg/L BAP,
1 mg/L IAA, 2% sucrose with Phytagel agar variations were 0.5% (M1) and 1% (M2).
Callus from microcalus occurred in all treatment media. The best treatment was shown
on P4 media, namely MS media containing 1.0 mg/L 2,4-D and 2 mg/L BAP, where the
callus obtained was larger than other media.
Keywords: cassava, cellulase, microcalus, protoplast

1. PENDAHULUAN lama atau tahan terhadap pembusukan

Bibit ubi kayu dengan sifat unggul
yaitu produktivitas tinggi, kaya nutrisi,
tahan terhadap cekaman abiotik (terutama
kekeringan) dan cekaman biotik (hama dan
penyakit), serta umbi dengan daya simpan
yang dikenal dengan istilah PPD
(postharvest physiological deterioration)
sangat dibutuhkan oleh petani atau
penggiat ubi kayu. Bibit ubi kayu dengat
sifat unggul dapat diperoleh melalui teknik

1
BIOPROPAL INDUSTRI Vol.10 No.1, Juni 2019 : 1-13
: 1-13
fusi protoplas. Teknik fusi protoplas
merupakan salah satu metode yang
digunakan pada perakitan tanaman untuk
mendapatkan sifat unggul yang diinginkan.
Metode fusi protoplas atau hibridisasi
somatik merupakan salah satu metode
yang dapat mengatasi permasalahan dalam
pemuliaan tanaman dengan sifat unggul
yang disandi oleh banyak gen (Milliam et
al., 1995).
Mariska & Husni (2006)
melaporkan bahwa beberapa hasil
penelitian dengan fusi protoplas telah
berhasil meningkatkan keragaman genetik
tanaman, produktivitas, perbaikan sifat
ketahanan terhadap hama, penyakit dan
nematoda, serta perbaikan sifat-sifat
kualitatif seperti kandungan minyak yang
tinggi. Teknik ini diperlukan dalam
pemuliaan tanaman untuk menyeleksi dan
merakit varietas hibrida secara lebih cepat.
Kemajuan pesat dalam penelitian produksi
hibrida somatik dan sibrida dalam transfer
DNA tidak terlepas dari keberhasilan
teknik isolasi, kultur dan regenerasi
protoplas menjadi tanaman (Riyadi, 2010).
Protoplas dapat diisolasi dari hampir
semua bagian tanaman seperti akar, daun,
nodul akar, koleoptil, kultur kalus dan
mesofil daun asal tanaman in-vitro (Husni
et al., 2003). Mesofil daun tanaman yang
dikulturkan secara in-vitro paling banyak
digunakan sebagai sumber protoplas
karena kondisi fisiologis daun tanaman
dari kultur in-vitro lebih konstan
dibandingkan daun tanaman di rumah
kaca. Jaringan mesofil pada daun
merupakan jaringan yang paling mudah
diisolasi karena sel-selnya tersusun secara
renggang sehingga enzim-enzim mudah
mencapai dinding sel. Selain itu,
keseragaman daun in-vitro yang lebih
tinggi dan dapat tersedia setiap saat serta
produksi protoplas yang dihasilkan lebih
tinggi jika menggunakan mesofil daun
Musa sp. (Khatri et al., 2010);
Dendrobium crumenatum (Tee et al.,
2010); dan Brachypodium distachyon
(Hong et al., 2012) sebagai sumber
protoplas. Isolasi protoplas dari mesofil ubi
kayu kultivar Mexico No. 35 juga telah
dilakukan dan dilaporkan berhasil
membentuk tunas namun belum
2
mendapatkan kondisi morfogenesis in-
vitro yang efisien (Shahin & Shepard,
1980).
Menurut Suryowinoto (1996),
isolasi protoplas adalah teknik untuk
menghasilkan protoplas yang utuh dan
viable dari jaringan tanaman hidup dengan
cara menghilangkan dinding selnya.
Teknik ini merupakan tahap awal dari
beberapa tahapan dalam melakukan fusi
protoplas atau hibridisasi somatik untuk
merakit bibit unggul (Suryowinoto, 1989;
Kanchanapoom et al., 2001). Kultur
protoplas telah dimanfaatkan untuk
memanipulasi genetik tanaman melalui
fusi protoplas, transformasi protoplas dan
variasi somaklonal/protoklonal pada
tingkat protoplas.
Faktor penentu keberhasilan dalam
prosedur isolasi protoplas tanaman adalah
proses penghilangan atau pelisisan dinding
sel dan mendapatkan protoplas yang utuh.
Dinding sel yang masih muda biasanya
tersusun dari zat pektin dan selulosa,
sehingga untuk melisiskan zat penyusun
dinding sel tersebut diperlukan zat yang
dapat menghancurkan atau melarutkannya.
Penghilangan dinding sel dapat dilakukan
