ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PEMBERSIH NITRIT, NITRAT, DAN

AMMONIUM DARI FILTER BIOBALLS

READING ASSIGNMENT

Oleh :

ROIS FAKHROZI ALSYAIDI

57214114046

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI AKUAKULTUR

POLITEKNIK AHLI USAHA PERIKANAN JAKARTA

2022
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PEMBERSIH NITRIT, NITRAT, DAN
AMMONIUM DARI FILTER BIOBALLS

Tugas ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk mengikuti Ujian Akhir Semester III pada

Politeknik Ahli Usaha Perikanan

Oleh :

ROIS FAKHROZI ALSYAIDI

57214114046

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI AKUAKULTUR

POLITEKNIK AHLI USAHA PERIKANAN JAKARTA

2022
 LEMBAR PENGESAHAN

Nama : Rois Fakhrozi Alsyaidi

NRP : 57214114046
Program Studi : Teknologi Akuakultur
Semester : Tiga (III)
Dosen Pembimbing : Dr. M. Farchan, A.Pi., SE., M.Si
Judul : Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Pembersih Nitrit, Nitrat, Dan
Ammonium Dari Filter Bioballs
Penulis : Qoriatul Ilma, Achmad Dinoto, Ninu Setyaningrum, Mulyadi,
Dwi Agustiyani, Nani Radiastuti, and Heddy Julistiono
Penerbit : Indonesian Aquaculture Journal
Tahun Terbit : 2022
Halaman : 13-22

Jakarta, Desember 2022

Menyetujui
Dosen Pembimbing

(Dr. Moch. Farchan, A.Pi., SE., M.Si)

 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas selesainya Reading
Assignment yang berjudul " Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Pembersih Nitrit, Nitrat, Dan
Ammonium Dari Filter Bioballs ". Atas dukungan moral dan materil yang diberikan dalam
penyusunan makalah ini, maka penulis mengucapkan terima kasih kepada.

1. Bapak Dr. M. Hery Riyadi Alauddin, S.Pi, M.Si., selaku Direktur politeknik Ahli Usaha
Perikanan.
2. Bapak Dr.Eng., Sinar Pagi Sektiana, S.St.Pi., M.Si., selaku Ketua Program Studi Teknologi
Akuakultur, yang telah memberikan kesempatan untuk menggunakan fasilitas sekolah untuk
menunjang pembuatan makalah.
3. Bapak Dr. M. Farchan, A.Pi., SE., M.Si selaku dosen pembimbing Reading assignment, yang
banyak memberikan materi pendukung, bimbingan, dan masukan kepada penulis.
4. Orang tua penulis yang banyak memberikan dukungan baik moril maupun materil.
5. Website : U-Dictionary, G-Translate,Grammarly,G-Cendekia, dan Indonesian Aquaculture
Journal
6. Semua pihak yang tidak dapat penulis rinci satu per satu yang telah membantu dalam proses
penyusunan makalah ini.

Penulis menyadari bahwa makalah ini jauh dari kata sempurna dan masih terdapat beberapa
kekurangan, oleh karena itu penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari
pembaca untuk penyempurnaan makalah ini. Semoga Reading Assignment ini bermanfaat bagi
pembaca.

Serang, Desember 2022

( Rois Fakhrozi Alsyaidi )

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PEMBERSIH NITRIT, NITRAT, DAN
AMMONIUM DARI FILTER BIOBALLS

Qoriatul Ilma, Achmad Dinoto, Ninu Setyaningrum, Mulyadi, Dwi Agustiyani,

Nani Radiastuti, dan Heddy Julistiono

Puslit Biologi, Badan Riset dan Inovasi Nasional (BRIN)

Jl. Raya Jakarta-Bogor Km. 46, Cibinong, Bogor, Jawa Barat 16911, Indonesia
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Jl. Ir. H. Juanda No. 95, Cempaka Putih,
Ciputat Timur, Kota Tangerang Selatan, Banten 15412, Indonesia

(Diterima: 30 Agustus 2021; Revisi akhir: 19 Mei 2022; Diterima: 19 Mei 2022)

ABSTRAK

Kehadiran bakteri yang efektif menghilangkan nitrit, nitrat, dan amonia dalam
Recirculating Aquaculture Systems (RAS) diperlukan untuk mengurangi toksisitasnya
terhadap ikan. Penelitian dilakukan untuk mencari bakteri yang dapat dikultur dan
mereduksi nitrit, nitrat, dan amonium. Enam belas koloni bakteri diisolasi dari bioball
biofilter RAS dan diuji kemampuannya untuk mengurangi konsentrasi nitrit atau nitrat.
Menggunakan kertas indikator sederhana untuk nitrit dan nitrat, dipilih empat isolat yang
dapat mereduksi konsentrasi nitrit dan nitrat, yaitu K1NA3, K2NA3, CNA1, dan
PRO4NA1. Keempat isolat kemudian dievaluasi metabolisme senyawa nitrat, nitrit, dan
amonium menggunakan metode spektrofotometri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
isolat K1NA3, CNA1, dan PRO4NA1 menurunkan konsentrasi nitrit tetapi menghasilkan
amonium, sedangkan isolat K1NA3 mampu menurunkan konsentrasi nitrat tetapi
menghasilkan nitrit dan amonium. Eksperimen penurunan kadar amonium pada media
limbah sintetik menunjukkan kemampuan empat isolat untuk menurunkan kadar
amonium setelah enam hari meskipun menghasilkan nitrit. Berdasarkan analisis gen 16S
rRNA, isolat tersebut memiliki kekerabatan yang dekat dengan Pseudomonas otitidis
(K1NA3 dan K2NA3), Acinetobacter cumulans (CNA1), dan Vogesella perlucida
(PRO4NA1).

