NAMA : Muhammad Rizal Alfiansyah

NPM : 230110200003
KELOMPOK : 9

Pertemuan ke – 4 (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis (penggabungan)

dan amplifikasi (penggandaan) DNA secara in vitra yang ditemukan oleh Karry Mullis tahun
1985. Teknik PCR memungkinkan untuk menggandakan segmen DNA dalam jumlah jutaan
kali hanya dalam waktu beberapa jam (Handoyo dan Rudiretna 2001).
Secara umum proses PCR terdiri atas beberapa tahap, yaitu : (1) pra-denaturasi DNA
template; (2) denaturasi template; (3) annealing (penempelan) primer pada template; (4)
extension (pemanjangan) primer dan (5) post-extension (pemantapan). Menurut Handoyo dan
Rudiretna (2001), terjadi pengulangan terhadap (siklus) pada tahap (2) denaturasi template
hingga tahap (4) extension.
Menurut Nasibuan (2015), tahap (siklus) yang sangat esensial dalam reaksi PCR
terjadi pada saat pengulangan tahap (2) denaturasi template tahap (4) extension, uraian
ringkas dari tiga tahapan tersebut adalah sebagai berikut:
1. Denaturasi merupakan tahap dimana terjadi pemisahan untai DNA ganda menjadi
dua untai tunggal, Suhu yang tinggi (antara 90°C - 95°C) menjadi penyebab
putusnya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang komplemen.
2. Annealing (penempelan) terjadi pada suhu 50°C - 60°C, merupakan tahap dimana
ikatan hidrogen antara primer akan terbentuk dan menempel pada sekuen cetakan
DNA (DNA template) yang komplemen sehingga DNA polimerasi tersebut akan
berikatan dan menjadikan ikatan hidrogen sangat kuat dan tidak akan terputus.
Sintesis DNA ini berlangsung dari arah 5’ ke 3’
3. Extension (pemanjangan) atau reaksi polimerasi terjadi pada suhu 72°C,
merupakan tahap dimana DNA polimerasi yang sudah terbentuk dan menempel
kuat pada primer mengalami perpanjangan. Proses pemanjangan ini dilakukan
oleh primer dengan arah yang berlawanan pada DNA template yang komplemen
hingga terbentuk DNA untai ganda yang baru.

Pengulangan ketiga tahapan tersebut menyebabkan sintesis DNA akan terus berlanjut.
Pada akhirnya akan diperoleh produk PCR berupa sekuen DNA yang diinginkan dalam
jumlah yang berlipat ganda, yakni sebanyak 2n (n = banyaknya siklus PCR yang digunakan).
Selain ketiga tahapan tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut
(Hasibuan 2015);
 1. Pra-denaturasi DNA template merupakan tahap dimana awal reaksi dimulai,
proses ini dilakukan selama 1-9 menit untuk memastikan kesempurnaan
denatutrasi dan mengaktifasi DNA polimerasi.

2. Post-extension (pemantapan) template merupakan tahap dimana siklus PCR

terakhir. Umumnya dilakukan pada suhu optimum enzim (70°C - 72°C) selama 15
menit untuk memastikan bahwa setiap untai tunggal yang tersisa sudah
diperpanjang secara sempurna.

Komponen Reaksi PCR

- Master Mix 2x : 12,5 µL

- NFW : 9,5 µL

- Primer : 1 µL

- Sampel DNA : 2 µL

Prosedur mix PCR ini adalah mencampurkan bahan-bahan diatas pada microtube
berukuran 1,5 ml. Bahan yang pertama yang pertama kali dimasukkan adalah bahan
dengan jumlah paling banyak ke yang paling sedikit.

Penggunaan Mesin PCR

- Stabilizer

- UPS

- Thermal Cycler (Mesin PCR) “SENQUEST”

Spesifikasi Alat SENSOQUEST

- Blocks : Gold

- Tipe : Gradient & Non Gradient

- Format : 48-wells, 96-wells & 3 x 21 wells

- Temprature : -5°C sampai 99,9°C

- Perbedaan suhu tiap well : ± 0,25°C pada suhu 55°C

Langkah kerja :

- Masukkan mastermix kedalam microtube

- Masukkan NFW

- Campurkan terlebih dahulu primer forward dan primer reverse ke dalam tube kecil
- Masukkan/campurkan larutan sebelumnya dengan primer teknis

- Masukkan sampel DNA ke dalam microtube larutan sebelumnya

- Disentrifugasi selama 30 detik agar semua larutan tercampur ke bawah tube

- Masukkan dalam mesin PCR (tidak lebih dari 1 gram). Dalam 94°C - 95°C (dengan
panas atas + bawah agar tidak terjadi penguapan ).