secara mekanis maupun enzimatis (Tomar
& Dantu, 2010). Secara enzimatis, jenis
dan konsentrasi enzim yang digunakan
sangat mempengaruhi perolehan protoplas
(Riyadi, 2006). Umumnya, untuk
melisiskan zat penyusun dinding sel pada
teknik isolasi protoplas dilakukan secara
enzimatis dengan jenis dan konsentrasi
enzim yang digunakan bervariasi.
Beberapa jenis enzim yang biasa
digunakan adalah selulase R-10, pektoliase
Y-23, hemiselulose dan maserozim. Sejak
ditemukan oleh Cocking pada tahun 1960,
isolasi protoplas secara enzimatik hampir
selalu digunakan untuk setiap jenis
tanaman sampai sekarang. Pemakaian
enzim pektoliase dan selulase telah
berhasil dilakukan untuk mengisolasi
protoplas tanaman Solanum sp. (Tan,
1987), Dendrobium pompadoum
(Kanchanapoom et al., 2001), Arabidopsis
thaliana (Sheen, 2002) dan Panicum
virgatum L. (Mazarei et al., 2008).
Populasi protoplas yang dihasilkan melalui
teknik ini memiliki kerapatan yang tinggi
 Isolasi dan Kultur Protoplas Mesofil…… (H. Fitriani, dkk.)
(2,5 x 106 protoplas/gram jaringan daun).
Isolasi protoplas jenis tanaman asal
Indonesia telah berhasil dilakukan
diantaranya anggrek (Utami & Hariyanto,
2015), kacang panjang dan kecipir (Riyadi,
2006; 2010), kentang (Purwito, dkk.,
1999), talas (Martin dkk., 2015), pegagan
(Prihastanti dkk., 2001) dan padi
(Sukmadjaja dkk., 2007).
Isolasi dan kultur protoplas jenis ubi
kayu lokal Indonesia sampai saat ini belum
ada dilaporkan, sehingga optimasi metode
isolasi dan regenerasi protoplas ubi kayu
sangat penting untuk dilakukan. Penelitian
ini bertujuan untuk mendapatkan protoplas
dari mesofil daun tiga jenis ubi kayu yaitu
Gajah, Mentega 2 dan Ubi Kuning koleksi
in-vitro dengan perlakuan komposisi enzim
selulase, maserozim dan pektoliase serta
media kultur protoplas. Metode isolasi
protoplas mesofil yang diperoleh dari
penelitian ini diharapkan dapat digunakan
untuk penelitian lebih lanjut yaitu fusi
protoplas antara ketiga jenis ubi kayu
tersebut.
2. METODE PENELITIAN
Jenis ubi kayu yang digunakan
dipilih berdasarkan keunggulan-
keunggulan karakteristik genetik yang
diperoleh dari hasil penelitian sebelumnya
yaitu seleksi kandidat ubi kayu unggul
yang terdapat di Kebun Plasma Nutfah ubi
kayu Puslit Bioteknologi LIPI. Tahap awal
penelitian adalah memilih enzim yang
paling sesuai untuk melisis sel ubi kayu,
serta media kultur yang tepat pada isolasi
dan kultur protoplas ubi kayu di
laboratorium.
A B
Gambar 1. Tanaman kultur in vitro ubi kayu sebagai sumber eksplan untuk isolasi protoplas; A. Ubi
Kuning, B. Mentega 2 dan C. Gajah
Eksplan Sebagai Sumber Protoplas
Material tanaman yang digunakan
dalam penelitian ini adalah kultur ubi kayu
genotip Mentega 2, Gajah dan Ubi Kuning
yang merupakan koleksi Pusat Penelitian
Bioteknologi LIPI (Gambar 1). Ketiga
genotip ubi kayu tersebut memiliki
keunggulan yaitu kaya kandungan beta
karoten (Mentega 2 dan Ubi Kuning) serta
daya hasil tinggi (genotip Gajah). Kultur
ubi kayu pada media MS (Murashige &
Skoog, 1962) tanpa hormon atau MS-0
yang mengandung 40 g/L sukrosa dan 8
g/L pemadat dipelihara hingga menjadi
plantlet yang memiliki daun lengkap dan
siap digunakan sebagai bahan isolasi
protoplas. Kultur diinkubasi di ruang
kultur pada temperatur 25-27 oC dengan
penyinaran 1000 lux selama 24 jam.
Plantlet berumur 1-1,5 bulan sementara
daunnya digunakan sebagai sumber
protoplas.
Larutan Enzim dan Media Kultur
Protoplas
Larutan enzim yang digunakan pada
penelitian ini terdiri dari empat variasi,
yaitu kombinasi dari enzim selulase,
maserozim dan pektoliase (Tabel 1).
Keempat kombinasi larutan enzim tersebut
disterilisasi dengan filter syringe
(Millipore) berukuran 0,22 µM (Gorsser et
al., 2010). Media dasar yang digunakan
untuk kultur protoplas ubi kayu adalah
media 0,4 M BH3 (Grosser et al., 2010)
yang telah dimodifikasi.
C
3
BIOPROPAL INDUSTRI Vol.10 No.1, Juni 2019 : 1-13
: 1-13