KATA KUNCI : penghilangan amoniak; senyawa nitrogen; bioremediasi akuakultur; biofilter

bakteri; bakteri nitrifikasi
PENDAHULUAN

Limbah berbasis nitrogen yang berlebihan berupa amonia, amonium, nitrit, dan nitrat dapat
membahayakan ekosistem, baik laut maupun air tawar, manusia, dan kesehatan hewan (Kumar
dkk., 2020). Akumulasi nitrogen anorganik merupakan kendala utama dalam akuakultur intensif
(Khangembam dkk., 2017).

Dalam akuakultur, bakteri berperan dalam transformasi senyawa nitrogen (Hu et al., 2013).
Kelompok bakteri ini dapat mengubah senyawa N-organik menjadi amonia (NH3 ). Ammonia
kemudian dioksidasi menjadi nitrit (NO2 ) dan nitrat (NO3 ) dalam proses nitrifikasi (Stein &
Klotz, 2016). Nitrat yang terbentuk dapat direduksi menjadi gas nitrogen (N2) melalui
denitrifikasi atau diubah kembali menjadi amonia. Pembentukan nitrat menjadi gas nitrogen
merupakan transformasi ideal pada sistem akuakultur (Rassamee et al., 2011). Pemanfaatan
mikroba indigenous di tambak dianggap sebagai metode yang ramah lingkungan untuk
mempercepat pembuangan limbah nitrogen. Inokulum bakteri yang lebih aktif biasanya
berbentuk konsorsium (Barik dkk., 2018). Setiap strain bakteri memiliki kemampuan
metabolisme yang berbeda dalam memetabolisme nitrogen, mineralisasi bahan organik, dan
menghilangkan senyawa beracun. (Dahiya & Mohan, 2016).

Pengembangan pengolahan air limbah dari sistem resirkulasi akuakultur (RAS) untuk
mengolah sisa senyawa limbah nitrogen berbahaya dari RAS, di mana bakteri berperan dalam
nitrifikasi dan nitrifikasi-denitrifikasi secara , masih diperlukan (Shitu dkk., 2021). Isolasi
bakteri penurun kadar amoniak, nitrit, dan nitrat masih dianggap relevan untuk dilakukan dalam
rangka pengendalian limbah nitrogen pada skala industri (Motamedi & Jafari, 2020). Penapisan
bakteri tersebut diharapkan dapat meningkatkan efektivitas penggunaan bakteri indigenous untuk
mereduksi senyawa nitrogen limbah. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan koloni bakteri
yang berpotensi menurunkan kandungan ammonium, nitrit, dan nitrat.

BAHAN DAN METODE

Secara singkat, proses mendapatkan isolat bakteri yang efektif diawali dengan isolasi
bakteri dari filter bioball. Isolat kemudian ditumbuhkan pada 4 mL media NB selama 24 jam dan
disentrifugasi. Pelet yang diperoleh ditambahkan 200 µL nitrit (NaNO2 ) 5 mg/L atau nitrat
(KNO3 ) 20 mg/L, dan diinkubasi selama 24 jam. Penurunan kandungan nitrit atau nitrat pada
supernatan menunjukkan kemampuan isolat dalam menyisihkan nitrit atau nitrat masing-masing
dan diperkirakan dengan menggunakan kertas indikator. Koloni bakteri yang mampu mereduksi
kandungan nitrit dan/atau nitrat kemudian dipilih untuk analisis lebih lanjut.

Supernatan yang mengandung nitrit atau nitrat dimana isolat dianggap mampu mereduksi
nitrit dan nitrat kemudian diukur dengan menggunakan metode spektrofotometer untuk
memastikan kemampuan bakteri dalam mereduksi kadar nitrit dan nitrat Produksi amonium,
serta produksi nitrat dalam supernatan nitrit dan produksi nitrit dalam supernatan nitrat, juga
diukur. Isolat yang mampu mereduksi nitrit atau nitrat dengan produksi amonium rendah
kemudian dipilih untuk uji reduksi amonium pada media limbah sintetik dengan menumbuhkan
isolat tunggal atau campuran pada media yang mengandung amonium berdasarkan metode Du
dkk yang dimodifikasi. (2015).

