Teknik Isolasi Microorganisme paatogen dari penderita

BAB II Tinjauan Teori

Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikrobalain yang berasal dari
campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan denganmenumbuhkannya dalam media
padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap padatempatnya (Nur, I. dan Asnani, 2007)

Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakancampuran. Dua
diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metodecawan tuang. Yang
didasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesiesindividu. Dengan
anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati

Menurut Hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk memperoleh biakan murni yaitu :

1.Metode cawan gores

Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Metode cawangores yang
dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang
diinginkan.

2. Metode cawan tuang

Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalahdengan
mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan ( ±50C ) yang
kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen padaumunya tidak
diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang-
kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni terpisah di atas permukaan ataupun di
dalam agar.

Metode ini memboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi.Metode
cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh
hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperolehdari pengalaman.
Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya
mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan oleh para
mahasiswa yang baru mulai mempelajari mikrobiologi ialah tidak memanfaatkan permukaan medium
dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceranmikroorganisme menjadi kurang lanjut dan
cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang
digoreskan (Ratna, 1990).

Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agar-agar lempengan, padaagar-
agar miring dan pada tusukan gelatin adalah sebagai berikut :

1.Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan dan tepi. Bentuk
kolonidilukiskan sebagai titik-titik, bulat berbenang, tak teratur, serupa akar, serum
kumparan.Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung,
timbulmembukit dan timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang
berbelah- belah, ada yang bergerigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting.
2.Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan tepi koloni dan sifat
itudinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang, serupa duri, serupa tasbih, serupa titik-
titik,serupa batang dan serupa akar.

3.Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan gelatin. Karena itu, maka
bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda. Lagipula bentuk koloni yang tidak dapatmengencerkan
gelatin. Bila dilihat dari samping koloni yang tidak mengencerkan gelatin dapatserupa pedang, tasbih,
bertonjol-tonjol dan berjonjot. Jika bakteri mampu mengencerkan gelatin,maka bentuk koloninya dapat
serupa kawah, serupa mangkuk, serupa corong, pundi-pundi dan berlapis.

Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan estelah inkubasiakan terlihat
pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai cirikhas yang lain.
Ciri-ciri ini akan mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada mediapertumbuhan, sehingga
pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan (Ratna,1990).Bakteri yang memiliki flagella
sering kali membentuk koloni yang menyebar terutama jikamenggunakan lempengan agar basah, untuk
mencegah menyebarnya koloni maka harus digunakanagar benar-benar kering (Djida, N., 2000).

METODIOLOGI

ISOLASI MICROBA DARI PASIEN PENDERITA DIABETES

Alat dan Bahan

Autoklaf, bunsen, cawan petri (Iwaki pyrex), gelas beaker (Iwaki pyrex), gunting, jarum ose, inkubator,
kaca objek, Laminar Air Flow (LAF), lemari pendingin, mikroskop binokuler (Olympus CX51), pemanas
listrik (hot plate), tabung reaksi, dan erlenmeyer (Iwaki pyrex). alkohol 70%, media transport (Amies
Agar), Potato Dextrose Agar (PDA), kloramfenikol, dan Lactophenol Cotton Blue (LCB)

Tahapan Penelitian

 Pengambilan Sampel Bersihkan luka dengan kain kasa steril yang telah dibasahi NaCl fisiologis
secara hati hati, kemudian perlakuan diulangi sebanyak tiga kali.
 Usapkan lidi kapas steril ke bagian ulkus tanpa mengenai tepi luka.
 Selanjutnya dimasukkan lidi kapas tersebut ke dalam media transport dan ditutup tabung
dengan erat serta diberi label nama.
 kemudian sampel dibawa ke laboratorium untuk dilakukan pemeriksaan.

Isolasi dan Identifikasi

 Fungi Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.

 Dilakukan isolasi jamur secara aseptis.
 Diambil swab lalu digoreskan pada media PDA secara aseptis di dalam LAF.
 Media PDA yang sudah digores, diinkubasi dengan inkubator (37 °C) selama 3-5 hari.
 Hasil berupa koloni yang memiliki morfologi yang berbeda.
 Fungi yang sudah murni kemudian diidentifikasi secara makroskopis dan mikroskopis dengan
mikroskop.
 Pengamatan Mikroskopis Objek dan cover glass didesinfeksi dengan alkohol.
 Disiapkan Lactophenol Cotton Blue (LCB) untuk pewarnaan.
 Dipipet 1-2 tetes larutan LCB kedalam objek glass.
 Diambil koloni tunggal jamur pada biakan/kultur jamur dari sampel swab di media PDA dengan
ose dan diaduk perlahan pada objek glass.
 Dipanaskan dengan melewatkan pada api bunsen sampai menguap, tidak mendidih, kemudian
tutup dengan cover glass.
 Jamur yang tumbuh diamati di bawah mikroskop pada pembesaran 100 kali.

Analisa data

Analisis data dilakukan secara deskriptif untuk variabel karakteristik responden (jenis kelamin, usia,
derajat ulkus diabetik) dan jenis jamur patogen. Untuk pengidentifikasian, secara makroskopis
diamati bentuk koloni, warna koloni, dan permukaan koloni. Sedangkan secara mikroskopis diamati
warna, jumlah, bentuk dan posisi dari spora/konidia dan hifa. Selanjutnya dibandingkan dengan
literatur buku Description of Medical Fungi yang disusun oleh Sarah Kidd, Catriona H, Helen A, dan
Ellis D (2016).

Pembahasan

Percobaan kali ini membahas tentang cara-cara atau teknik yang biasa digunakan dalam mengisolasi
mikroba dari habitat bukan alaminya. Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk
menumbuhkan mikroba di luar lingkungan alamiahnya. Di kehidupan normalnya atau di habitat
alamiahnya mikroba sulit ditemukan dalam bentuk koloni sendiri. Mikroba ini pasti ditemukan
dalam bentuk koloni yang hidup bersama-sama dengan koloni mikroba yang lainnya. Oleh karenaitu,
pengisolasian ini dilakukan.

Percobaan ini diawali dengan Pengambilan Sampel Bersihkan luka dengan kain kasa steril yang telah
dibasahi NaCl fisiologis secara hati hati, kemudian perlakuan diulangi sebanyak tiga kali. Usapkan lidi
kapas steril ke bagian ulkus tanpa mengenai tepi luka. Selanjutnya dimasukkan lidi kapas tersebut ke
dalam media transport dan ditutup tabung dengan erat serta diberi label nama. kemudian sampel
dibawa ke laboratorium untuk dilakukan pemeriksaan

Isolasi jamur bertujuan untuk mengambil jamur dari lingkungan asalnya dan ditumbuhkan pada
media buatan sehingga diperoleh kultur murni dan dapat diidentifikasi jenis jamur yang terdapat
pada suatu sampel. Media yang di gunakan pada penelitian ini untuk mengisolasi jamur yang berasal
dari swab ulkus diabetikum yaitu Potato Dextrose Agar (PDA). Hasil pengamatan makroskopis isolat
jamur pada medium PDA berdasarkan bentuk, warna, dan permukaan koloni. Pengamatan
morfologi koloni dilakukan untuk mengetahui pola pertumbuhan dari setiap jamur yang tumbuh
pada media tersebut.