Tabel 1. Komposisi larutan enzim sebagai perlakuan

Jenis Bahan LE1 LE2 LE3 LE4
Sellulase Onozuka RS (Phytotech) 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g
Macerozyme R-10 (Phytotech) 0,8 g 0,8 g 0,4 g 0,4 g
Pectolyase y-23 (Phytotech) - 0,04 g 0,04 g 0,08 g
Mannitol 0,5 M 0,5 M 0,5 M 0,5 M
NaH2PO4 37 mM 37 mM 37 mM 37 mM
CaCl2.2H2O 1M 1M 1M 1M
MES 0,246 M 0,246 M 0,246 M 0,246 M
Aquadestilata 40 mL 40 mL 40 mL 40 mL
pH 5,6 5,6 5,6 5,6

Isolasi Protoplas hati-hati agar homogen kemudian

Mesofil daun ubi kayu diambil dari
koleksi kultur in-vitro (plantlet) dan
disayat hingga kecil dengan jarak irisan
0,1-0,3 cm. Daun ubi kayu dengan total
ukuran ± 100 cm2 yang telah diiris-iris lalu
dimasukkan ke dalam erlenmeyer
berukuran 100 mL yang berisi 12 mL
campuran larutan enzim dan media BH3
dengan perbandingan 1:1 (Grosser et al.,
2010). Campuran diinkubasi selama 18
jam di ruang gelap pada suhu 28 oC dan
dikocok dengan kecepatan 50 rpm untuk
membantu agar protoplas terlepas selama
tahap inkubasi.
Purifikasi Protoplas
Protoplas hasil isolasi selanjutnya
dipurifikasi pada gradien sukrosa/manitol
(Grosser et al., 2010). Setelah inkubasi,
campuran dilewatkan pada filter nilon
berukuran 100 µM untuk menyaring debris
atau sisa jaringan hasil inkubasi dan
ditempatkan pada tabung erlenmeyer 25
mL. Campuran protoplas selanjutnya
kembali disaring dengan filter nilon
CellTrics® (Partec) berukuran 30 µM
untuk menyeragamkan ukuran protoplas
dan disimpan pada tabung sentrifus
Corning® ukuran 15 mL. Campuran
kemudian disentrifugasi pada kecepatan
600 rpm selama 6 menit hingga
membentuk pelet. Supernatan selanjutnya
dibuang dan protoplas diresuspensi dengan
7 mL larutan 25% sukrosa dengan
penambahan nutrien CPW (Frearson et al.,
1973). Larutan CPW terdiri dari 27,2 mg/L
KH2PO4; 100 mg/L KNO3; 150 mg/L
CaCl2; 250 mg/L MgSO4; 0,16 mg/L KI;
dan 0,00025 mg/L CuSO4 (pH 5,8). Setelah
itu, campuran protoplas dipipet dengan
ditambahkan 2 mL larutan 13% manitol
dengan nutrien CPW ke atas larutan
sukrosa. Pada tahapan ini, kedua larutan
diusahakan agar tidak bercampur satu
dengan lainnya, sehingga terbentuk dua
fase larutan pada tabung. Larutan
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
600 rpm selama 5 menit.
Protoplas yang viable membentuk
fase diantara larutan sukrosa dan larutan
manitol. Protoplas pada fase antara
tersebut diambil dengan cara dipipet
menggunakan pipet pasteur dan
dimasukkan ke dalam larutan pemurnian
0,4 M BH3 sebanyak 10 kali ukuran pelet
(Khentry et al., 2006) kemudian
kerapatannya diukur menggunakan
hemositometer.
Pada pengukuran kerapatan,
protoplas diambil menggunakan
mikropipet kemudian diletakkan di atas
hemositometer dan ditutup dengan gelas
penutup. Jumlah protoplas dihitung di
bawah mikroskop inverted pada
pembesaran 10×10 (Tee et al., 2010).
Densitas protoplas ditentukan dengan
menggunakan Persamaan 1 (Marienfield
laboratory glassware, Germany) yang
mana S = jumlah protoplas, X = rata-rata
jumlah protoplas dari bilik yang diamati, L
= 1 mm2 (luas haemocytometer 1 mm2/25
bilik hitung × 25 bilik yang dihitung), t =
0,1 mm (tinggi haemocytometer), P =
pengenceran dan 103 = konstanta
perubahan dari mm3 menjadi mL.
X
S ………….…………… (1)
L tP

4
 Isolasi dan Kultur Protoplas Mesofil…… (H. Fitriani, dkk.)
Kultur Protoplas
Media dasar yang digunakan adalah
media dasar MS dengan penambahan
vitamin KM (Kao & Michayluk, 1975),
bahan organik KM serta diperkaya dengan
zat pengatur tumbuh (ZPT), 2 mg/L BAP,
1 mg/L IAA, 2 µM CuSO4, 2% sukrosa
dengan variasi agar Phytagel 0,5% (M1)
dan 1% (M2). Kedua media tersebut diatur
hingga memiliki osmolaritas 0,4 M dan pH
5,8. Media disterilisasi dengan filter
ukuran 0,22 µM. Masing-masing medium
(M1 dan M2) diambil dengan mikropipet
dan dicampurkan dengan larutan protoplas
hasil purifikasi. Kultur protoplas disimpan
pada cawan petri plastik steril (Corning®)
ukuran 60 mm x 15 mm dan diinkubasi
pada keadaan gelap dengan suhu 25 oC.
Pengolahan Data
Data hasil isolasi, purifikasi dan
kultur protoplas dianalisis dengan
membandingkan jumlah dan kondisi
protoplas yang berhasil diisolasi dan
dikultur untuk mengetahui komposisi
larutan enzim dan media kultur protoplas
yang paling tepat.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Purifikasi Protoplas
Protoplas telah berhasil diisolasi dari
jaringan mesofil daun ubi kayu genotip
Gajah dan Ubi Kuning menggunakan
campuran larutan enzim pada perlakuan
LE3, sedangkan perlakuan lainnya (LE1,
LE2 dan LE4) sebagian besar belum
mampu menghasilkan protoplas utuh
(viable). Protoplas ubi kayu genotip
Mentega 2 pada keempat perlakuan
inkubasi larutan enzim banyak mengalami
plasmolisis dan hanya sebagian kecil
protoplas utuh yang berhasil diisolasi
sehingga kerapatan protoplas tidak
terhitung karena protoplas tidak terdeteksi
di hemositometer. Perlakuan LE3 dengan
komposisi 2% selulase, 1% maserozim dan
0,1% pektoliase dapat digunakan untuk
melisiskan dinding sel mesofil daun ubi
kayu dari genotip Gajah dan Ubi Kuning
meskipun pada sebagian kecil masih
terdapat protoplas yang mengalami
plasmolisis sedangkan mesofil Mentega 2
memerlukan komposisi larutan enzim yang
lain untuk melisiskan mesofil daunnya.
Pektin dan selulosa merupakan
komponen penyusun dinding sel mesofil
daun muda. Oleh karena itu, enzim yang
paling cocok digunakan untuk melisiskan
dinding sel mesofil daun ubi kayu dari tiga
genotip ubi kayu yang digunakan adalah
pektinase atau maserozim dan selulase.
Enzim pektinase atau maserozim berfungsi
untuk menghancurkan lamela tengah yang
tersusun dan zat pektin, sehingga sel satu
dengan sel lainnya terpisah (Riyadi, 2006).
Perlakuan LE3 dengan penambahan
0,4 M BH3 (menggunakan manitol sebagai
senyawa osmotikum) menghasilkan
kerapatan protoplas yang berbeda pada dua
genotip ubi kayu. Kerapatan protoplas
tertinggi pada Gajah sekitar 0,6 x 106
protoplas/gram berat bersih mesofil (Tabel
2). Kerapatan yang diperoleh masih lebih
sedikit jika dibandingkan hasil isolasi Wu
et al. (2017) terhadap mesofil ubi kayu
SC8 asal China Selatan dengan
menggunakan komposisi enzim selulase
1,6% dan maserozim 0,8% tanpa
pektoliase yang memperoleh protoplas
dengan kerapatan tinggi yaitu mencapai
4,4 x 107 protoplas/gram berat bersih
mesofil dengan viabilitas sekitar 92,6%.
Demikian pula hasil penelitian yang
dilaporkan oleh Shahin & Shepard (1980)
menggunakan komposisi larutan enzim
selulase 1% dan maserozim 0,5% tanpa
pektoliase berhasil melisiskan dinding sel
mesofil daun ubi kayu Mexico No. 35 dan
CMC 76 milik CIAT yang diperoleh
kerapatan protoplas relatif tinggi yaitu
sekitar 5,6 x 106 protoplas/gram berat
bersih mesofil ubi kayu.
Hasil penelitian ini menunjukkan
bahwa jenis dan komposisi enzim berperan
penting untuk melisiskan mesofil daun ubi
kayu dari ketiga genotip yang diujikan. Hal
ini mengindikasikan bahwa keberhasilan
isolasi protoplas dipengaruhi antara lain
komposisi enzim (jenis dan konsentrasi),
kondisi jaringan dan genotip dari tanaman.
Komposisi perlakuan enzim LE3 dengan
penambahan 0,4 M BH3 pada proses
purifikasi menghasilkan fase lapisan
protoplas murni berwarna hijau
membentuk pita yang terpisah diantara dua
5
BIOPROPAL INDUSTRI Vol.10 No.1, Juni 2019: 1-13
: 1-13