Isolasi Bakteri

Bakteri diisolasi dari bioball yang digunakan sebagai filter biologis dalam sistem
resirkulasi akuakultur di Puslit Biologi, Badan Riset dan Inovasi Nasional (BRIN), Cibinong,
Jawa Barat. Sampel dari bioball diambil sebanyak kurang lebih 0,1 g dengan mengorek rongga
bioball menggunakan spatula steril. Bakteri ditumbuhkan pada media nutrien agar (NA) dan
nutrien broth (NB) (Himedia) pada suhu ruang.

Pengukuran Kualitatif Aktivitas Bakteri Untuk Mereduksi Nitrit dan Nitrat

Menggunakan Kertas Indikator (Skrining)

Isolat bakteri ditumbuhkan dalam 4 mL media NB selama 24 jam dengan agitasi 115 rpm
pada suhu kamar. Suspensi sel sebanyak 1 mL disentrifugasi selama lima menit dengan
kecepatan 10.000 rpm. Pelet dicuci dan ditambahkan 200 µL larutan NaNO2 5 mg/L untuk uji
reduksi nitrit atau 20 mg/L KNO3 untuk uji kadar nitrat. Tabung mikro diaduk selama 24 jam.
Sampel sebanyak 3 µL ditempatkan pada kertas uji nitrit-nitrat (JBL EasyTest, Jerman) selama
3-5 menit untuk mendeteksi adanya perubahan warna pada kertas uji. Bakteri yang inokulumnya
positif mereduksi nitrit atau nitrat yang berwarna merah muda hingga putih diseleksi untuk
pengujian selanjutnya
 Penentuan Nitrit dan Nitrat Metabolisme

Kemampuan isolat tunggal untuk menurunkan nitrit atau nitrat dalam media, produksi
amonium, dan produksi nitrat atau nitrit dalam media yang mengandung nitrit atau nitrat diamati
untuk mengkonfirmasi terjadinya proses metabolisme nitrit dan nitrat. Kultur isolasi 24 jam
disentrifugasi pada 5.000 g; pelet dicuci dengan air suling. Pelet kemudian diresuspensi dengan 2
mL nitrit atau nitrat dengan OD 600 nm masing-masing 3,75 dan 2,26. Kultur dilakukan di
microplate 12 sumur, diinkubasi pada suhu kamar dengan pengocokan 100 rpm. Setelah enam
hari inkubasi, kadar nitrit, nitrat, dan amonium diukur dengan menggunakan metode spec
trophotometer. Eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga

Penentuan Metabolisme Amonium oleh

Konsorsium Bakteri dalam Sintetik Air Limbah Media Prosedur percobaan ini mirip
dengan metode penentuan metabolisme nitrit dan nitrat. Media sintetik disiapkan menurut
metode yang dimodifikasi oleh Du dkk. (2015). Dalam 1 L larutan unsur mikro terdiri dari: 8,304
g Na2EDTA.2H2O, 5 g FeSO4.7H2O, 0,215 g ZnSO4.7H2O, 0,495 g MnSO4, 0,125 g, dan
CuSO4.5H2O. Dalam 1 L larutan limbah sintetik terdiri dari 0,191 g NH4Cl, 0,800 NaHCO3,
0,081 KH2PO4, 0,214 Na2HPO4.12H2O, 0,213 Na2SO4, 0,036 CaCl.2H2O, 0,051
MgCl2.6H2O, dan 1 mL larutan unsur mikro. Isolat percobaan yang diuji adalah PRO4NA1 (A);
CNA1 dan PRO4

NA1 (B); dan K1NA3, K2NA3, CNA1, dan PRO4NA1 (C). Nilai OD 600 nm setiap
percobaan adalah 2,4.

Pengukuran Konsentrasi Nitrit (SNI 06-6989.9, 2004)

Pengukuran konsentrasi nitrit dilakukan dengan metode pewarnaan azo. Sampel 10 µL

ditambahkan ke 240 µL air suling ke dalam lempeng mikro 96 sumur. Sampel yang telah
diencerkan ditambahkan 5 µL asam sulfanilamida dan 5 µL larutan NED kemudian
dihomogenkan. Campuran didiamkan selama 10 menit kemudian diukur dengan menggunakan
microplate reader dengan panjang gelombang 543 nm

. Kurva kalibrasi dibuat dengan menyiapkan larutan NaNO2 sebagai larutan standar nitrit
dengan konsentrasi 0 sampai 0,25 mg/L.
 Pengukuran Konsentrasi Nitrat (Metode EPA: 352.1, 1971)

Pengukuran nitrat dilakukan dengan metode kolorimetri brusin sulfat. Sampel sebanyak 40
µL ditambahkan dengan 360 µL air suling. Sampel yang telah diencerkan ditambahkan 80 µL
larutan NaCl 30%, 400 µL asam sulfat 75%, dan 20 µL reagen brucine sulfate. Campuran
dihomogenkan dan dipanaskan pada suhu 95°C selama 20 menit. Kemudian absorbansi diukur
pada panjang gelombang 410 nm. Kurva kalibrasi dibuat dengan menyiapkan larutan KNO3
sebagai larutan standar konsentrasi nitrat dari 0 sampai 2,5 mg/L.

Pengukuran Konsentrasi Amonium (Metode EPA: 350.2, 1974)

Pengukuran konsentrasi amonium dilakukan dengan menggunakan metode Nessler.

Sampel sebanyak 25 µL ditambahkan dengan 225 µL aquadest dalam lempeng mikro 96 dengan
baik. Sampel yang telah diencerkan ditambahkan 2,5 µL Nessler A dan 2,5 µL Nessler B,
dihomogenkan dan didiamkan selama 10 menit. Absorbansi campuran diukur pada panjang
gelombang 490 nm. Kurva kalibrasi dilakukan dengan mengukur OD larutan baku amonium
dengan konsentrasi 0 sampai 5 mg/L.

Identifikasi Bakteri

Bakteri terpilih diidentifikasi secara molekuler berdasarkan gen parsial 16S rRNA. Teknik
PCR koloni dilakukan dengan menyiapkan campuran (total 30 uL) yang terdiri dari 11 uL
ddH2O (nuclease- bebas air), 15 uL lalu campurkan Green Master 2x, 2 uL 10 pM primer maju
27F (5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'), dan 2 uL 10 pM primer terbalik 1492R (5'-CGG
TTACCTTGTTACGAC TT-3'). Satu koloni bakteri yang tumbuh pada agar nutrisi diambil dan
dimasukkan ke dalam campuran PCR di dalam tabung mikro. Kondisi PCR meliputi langkah-
langkah berikut: inisiasi pada suhu 94°C selama lima menit; 30 siklus denaturasi pada 94°C
selama satu menit, anil pada 55°C selama satu menit, dan ekstensi pada 72°C selama satu menit;
dan pemanjangan akhir pada 72°C selama satu menit. Urutan 16S rRNA dari setiap isolat bakteri
dibandingkan dengan urutan homolog menggunakan BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ). Pohon filum genetik dibangun menggunakan Clustal X
berdasarkan metode Neighbor-Joining.
HASIL DAN DISKUSI

Isolat Bakteri dan Kemampuannya untuk Reduksi Konten Nitrat dan Nitrit

Terdapat 16 koloni bakteri yang diamati secara visual dan dibedakan morfologinya.
Kemampuan masing-masing koloni dalam mereduksi kandungan nitrat dan nitrit disajikan pada
Gambar 1 dan Tabel 1. Warna putih pada pita pada Gambar 1 menunjukkan bahwa kandungan
nitrat (pita di atas) atau nitrit (pita di bawah) semakin berkurang.Dari data tersebut terlihat bahwa
terdapat empat isolat potensial yaitu CNA1, K1NA3, K2NA3, dan PRO4NA1. Kemampuan
mereduksi kandungan nitrit dan nitrat kemudian dikonfirmasi menggunakan metode
spektrofotometer.

Untuk mengatasi keracunan akibat senyawa berbahan dasar nitrogen dilakukan upaya
untuk menurunkan kadar amonium, nitrit, dan nitrat; yang kemudian diharapkan menjadi
molekul nitrogen (N2 ). Karena reaksi kimia pada proses transformasi amonium menjadi nitrit,
kemudian menjadi nitrat bersifat reversibel (Blum dkk., 2018), maka perlu diketahui potensi
isolat bakteri dalam mengubah nitrit menjadi nitrat dan sebaliknya serta mengubah amonium
menjadi nitrit atau nitrat dan sebaliknya.

Metabolisme Nitrit

Dipastikan tiga isolat mampu menurunkan nitrit yaitu K1NA3, CNA1, dan PRO4NA1
(Gambar 2). Namun, salah satu produk metabolisme nitrit adalah amonium (Gambar 3). Pada
larutan nitrit, isolat K1NA3 menghasilkan amonium tertinggi. Namun, metabolisme nitrit pada
isolat ini tidak menghasilkan nitrat (kandungan nitrat tidak diamati, data tidak ditampilkan).

Metabolisme Nitrat

Dua isolat yang dipastikan mampu menurunkan konsentrasi nitrat yaitu K1NA3 dan
PRO4NA1 (Gambar 4). Isolat PRO4NA1 paling tinggi dalam mereduksi nitrat tetapi
menghasilkan konsentrasi nitrit yang lebih tinggi dibandingkan K1NA3 (Gambar 5). Selain
menghasilkan nitrit, metabolisme nitrat dapat menghasilkan ammonium terutama pada isolat
K1NA3 (Gambar 6).
 Metabolisme Amonium oleh Bakteri Konsorsium

Amonium adalah senyawa nitrogen anorganik yang dihasilkan dari pemecahan protein.
Mengingat bakteri dalam suatu ekosistem mengandung limbah bernitrogen yang berperan dalam
siklus nitrogen yang biasanya kompleks, maka kemampuan konsorsium bakteri untuk
menyisihkan amonium dan produk metaboliknya

Gambar 1 : Kertas indikator nitrit nitrat setelah menjatuhkan sampel.