larutan sukrosa dan Mannitol setelah yang diuji yaitu Mentega 2, Gajah dan Ubi
disentrifugasi pada ketiga genotip ubi kayu Kuning.

Tabel 2. Kerapatan (densitas) protoplas asal jaringan mesofil daun ubi kayu genotip Gajah dan Ubi
Kuning pada empat perlakuan komposisi enzim
Komposisi enzim
Jenis ubi kayu
LE1 LE2 LE3 LE4
Gajah 6
0 0 0,6 x 10 protoplas/mL 0
Ubi Kuning 0 0 0,197 x 106 protoplas/mL 0
Mentega 2 0 0 0 0
Ket.: LE1 = selulase 2% RS (w/v), pektoliase 0% (w/v), maserozim 2% (w/v);
LE2 = selulase 2% RS (w/v), pektoliase 0,1% (w/v), maserozim 2% (w/v);
LE3 = selulase 2% RS (w/v), pektoliase 0,1% (w/v), maserozim 1% (w/v);
LE4 = selulase 2% RS (w/v), pektoliase 1% (w/v), maserozim 0.2% (w/v).

A B

C D

Gambar 2. Protoplas dari mesofil daun ubi kayu genotip Gajah (A) dan Ubi Kuning (B) sebelum
proses pemurnian dan genotip; Gajah (C) dan Ubi Kuning (D) setelah proses pemurnian
(Perbesaran 40x)

6
 Isolasi dan Kultur Protoplas Mesofil…… (H. Fitriani, dkk.)

Berdasarkan hasil pengamatan Protoplas disebut viable apabila ukuran

mikroskopis terhadap protoplas hasil
isolasi dari ketiga genotip ubi kayu, terlihat
bahwa protoplas yang terisolasi umumnya
berbentuk intact atau bulat, utuh dan viable
dengan membran plasma yang tipis,
transparan dan berbentuk cincin sehingga
organela atau bagian dalam sel terlihat
jelas. Hal ini menunjukkan bahwa sel-sel
telah kehilangan dinding selnya. Organel
yang terlihat paling jelas adalah klorofil
yang menampakkan butiran warna hijau
dengan jumlah relatif banyak dan
berukuran relatif besar (Gambar 2C). Oleh
karena itu, klorofil dapat dijadikan sebagai
marker atau penanda dalam identifikasi
penghitungan rendemen protoplas hasil
isolasi (Patnaik & Cocking, 1982 dan
Suryowinoto, 1989).
Proses selanjutnya setelah isolasi
protoplas adalah purifikasi. Purifikasi
diperlukan untuk mendapatkan protoplas
yang viable tanpa adanya sisa jaringan
setelah isolasi dilakukan di tahap awal.
protoplasnya seragam dan bentuknya bulat
sempurna serta tidak mengalami
plasmolisis atau pecah karena over
digestion (Gambar 2D). Tahapan purifikasi
dalam penelitian ini menggunakan larutan
sukrosa 25% dan manitol 13% (Grosser et
al., 2010).
Kultur Protoplas
Setelah protoplas genotip Mentega
2, Ubi Kuning dan Gajah diinkubasi tanpa
pencahayaan di ruang dengan suhu 25±2
o
C selama 4 minggu pada larutan 0,4 M
BH3 dengan perbandingan 1:1 antara
komposisi protoplas dan larutan BH3,
protoplas menunjukkan pertumbuhan dan
mengalami proses mitosis beragregasi
(Gambar 3A-B) sehingga terdapat
penambahan jumlah protoplas. Sementara
itu, protoplas dari Mentega 2 tidak
berkembang sehingga tidak dilanjutkan ke
tahap selanjutnya.