Tabel 1. Kandungan nitrat dan nitrit pada sampel setelah inokulasi dengan isolat bakteri

Isolasi diinokulasi Warna NO3 - kertas indikator setelah Warna NO2 - kertas indikator setelah
NO3 - atau NO2 - sampel dibasahi dengan larutan NO3 dibasahi dengan larutan sampel NO2

Tidak ada isolasi ++ ++

ANA1 ++ +
BNA1 +++ +
BNA2 + +
c`CNA1 - +
CNA2 ++ +
CNA3 + -
CNA4 ++ -
CNA5 +++ ++
K1NA3 - -
K2NAI + ++
K2NA3 ++ -
PRO3NA1 ++ ++
PRO3NA3 +++ +
PRO3NA4 + ++
PRO3NA5 + +
PRO4NA1 - -
Catatan: Adanya NO3 ditunjukkan dengan warna merah jambu, sedangkan NO2 berwarna ungu (+++: kuat,++: sedang, +:
lemah). Tidak terdeteksinya NO2 atau NO3 yang ditunjukkan dengan warna putih (-)
 Saluran penting untuk mengantisipasi akumulasi senyawa nitrogen yang dapat merugikan
organisme seperti nitrit, nitrat atau bahkan N2O dalam efek rumah kaca (Blum et al., 2018).
Gambar 7, menunjukkan bahwa isolat PRO4NA1, campuran bakteri B (CNA1 dan PRO4NA1)
dan campuran keempat isolat dapat menurunkan kadar amonium dalam waktu enam hari. Data
tersebut menggambarkan bahwa penerapan isolat bakteri tersebut pada limbah nitrogen budidaya
air tawar dapat mengurangi amonium yang terkandung di dalamnya. Namun, penurunan tersebut
diikuti oleh akumulasi nitrit (Gambar 8), menunjukkan ketidakefektifan trifikasi deni. Campuran
bakteri dari empat isolat menunjukkan akumulasi nitrit tertinggi. Bagaimana pernah, hingga hari
ke-6, tidak ada nitrat yang diamati (data tidak ditampilkan).

Identifikasi Isolat Bakteri

Amplifikasi PCR empat isolat (K1NA3, K2NA3, CNA1, dan PRO4NA1) berhasil
dilakukan berdasarkan pengamatan pada elektroforesis gel sekitar 1.500 bp. Sekuensing parsial
gen 16S rRNA menghasilkan panjang sekuen berkisar antara 1.005-1.392 bp. Namun demikian,
ini memberikan gambaran umum tentang informasi kesamaan genetik melalui penyelarasan
dengan kumpulan urutan rRNA dari bank Gen NCBI. Analisis BLAST menunjukkan persentase
kemiripan semua isolat adalah 98,20%-99,75% (Tabel 2).

Gambar 2.Kandungan nitrit pada media nitrit yang telah diinokulasi dengan isolat bakteri.
Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05).
Gambar 3. Kandungan amonium pada media nitrit yang telah diinokulasi bakteriisolat.
Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05).

Gambar 4. Kandungan nitrat pada media nitrat yang telah diinokulasi bakteri isolat.
Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05).
 Gambar 5. Kandungan nitrit pada media nitrat yang telah diinokulasi dengan isolat bakteri.
Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05).

Gambar 6. Kandungan amonium pada media nitrat yang telah diinokulasi dengan isolat bakteri.
Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05).

Gambar 7. Kandungan amonium pada media sintetik yang mengandung amonium setelah diberikan isolat dengan inkubasi enam
hari; (A) isolat PRO4NA1, (B) isolat CNA1 dan PRO4NA1, (C) isolat K1NA3, K2NA3, CNA1, dan PRO4NA1. Huruf yang
berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05).
Gambar 8. Kandungan nitrit pada media sintetik yang mengandung amonium setelah diberikan isolat dengan inkubasi enam hari;
(A) isolat PRO4NA1, (B) isolat CNA1 dan PRO4NA1, (C) K1NA3, K2NA3, CNA1, dan PRO4NA1 diisolasi. Huruf yang
berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05).

Analisis filogenetik terhadap 1.000 bootstrap menunjukkan bahwa empat isolat dikelompokkan
menjadi tiga clade yang berbeda (Gambar 9), yaitu Pseudomonas, Acinetobacter, dan Vogesella.

Pseudomonas otitidis pertama kali diisolasi dan diidentifikasi dari spesimen klinis telinga
manusia yang terinfeksi. Sel-selnya berbentuk batang, motil, dan Gram-negatif (Clark dkk.,
2006). Menurut Dahiya & Mohan (2016), P. otitidis merupakan bakteri potensial untuk
pengolahan air limbah. (Dados dkk., 2015; Wu dkk., 2009). Pseudomo nas merupakan anggota
Gammaproteobacteria yang termasuk dalam kelompok bakteri denitrifikasi dengan kemampuan
metabolisme yang beragam (Dados dkk., 2015). Seperti yang dilaporkan sebelumnya, P. otitidis
digunakan untuk pengolahan air limbah (Dahiya & Mohan, 2016), termasuk proses pemindahan
kontaminan, seperti degradasi pewarna dan bioremediasi pada tanah yang terkontaminasi
hidrokarbon (Dados dkk., 2015; Wu dkk., 2009).