A B

C D

Gambar 3. Agregasi koloni protoplas pada media semi solid M2 umur 4 minggu setelah tanam
(MST) (A-B) dan pertambahan ukuran mikrokalus ubi kayu genotip Ubi Kuning hingga
18 minggu setelah tanam (MST) (C-D) (perbesaran 20x)

7
BIOPROPAL INDUSTRI Vol.10 No.1, Juni 2019 : 1-13
: 1-13

Protoplas dari mesofil daun ubi kayu
Mentega 2 tidak berkembang,
kemungkinan dikarenakan viabilitas
protoplas rendah atau mengalami lisis
selama masa inkubasi pada media kultur.
Masa inkubasi yang lama dapat
menyebabkan terjadinya kerusakan pada
membran protoplas. Ling et al. (2009)
menyatakan bahwa waktu inkubasi
merupakan faktor yang menentukan
keberhasilan isolasi protoplas. Viabilitas
protoplas mengalami penurunan seiring
dengan semakin lamanya waktu inkubasi.
Hasil yang sama pada isolasi protoplas dari
Lotus corniculatus untuk perlakuan waktu
inkubasi 8 jam menunjukkan penurunan
protoplas viable dibanding waktu inkubasi
6 jam (Raiker et al., 2008).
Berdasarkan Hendaryono & Gajah mengalami perkembangan mulai
Wijayani (1994), medium pertumbuhan
protoplas yang mengandung BH3 tanpa
adanya penambahan ZPT menyebabkan
protoplas tidak tumbuh sama sekali.
Pengaruh ZPT terutama akusin terhadap
pertumbuhan protoplas menunjukkan
adanya indikasi tekanan osmotik,
meningkatkan sintesa protein,
meningkatkan permeabilitas sel terhadap
air dan melunakkan dinding sel yang
diikuti dengan menurunnya tekanan pada
dinding sel sehingga air dapat masuk ke
dalam sel dan meningkatkan volume sel.
Mikro koloni protoplas Ubi Kuning
dan Gajah berubah bentuk menjadi
mikrokalus pada media kultur semi padat
perlakuan M2 pada hari ke-4 (Ubi Kuning)
dan minggu ke-6 (Gajah). Media semi
padat perlakuan M2 yaitu media MS yang
mengandung 2 µM CuSO4, 2 mg/L BAP, 1
mg/L NAA dan larutan 0,4 M BH3 serta
pemadat Phytagel 1% mampu membentuk
koloni protoplas menjadi bentuk
mikrokalus yang kompak padat berwarna
putih seperti kapas (Tabel 3; Gambar 3C).
Mikrokalus semakin menunjukkan
pertumbuhan yang baik hingga 18 MST
dan mengalami penambahan ukuran
(Gambar 3D).
Waktu pertumbuhan dan
perkembangan mikrokalus pada dua
genotip ubi kayu yang diuji menunjukkan
perbedaan. Respon genotip sangat
berpengaruh terhadap media tumbuh yang
digunakan. Mikrokalus genotip Gajah
berkembang menjadi kalus berwarna
kuning dan membentuk nodul-nodul pada
media kultur semipadat (Gambar 4A).
Mikrokalus dari protoplas ubi kayu genotip
dari bentuk seperti selaput putih hingga
adanya bentuk yang menyerupai nodul-
nodul berwarna kuning bening pada 8 HST
(hari setelah tanam) dan jumlah nodul-
nodul ini semakin bertambah pada 10
minggu setelah tanam (MST). Nodul kalus
hanya mengalami proliferasi yang semakin
bertambah namun tidak mengalami
perkembangan bentuk yang mengarah ke
organogenesis tunas hingga 12 MST
(Gambar 4B). Pengamatan pertumbuhan
mikrokalus yang semakin membesar pada
genotip Gajah hanya dapat dilakukan
hingga 20 MST (Gambar 4C). Pada 28
MST, kalus dari genotip Gajah yang
dihasilkan mengalami kontaminasi bakteri.
Semakin lama periode subkultur,
akumulasi nutrisi pada eksplan menjadi
tinggi sehingga bakteri tumbuh dengan
lebih cepat.

Tabel 3. Kondisi protoplas ubi kayu genotip Gajah dan Ubi Kuning 18 minggu setelah tanam (MST)
pada media perlakuan semi padat
Perlakuan
Genotip
M1 M2
Gajah Tidak berkembang Utuh dan membentuk mikrokalus yang berwarna putih
seperti kapas
Ubi Kuning Tidak berkembang Utuh dan membentuk mikrokalus yang berwarna putih
seperti kapas
Ket.: M1 = Media MS + 2 µM CuSO4 + 2 mg/L BAP +1 mg/L NAA + 0,4 M BH3 + 0,5% Phytagel
M2 = Media MS + 2 µM CuSO4 + 2 mg/L BAP +1 mg/L NAA + 0,4 M BH3 + 1% Phytagel

8
 Isolasi dan Kultur Protoplas Mesofil…… (H. Fitriani, dkk.)

A B C

D E F

Gambar 4. Perkembangan protoplas asal mesofil daun menjadi mikrokalus ubi kayu genotip Gajah
umur 20 minggu setelah tanam (MST) (A-C); dan genotip Ubi Kuning umur 4 hingga 6
minggu setelah tanam (MST) (D-E) pada media semipadat MS + 2 µM CuSO4 + 2 mg/L
BAP + 1 mg/L NAA + 0,4 M BH3 + 1% Phytagel (perbesaran 8x)

Leifert & Cassel (2001) menyatakan Sebanyak 1-2 µL mikrokalus dipindahkan

bahwa kontaminasi oleh mikroba
merupakan salah satu masalah serius
dalam kultur in vitro tanaman. Sinta dkk.
(2014) menyatakan bahwa kontaminasi
menjadi penyebab utama hilangnya kultur
tanaman. Berdasarkan Kristina (2017),
setiap kondisi kultur yang terkontaminasi
dipengaruhi oleh banyak faktor,
diantaranya kebersihan lingkungan kerja,
jenis eksplan, cara sterilisasi, serta kondisi
suhu dan iklim pada saat kultur. Kondisi
aseptik diperoleh melalui pemanasan alat-
alat tanam dan media dengan autoklaf,
desinfektan atau lampu ultraviolet
sehingga mikroba-mikroba pengganggu
dapat dimatikan.
Pertumbuhan dan perkembangan
protoplas Ubi Kuning lebih lambat jika
dibandingkan dengan genotip Gajah.
Mikrokalus genotip Ubi Kuning yang
terbentuk di media kultur protoplas
semipadat masih tetap berbentuk mikro
kalus dan bersih dari kontaminan.
Mikrokalus Ubi Kuning tidak berkembang
dan tidak menunjukkan perubahan baik
bentuk maupun ukuran (Gambar 4D-F).
Pada 16 MST, mikrokalus Ubi
Kuning disubkultur dari media semipadat
ke media perlakuan pembentukan kalus.
ke delapan jenis media perlakuan induksi
kalus. Setelah berumur 4 MST di media
perlakuan, terjadi perubahan bentuk dari
mikrokalus menjadi nodul-nodul
menyerupai kalus. Pembentukan kalus
pada media perlakuan (P1 hingga P4) yaitu
media perlakuan dengan pemadat terjadi
lebih cepat dibandingkan pembentukan
kalus pada media perlakuan C1 hingga C4
yaitu media perlakuan tanpa pemadat
(cair). Mikrokalus pada media perlakuan
P1, P2, P3 dan P4 mengalami perubahan
bentuk menjadi nodul-nodul menyerupai
kalus berwarna kuning (Gambar 5A-D
atas) sedangkan kalus pada media
perlakuan C1, C2, C3 dan C4 bentuknya
belum berupa nodul-nodul sempurna yang
menyerupai kalus dan masih berwarna
putih seperti mikrokalus pada media
semipadat sebelumnya dengan ukuran
yang lebih kecil (Gambar 5A-D bawah).
Setelah 8 MST, mikrokalus tampak
berproliferasi membentuk kalus pada
semua jenis media (Tabel 4). Kalus yang
terbentuk pada 8 MST secara visual
terlihat perbedaan yang nyata dari bentuk
dan warna kalus pada media perlakuan
padat (P1, P2, P3 dan P4) dengan media
perlakuan cair (C1, C2, C3 dan C4).

9
BIOPROPAL INDUSTRI Vol.10 No.1, Juni 2019 : 1-13
: 1-13

Bentuk dan ukuran kalus antar media perlakuan padat P1, P2, P3 dan P4 terlihat
A B C D

Media padat
A B C D

Media cair
Gambar 5. Bentuk kalus asal protoplas ubi kayu genotip Ubi Kuning umur 4 minggu setelah tanam
(MST) di media perlakuan padat (atas) dan media cair (bawah); Gresshoff & Doy (GD)
(A), 1/2MS + 1/2GD + L-tyrosine (B), MS + 2,4-D 0,5 mg/L + BAP 2 mg/L (C), dan MS
+ 2,4-D 1,0 mg/L + BA 2 mg/L (D)

Tabel 4. Bentuk mikrokalus genotip Ubi Kuning pada 8 minggu setelah tanam (MST) di media
perlakuan induksi kalus
No. Perlakuan Komposisi media Kondisi protoplas
Media Padat
1. P1 Gresshoff & Doy (GD) Nodul menyerupai kalus
2. P2 1/2MS + 1/2GD + L-tyrosine Nodul menyerupai kalus
3. P3 MS + 2,4-D 0,5 mg/L + BA 2 mg/L Nodul menyerupai kalus
4. P4 MS + 2,4-D 0,1 mg/L + BAP 2 Nodul membentuk kalus
mg/L
Media Cair
5. C1 Gresshoff & Doy (GD) Kontaminasi
6. C2 1/2MS + 1/2GD + L-tyrosine Nodul menyerupai kalus dengan ukuran
lebih kecil
7. C3 MS + 2,4-D 0,5 mg/L + BAP 2 Kontaminasi
mg/L
8. C4 MS + 2,4-D 0,1 mg/L + BAP 2 Nodul menyerupai kalus dengan ukuran
mg/L lebih kecil

sama pada 4 MST dengan 8 MST. Kalus
yang terbentuk pada media perlakuan P4
tampak pertambahan diameter kalus jika
dibandingkan dengan media perlakuan
padat lainnya seperti P1, P2 dan P3
(Gambar 6A-D). Kalus pada media
perlakuan P4 menyerupai bentuk nodular
kalus embriogenik pada tahapan somatic
embryogenesis. Kalus yang berkembang
pada media cair C1 dan C3 mengalami
kontaminasi bakteri (Gambar tidak
ditampilkan).
Protoplas hasil isolasi pada
penelitian ini dapat berkembang menjadi
mikro kalus seperti halnya isolasi protoplas
dari jenis tanaman umbi lainnya yaitu talas
(Martin dkk., 2015). Selain itu, koloni
mikrokalus ubi kayu yang dihasilkan dapat
berkembang lebih lanjut menyerupai kalus
fase nodular berwarna putih susu. Ubi
kayu merupakan salah satu tanaman yang
sulit dalam hal kultur protoplas dan
regenerasinya. Berdasarkan Wu et al.
(2017), saat ini hanya ada dua laporan
mengenai kultur protoplas dan
regenerasinya yang telah dipublikasikan.
Shahin & Shepard (1980) melaporkan hasil
penelitiannya tentang regenerasi tunas
hasil isolasi protoplas asal mesofil daun
ubi kayu. Sofiari et al.(1998)
mempublikasikan tentang regenerasi tunas
hasil isolasi protoplas asal friabe

10
 Isolasi dan Kultur Protoplas Mesofil…… (H. Fitriani, dkk.)

embryogenic callus. Anthony et al.(1995) mengindikasikan bahwa diperlukan

mengembangkan protokol mengenai kultur
protoplas dari daun ubi kayu.
Kalus berumur 48 minggu dan
mengalami 3-4 subkultur, bentuk kalus
masih sama dan belum menunjukkan ke
arah perbanyakan kalus. Hal ini
optimasi jenis media untuk proliferasi
kalus. Media proliferasi kalus yang tepat
dari protoplas ubi kayu dari genotip lokal
belum diperoleh. Masih diperlukan
percobaan lebih lanjut untuk mendapatkan
media proliferasi kalus yang optimal.