Vogesella perlucida adalah bakteri Gram-negatif dan pertama kali diisolasi dari sampel air
dari mata air di Taiwan (Chou dkk., 2008). Analisis filogenetik menunjukkan bahwa CNA1
berada dalam clade yang sama dengan Acinetobacter johnsonii strain ATCC 17909T, yang
menunjukkan penutupan hubungannya dengan strain Acinetobacter haemolyticus ATCC 17906T
Acinetobacter adalah genus bakteri dari kelompok proteobakteri Gamma, tersebar luas di
berbagai ekosistem dengan denitrifikasi aerobik kemampuan (Qin dkk., 2019).Bakteri ini mampu
mereduksi nitrat atau nitrit menjadi N2 dalam kondisi kultur aerobik (Wang dkk., 2020).
 Analisis filogenetik menunjukkan bahwa isolat CNA1 berada dalam clade yang sama
dengan Acinetobacter johnsonii strain ATCC 17909T, yang menunjukkan kekerabatan yang
dekat dengan Acinetobacter haemolyticus strain ATCC 17906T (Gambar 8). Acinetobacter
adalah genus yang tersebar luas di berbagai ekosistem dengan dentrifikasi aerobik

Tabel 2. Hasil analisis urutan BLAST untuk gen 16S rRNA dari gen NCBI bank

Isolate Ketegangan hubungan terdekat Homologi (%)

[Nomor akses]
K1NA3 Pseudomonas otitidis MCC 10330T 99,7
[NR_043289.1]
K2NA3 Pseudomonas otitidis MCC 10330T 98.9
[NR_043289.1]
CNA1 Acinetobacter haemolyticus ATCC 17906T 98.2
[NR_117622.1]
PRO4NA1 Vogesella perlucida DS-28T 99,75
[NR_117622.1]

Gambar 9. Pohon filogenetik urutan 16S rRNA dari empat isolat yang diperoleh dari bioball. Phyloge netic tree dibangun
berdasarkan sekuensing gen 16S rRNA dengan metode Neighbor-Joining. Jarak diperkirakan menurut model dua parameter
Kimura dengan persentase bootstrap setelah 1.000 simulasi. Bilah mewakili perkiraan divergensi urutan 2%. Strain Nitrosomonas
europaea ATCC 25978T digunakan sebagai out-group.
 kemampuan trifikasi (Qin dkk., 2019), dan dapat mereduksi nitrat atau nitrit menjadi N2
dalam kondisi kultur aerobik (Wang dkk., 2020). Pada penelitian ini, isolat CNA1 menurunkan
kadar nitrit, dengan akumulasi amonium yang rendah (Gambar 2 dan 3), tetapi tidak menurunkan
kadar nitrat (Gambar 4). K1NA3 memetabolisme ni trit dan nitrat, serta membentuk amonium.
Menurut Yang et al. (2012), anggota Pseudomo nas merupakan denitrifier yang kuat. Mereka
memiliki enzim trifikasi deni lengkap dan dapat mengkatalisis reduksi nitrat menjadi nitrogen.
Bakteri ini mampu menggunakan oksigen pada ion nitrit atau nitrat ketika tidak ada oksigen
bebas. Metabolisme aerobik ini ditunjukkan dengan kemampuannya mereduksi nitrat menjadi
amonium melalui nitrit (Dahiya & Mohan, 2016).

Pemanfaatan bakteri indigenous pada limbah berbasis nitrogen (amonium, nitrit, dan nitrat)
dalam pengendalian akuakultur masih dianggap relevan. Pada dasarnya pengendalian limbah ini
untuk memfasilitasi konversi amonium menjadi nitrit dan/atau nitrat menjadi gas nitrogen
Bakteri pengurai amonium, nitrit, dan nitrasi memiliki peran penting. Dengan menggunakan
kertas indikator nitrit atau nitrat, bakteri yang mampu memindahkan nitrit dan atau nitrat adalah
Pseudomonas otitidis (K1NA3 dan K2NA3), Acinetobacter cumulans (CNA1), dan Vogesella
perlucida (PRO4NA1). Skrining bakteri aktif pada limbah berbasis nitrogen dipercepat dengan
menggunakan kertas indikator (Gambar 1 dan Tabel 1). Dengan menggunakan metode berbasis
spektrofotometer, bakteri dipastikan mampu menurunkan kadar nitrit (Gambar 2) dan nitrat
(Gambar 4). Kandungan nitrit yang berkurang diikuti oleh pembentukan amonium (Gambar 3).
Hal ini disebabkan proses dissimilasi reduksi nitrit menjadi amonium (DNRA) (Stein & Klotz,
2016). Dua isolat (K1NA3 dan PRONA1) mampu memetabolisme nitrat (Gambar 4) dan
menghasilkan nitrit (Gambar 5) dan amonium (Gambar 6). Tidak ditemukan isolat yang dapat
mengubah nitrit menjadi nitrat yang menunjukkan bahwa oksidasi nitrit menjadi nitrat tidak
berjalan dengan lancar. Namun, DNRA dan oksidasi amonia menjadi nitrit dapat diamati dalam
suatu populasi

Kinerja isolat dalam menghilangkan amonium dalam air limbah sintetik diamati secara
singkat. Kultur Axenic PRONA1 memiliki aktivitas DNRA terendah, begitu juga kultur
komunitas (CNA1 dan PRONA1; dan campuran K1NA3, K2NA3, CNA1, dan PRONA1
seharusnya PRO4NA1) dan mampu mereduksi amonium dalam air limbah sintetik setelah enam
hari. inkubasi (Gambar 7). Metabolisme amonium dalam kultur bakteri campuran menghasilkan
nitrit tertinggi (Gambar 8). Kandungan nitrat tidak terdeteksi. Transformasi amonium, nitrit, dan
nitrat menjadi gas nitrogen merupakan reaksi kompleks yang melibatkan enzim oksi doreduktase
suatu populasi atau komunitas (Ge dkk., 2012; Stein & Klotz, 2016; Zhang dkk., 2019). Faktor
lingkungan abiotik seperti pH, sumber karbon, alkalinitas, dan oksigen dapat mendorong reaksi
(Li dkk., 2016; Dahiya & Mohan, 2016, Zhang dkk., 2019; Ge dkk., 2012).

KESIMPULAN

Empat isolat bakteri, yaitu K1NA3 dan K2NA3, CNA1, dan PRO4NA1, yang mampu
mereduksi nitrit, nitrat, dan amonium berhasil diisolasi dari bioball sistem akuakultur resirkulasi.
Iso lates K1NA3 dan K2NA3 memiliki hubungan paling dekat dengan Pseudomonas otitidis;
CNA1, dan PRO4NA1 masing-masing memiliki hubungan yang lebih dekat dengan
Acinetobacter cumulans dan Vogesella perlucida . Isolat tersebut dapat diaplikasikan untuk
memperkaya bakteri yang efektif menghilangkan senyawa nitrogen pada RAS untuk menjaga
kualitas air yang baik dan mendukung budidaya ikan yang berkelanjutan. Studi lebih lanjut
masih diperlukan untuk memastikan peran bakteri ini dalam pengendalian limbah nitrogen.

PENGAKUAN

Penelitian ini didukung oleh DIPA Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (LIPI) No. 2020-5938.001.

REFERENSI

Barik, P., Ram, R., Haldar, C., & Vardia, HK (2018). Kajian bakteri nitrifikasi sebagai bioremediator
amonia dalam sistem akuakultur simulasi. Jurnal Studi Entomologi dan Zoologi, 6(3), 1200-1206.

Blum, JM, Su, Q., Ma, Y., Valverde-Pérez, B., Domingo-Félez, C., Jensen, MM, & Smets, BF (2018).
Ketergantungan pH dari proses, jalur, dan mikroba enzim pengonversi N: Efek pada produksi N2O
bersih. Mikrobiologi Lingkungan, 20(5), 1623-1640. doi: 10.1111/1462- 2920.14063.

Chou, YJ, Chou, JH, Lin, MC, Arun, AB, Muda, CC, & Chen, WM (2008). Vogesella perlucida sp. nov.,
bakteri non- pigmen yang diisolasi dari mata air. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, (58):2677-2681. https://doi.org/10.1099/ijs.0.65766-0.
Clark, LL, Dajcs, JJ, McLean, CH, Bartell, JG, & Stroman, DW (2006). Pseudomonas otitidis sp. nov.,
diisolasi dari pasien dengan infeksi telinga. Jurnal Internasional Mikrobiologi Sistematis dan
Evolusioner, 56(4):709-714. https://doi.org/10.1099/ijs.0.63753-0.

Dados, A., Omirou, M., Demetriou, K., Papastephanou, C., & Ioannides, IM (2015). Remediasi cepat
tanah yang sangat terkontaminasi hidrokarbon: Perbandingan berbagai pendekatan. Sejarah.
Mikrobiologi, 65(1), 241-251. https://doi.org/10.1007/s13213-014-0856-5.

Dahiya, S. & Mohan, SV (2016). Desain strategis konsorsium sintetik dengan potensi pengolahan air
limbah tertanam: Menguraikan kompetensi isolat dari beragam mikrobioma.Tingkatan terdepan
dalam Ilmu Lingkungan, 4(30), 1-15. https://doi.org/10.3389/fenvs.2016.00030.

Du, J., Tang, C., Qi, W., Qin, Y., & Li, Y. (2015). Pengayaan nitrifikasi dan pengaruh antimicro bials
pada nitrifikasi selama percobaan batch. Jurnal Teknologi Air dan Lingkungan, 13(1), 37-48.
https://doi.org/10.2965/jwet.2015.37

Ge, S., Peng, Y., Wang, S., Lu, C., Cao, X., & Zhu, Y. (2012). Akumulasi nitrit pada suhu konstan pada
proses denitrifikasi anoksik: Pengaruh sumber karbon dan COD/ NO3-N. Teknologi Sumber Daya
Hayati, 114, 137-143. https:// doi.org/ 10.1016/j.biortech.2012.03.016.