Media padat
A B C D

Media cair
B D
Gambar 6. Bentuk kalus asal protoplas ubi kayu genotip Ubi Kuning pada 8 minggu setelah tanam
(MST) di media perlakuan Gresshoff & Doy (GD) (A), 1/2MS + 1/2GD + L-tyrosine (B),
MS + 2,4-D 0,5 mg/L + BAP 2 mg/L (C), dan MS + 2,4-D 1,0 mg/L + BAP 2 mg/L (D)

4. KESIMPULAN Media perlakuan P4 yang mengandung

Protoplas utuh dari mesofil ubi kayu
genotip Mentega 2, Ubi Kuning dan Gajah
telah diisolasi menggunakan larutan enzim
dengan komposisi 2% selulase, 1%
maserozim dan 0,1% pektoliase
menghasilkan protoplas berkisar antara
0,197-0,6 x 106 protoplas/mL. Protoplas
dapat tumbuh membentuk mikrokalus pada
media semipadat MS mengandung 2 µM
CuSO4, 2 mg/L BAP, 1 mg/L IAA, 2%
sukrosa dan pemadat 1% Phytagel.
Mikrokalus selanjutnya dapat berkembang
menjadi kalus pada delapan media
perlakuan yang terdiri dari empat media
padat dan empat media cair yaitu media
Gresshoff and Doy (GD); MS dan GD
masing-masing dengan konsentrasi
setengah; MS dengan penambahan 2,4-D
(0,1 dan 0,5 mg/L) dan BAP 2 mg/L.
Kedelapan media pertumbuhan kalus dapat
membuat mikrokalus tumbuh dan
berkembang secara kuantitas dan ukuran
menjadi nodul-nodul menyerupai kalus.
Mikrokalus tumbuh lebih cepat pada media
padat dibandingkan pada media cair.
media dasar MS dengan penambahan 1,0
mg/L 2,4-D dan 2,0 mg/L BAP
menunjukkan pertumbuhan kalus yang
lebih baik dimana kalus yang diperoleh
terlihat berukuran lebih besar dibanding
media lainnya. Perkembangan
pembentukan mikrokalus yang berasal dari
mesofil daun ubi kayu ke tahap selanjutnya
merupakan suatu kemajuan yang sangat
penting bagi penelitian protoplas ubi kayu
terutama genotip lokal Indonesia.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih
kepada Andri Fadhillah Martin, M.Si
untuk diskusi perihal jenis media dan
teknis isolasi protoplas, Suwinaryani untuk
pemeliharaan kultur ubi kayu dan M. Usen
untuk bantuan teknis di laboratorium.
Penelitian ini merupakan bagian dari
kegiatan DIPA Tematik Puslit
Bioteknologi LIPI Tahun Anggaran 2015-
2016.