Hu, Z., Lee, JW, Chandran, K., Kim, S., Sharma, K., Brotto, AC, & Khanal, SK (2013). Transformasi
nitrogen dalam sistem akuakultur intensif dan implikasinya terhadap perubahan iklim melalui emisi
oksida nitrat. Bioresource Technology, 130, 314- 320. https://doi.org/10.1016/ j.biortech.2012.
12.033.

Khangembam, CD, Sharma, JG, & Chakrabarti, R. (2017). Keanekaragaman dan kelimpahan bakteri
pengurai amonia-oksida dan archaea dalam sistem akuakultur resirkulasi air tawar. Hayati Journal
of Biosciences, 24(4), 215-220. https://doi.org/10.1016/ j.hjb.2017.11.003.

Kumar, P., Lai, SH, Wong, JK, Mohd, NS, Kamal, MR, Afan, HA, Ahmed, AN, Sherif, M., Sefelnasr, A.,
& El-Shafie, A. (2020). Review prediksi senyawa ni trogen pada badan air menggunakan jaringan
saraf tiruan dan model lainnya. Keberlanjutan, 12(11), 4359. https://doi.org/ 10.3390/su12114359.

Li, W., Shan, XY, Wang, ZY, Lin, XY, Li, CX, Cai, CY, Abbas, G., Zhang, M., Shen, LD, Hu, ZQ,
Zhao, HP, & Zheng, P.(2016). Efek alkalisasi diri pada akumulasi nitrit dalam sistem denitrifikasi
tingkat tinggi: Performa, mikroflora, dan aktivitas enzimatik. Penelitian Air, 88, 758- 765.
https://doi.org/10.1016/ j.watres.2015.11.003.
Motamedi, H. & Jafari, M. (2020). Penapisan penghilangan amoniak erotrofik dan bakteri trifikasi deni
aerobik dari air limbah unit produksi amoniak industri petrokimia. Kur. Mikrobiol., 77, 2207-2214.
https://doi.org/10.1007/ s00284-020-02065-5.

Qin, J., Maixnerová, M., Nemec, M., Feng, Y., Zhang, X., Nemec, A., & Zong, Z. (2019). Acinetobacter
cumulans sp. nov., diisolasi dari limbah rumah sakit dan mampu memperoleh beberapa gen
resistensi antibiotik. Mikrobiologi Sistematis dan Terapan, 42(3), 319-325. https://doi.org/10.1016/
j.syapm.2019.02.001.

Rassamee, V., Sattayatewa, C., Pagilla, K., & Chandran, K. (2011). Pengaruh kondisi oksik dan anoksik
pada emisi dinitrogen oksida dari proses nitrifikasi dan denitrifikasi. Bioteknologi dan Bioengi
neering, 108(9), 2036-2045. https://doi.org/10.1002/ bit.23147.

Shitu, A., Liu, G., Zhang, Y., Ye, Z., Zhao, J., Zhu, S., & Liu, D. (2021). Peningkatan budidaya laut
pengolahan air limbah menggunakan reaktor biofilm unggun bergerak yang diisi dengan biocarrier
yang dimodifikasi : Karaketvearliusasii ,kokimneurnjaitapsromsieksrodbaan. Jurnal Manajemen
Lingkungan, (291): 112724. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2021.112724.

Stein, LY & Klotz, MG (2016). Siklus nitrogen. Biologi Saat Ini, 26, 93-110. https://doi.org/10.1016/
j.cub.2015.12.021.

Wang, Y., Zou, YL, Chen, H., & Lv, YK (2021). Kinerja penyisihan Nitrat dari denitrifier aerobik baru,
Acinetobacter haemolyticus ZYL, diisolasi dari air limbah domestik. Rekayasa Bioproses dan
Biosistem, 44(2), 391-401. https://doi.org/10.1007/ s00449-020-02451-0.

Wu, J., Jung, BG, Kim, KS, Lee, YC, & Sung, NC (2009). Isolasi dan karakterisasi Pseudomonas otitidis
WL-13 dan kemampuannya untuk mendekolorisasi zat warna triphenylmethane. Jurnal Ilmu
Lingkungan, 21(7), 960-964. https://doi.org/ 10.1016/S1001-0742(08)62368-2.

Yang, X., Wang, S., & Zhou, L. (2012). Pengaruh sumber karbon, rasio C/N, konsentrasi nitrat dan
oksigen terlarut terhadap produksi nitrit dan amonium dari proses denitrifikasi oleh Pseudomo nas
stutzeri D6. Teknologi Bioresource, 104, 65-72. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2011.10.026.

Zhang, Y., Wang, X., Wang, W., Sun, Z., & Li, J. (2019). Investigasi kinetika pertumbuhan dan kinerja
denitrifikasi parsial pada galur Acinetobacter johnsonii di bawah kondisi lingkungan yang berbeda.
Ilmu Terbuka Royal Society, 6(12). https://doi.org/ 10.1098/rsos.191275.