11
BIOPROPAL INDUSTRI Vol.10 No.1, Juni 2019 : 1-13
: 1-13
DAFTAR PUSTAKA
Anthony, P., Davey, M.R., Power, J.B. &
Lowe, K.C. (1995). An improved
protocol for the culture of cassava leaf
protoplasts. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, 42, 229-302.
Frearson, E.M., Power, J.B. & Cocking, E.C.
(1973). The isolation, culture and
regeneration of Petunia leaf protoplast.
Dev. Biol, 33, 1130-1137.
Grosser, J.W., Calovic, M. & Louzada, E.S.
(2010). Protoplast fusion technology. In
Davey, M.R. and Anthony, P. (Ed),
Plant Cell Culture: Essential Methods.
(pp. 175–198). Chichester: John Wiley
& Sons. Ltd.
Hendaryono, D.P.S. & Wijayani, A. (1994).
Teknik kultur jaringan pengenalan dan
petunjuk perbanyakan tanaman secara
vegetatif modern. Yogyakarta: Kanisius.
Hong, S.Y., Seo, P.J., Cho, S.H. & Park, C.M.
(2012). Preparation of leaf mesophyll
protoplasts for transient gene expression
in Brachypodium distachyon. Journal of
Plant Biology, 55(5), 390-397.
Husni, A., Mariska, I., Wattimena, G.A. &
Purwito, A. (2003). Keragaman genetik
tanaman terung hasil kultur protoplas.
Jurnal Bioteknologi Pertanian, 8(2), 52-
59.
Kanchanapoom, K., Jantaro, S. & Rakchad, D.
(2001). Isolation and fusion of
protoplasts from mesophyll cells of
Dendrobium pompadour. Sci. Asia, 27,
29-34.
Kao, K.N. & Michayluk, M.R. (1975).
Nutritional requirements for growth of
Vicia hajastana cells and protoplasts at a
very low population density in liquid
media. Planta, 126(2), 105-110.
Khatri, A., Dahot, M.A., Khan, I.A. &
Nizamani, G.S. (2010). An efficient
method of protoplast isolation in
Banana (Musa spp). Pakistan Journal
Botany, 42(2), 1267-1271.
Khentry, Y., Paradornuvat, A., Tantiwiwat, S.,
Phansiri, S. & Thaveechai, N. (2006).
Protoplast isolation and culture of
Dendrobium Sonia “Bom 17”. Kasetsart
Journal (Natural Science), 40, 361-369.
Kristina, M., Oratmangun, Dingse, P., &
Febby, K. 2017. Deskripsi jenis-jenis
kontaminan dari kultur kalus
12
Catharanthus roseus (L.) G. Don.
Jurnal Mipa Unsrat Online, 6(1), 47-
52.
Leifert, C. & Cassells, A.C. (2001). Microbial
hazards in plant tissue and cell cultures.
In Vitro Cell Dev Biol-Plant, 37, 133-
138.
Mariska, I. & Husni, A. (2006). Perbaikan sifat
genotip melalui fusi protoplas pada
tanaman lada, nila dan terung. Jurnal
Penelitian dan pengembangan
Pertanian, 25(2), 55-60.
Martin, A.F., Wulansari, A., Hapsari, B.W. &
Ermayanti, T.M. (2015). Isolasi,
purifikasi dan kultur protoplas mesofil
daun talas (Colocasia esculenta (L.)
Shott.). Prosiding Seminar Nasional
Bioteknologi III.UGM (pp. 1-17).
Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.
Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M.R. &
Stewart, C.N.Jr., (2008). Protoplast
isolation and transient gene expression
in switchgrass, Panicum virgatum L.
Biotechnology Journal, 3(3), 354-359.
Milliam, S., Payne, L.A. & Mackay, G.R.
(1995). The integration of protoplast
fusion, derived material into a potato
breeding programme. A review progress
and problems. Euphytica, 85, 451-455.
Murashige, T. & Skoog, F. (1962). A revised
medium for rapid growth and bio assays
with tobacco tissue cultures.
Physiologia plantarum, 15(3), 473-497.
Patnaik, G. & Cocking, E.C. (1982). A new
enzyme mixture for the isolation of leaf
protoplasts.Z. Pflanzen-physiol. Bd.,
107(5), 41-45.
Prihastanti, E., Soegihardjo, C.J. &
Purbaningsih, S. (2001). Kultur suspensi
sel mesofil daun pegagan (Centella
asiatica (L.) urban) dan analisis
kualitatif senyawa asiatikosida. Majalah
Farmasi Indonesia, 12(1), 10-19.
Purwito, A., Wattimena, G.A. & Suwanto, A.
(1999). Isolasi dan regenerasi protoplas
dari mesofil daun kentang (Solanum
tuberosum L.) dihaploid. Buletin
Agronomi, 27(1), 1-9.
Riyadi, I. (2006). Isolasi protoplas tanaman
kacang panjang secara enzimatis.
Buletin Plasma Nutfah, 12(2), 62-68.
 Isolasi dan Kultur Protoplas Mesofil…… (H. Fitriani, dkk.)

Riyadi, I. (2010). Isolasi Protoplas secara Tan, M.L.M., Boerrigter, H.S. & Kool, A.J.
Enzimatis pada Tanaman Kecipir. (1987). A rapid procedure for plant
Buletin Plasma Nutfah, 16(1), 57-63. regeneration from protoplasts isolated
from suspension cultures and leaf
Shahin, E.A. & Shepard, J.F. (1980). Cassava
mesophyll cells of wild Solanum species
Mesophyll Protoplasts: Isolation,
and Lycopersicon pennellii. Plant
Proliferation, and Shoot Formation.
Science, 49(1), 63-72.
Plant Science Letters, 17, 459-465. doi:
10.1016/0304-4211(80) 90133-9. Tee, C.S., Lee, P.S., Kiong, A.L.P. &
Mahmood, M. (2010). Optimisation of
Sinta, M.M., Riyadi, I. & Sumaryono. 2014.
protoplasts isolation protocols using in
Identifikasi dan pencegahan
vitro leaves of Dendrobium crumenatum
kontaminasi pada kultur cair sistem
(pigeon orchid). African Journal of
perendaman sesaat. Menara
Agricultural Research, 5(19), 2685-
Perkebunan. 82(2), 64-69.
2693.
Sofiari, E., Raemakers, C.J.J.M., Bergervoet,
Tomar, U.K. & Dantu, P.K. (2010). Protoplast
J.E.M., Jacobsen, E. & Visser, R.G.F.
Culture and Somatic Hybridization. In:
(1998). Plant regeneration from
Tripathi. G. (ed) Cellular and
protoplasts isolated from
Biochemical Science. (pp. 876-891).
friableembroygenic callus of cassava.
New Delhi: I.K. International House Pvt
Plant Cell Reports, 18, 159-165.
Ltd.
Sukmadjaja, D., Sunarlim, N., Lestari, E.G.,
Utami, E.S.W. & Hariyanto, S. (2015).
Roostika, I. & Suhartini, T.
Optimasi Isolasi Protoplas Mesofil
(2007).Teknik Isolasi dan Kultur
Daun Anggrek Paraphalaenopsis
Protoplas Tanaman Padi. Jurnal
laycockii. AGROTROP, 5(1), 21–29.
AgroBiogen, 3(2), 60-65.
Wu, J.Z., Liu, Q., Geng, X.S., Li, K.M., Luo,
Suryowinoto, M. (1989). Fusi protoplas. PAU
L.J. & Liu, J.P. (2017). Highly efficient
Bioteknologi. Yogyakarta: Universitas
mesophyl protoplast isolation and PEG-
Gadjah Mada.
mediated transient gene expression for
Suryowinoto, M. (1996). Prospek kultur rapid and large-scale gene
jaringan dalam perkembangan characterization in cassava (Manihot
pertanian modern. Yogyakarta: esculenta Crantz). BMC biotechnology,
Universitas Gadjah Mada. 17(1), 29.

13