MAKALAH INSTRUMENTASI II

“ELEKTROFORESIS”

Nama :Viktorial rudika Tanggela

Nim : 530333318 785

Kelas/Kelompok : 1A/3

PROGRAM STUDI ANALIS KESEHATAN

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENTRIAN KESEHATAN

KUPANG

2019

1
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa
karena atas berkat, bimbingan dan rahmat-Nya, sehinga penulisan makalah
dengan judul “Elektroforesis” dapat di selesaikan dengan baik. Penulis
menyadari bahwa tersusunnya makalah ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan,
dan petunjuk dari berbagai pihak.

Penulis berharap agar makalah ini dapat berguna dan menambahkan

wawasan serta pengetahuan kita mengenai Elektroforesis.Penulis juga menyadari
bahwa didalam penyusunan makalah ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh
karena itu, segala kritik dan saran yang bersifat positif dan membangun dari
berbagai pihak sangat penulis harapkan demi mendapatkan kesempurnaan dalam
penulisan makalah ini.

Kupang,7 mei 2019

Penulis

2
 DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR………………………………………….............. 2

DAFTAR 3
ISI…………………………………………………………….

BAB I. PENDAHULUAN…………………………………………….. 4

1. Latar Belakang……………………………………………….... 4
1

1. Rumusan Masalah…………………………………………….. 5
2

1. Tujuan…………………………………………………............. 5
3

BAB II. PEMBAHASAN…………………………………………......... 6

2. Prinsip dan Teori Elektrofores……………………………… 6

1

2. Jenis-Jenis elektroforesis……………………………................ 14
2

2. Instrument elektroforesis…………………………………...... 26
3

3
 2. Kelebihan dan Kekurangan Elektroforesis........................ 33
4

BAB III. 35
PENUTUP……………………………………………………..

3. Simpulan………………………………………………………... 35
1

3. Saran ………………………………………………………....... 35
2

DAFTAR PUSTAKA………………................................................. 36

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia

karena kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk
memperoleh materi murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu
pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan
campuran .

4
 Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara
berkermbang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang
semakin marak di bidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan
di bidang Biologi Molekuler. Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini
telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode elektroforesis ditemukan dan
dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi
(Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya metode elektroforesis ini
mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian yang
menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-
molekul yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet,
Quincke, Hardy. dalam Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988)
elektroforesis berasal dari bahasa Junani yangmempunyai arti transport atau
perpindahan melalui partikel-partikel listrik.

Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh

ilmuwan Swedia Arne Tiselius. ia memisahkan protein serum sesuai dengan
chanrge mereka dalam tabung berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan
lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi hadiah nobel pada tahun 1948. Hari
elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gel elektroforesis
dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang
digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih
baru pada 1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan
metode yang berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan industri .
banyak modus yang berbeda elektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan
baik dalam gel dan capilaries. fokus di sini adalah set pada teknik yang sering
digunakan untuk analisis DNA dan protein.

1.2 Rumusan Masalah

a. Apa prinsip dan Teori dari elektroforesis?

b. Apa jenis-jenis dari elektroforesis?

5
 c. Bagaimana instrumen dari elektroforesis?
d. Bagaimana kelebihan dan kekurangan elektroforesis?

1.3 Tujuan
a. Mengetahui prinsip dan teori elektroforesis.
b. Mengetahui Jenis-Jenis Elektroforesis.
c. Mengetahui Instrumen dari Elektroforesis.
d. Mengetahui kelebihan dan kekurangan elekroforesis.

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Prinsip dan Teori Elektroforesis

Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas

analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat
diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk
protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan

6
pada analisis serta skala preparatif. keuntungan utama atas metode khromatografi
cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari pemisahan elektroforesis. hal ini
terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al, 2010)

Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau molekul

dalam medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan. media
konduktif biasanya buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run
penyangga. campuran analit dimasukkan ke dalam medium yang mengandung
jangka penyangga dan medan listrik diterapkan. Dalam contoh yang ditunjukkan
pada gambar 2.1 campuran analit mengandung molekul bermuatan negatif.
berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai bergerak menuju
elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan mobilitas
yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda.
sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam medan listrik
diterapkan.(Andreas Manz, et.al, 2010)

Gambar.. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al, 2010)

Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam

larutan yang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau
poliakrilamid gel. gratis pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit
digunakan. pemisahan ion analit terjadi karena perbedaan dalam mobilitas,
perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit hanya dapat dipisahkan
jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran. pemisahan analit

7
dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel
memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang
lebih kecil. ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya
dua rasio ukuran yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam
ukuran. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Secara luas teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni elektroforesis
free boundary, elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008).

Prinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial,
fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau
anoda sesuai dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan
suatu ketidakhomogenen atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid,
protein enzim menunjukan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik
yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat
dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan
bercampur kembali akibat serkulasi konvektif. Keterbatasan elektroforesis free
boundry dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan
sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Ini dilakukan dengan mencampurkan
larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian
biarkan menyerap vertikal pada tabung elektroforesis yang akan digunakan,
sehingga terbentuk gradien perbedaan kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain
bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah
perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradien kerapatan dan temperatur. Pada
medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat
dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin,
butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga-rongga kapiler.
Kertas penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang
sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakuakan baik
horizontal maupun vertikal dan interferensi anomali paling kecil pada boundary.

8
Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan
berdasarkan perbedaan transfor fisik zat terlarut yang bermuatan didalam medium
kertas akibat pengaruh gradien potensial (Kopkar, 2008).

Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-

partikel bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan
bergerak kekutub positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif
akan bergerak kekutub negative (katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak
. Jadi medan listrik menyebabkan pemisahan pada metode elktroforesis. (Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006)

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik
dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut
akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul
tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada
bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang
terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
lingkungan(Ricardson dkk. 1986):

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah
medan listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Menurut Titrawani 1996
ektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan
molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik).
Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar
muatan dan sifat kimia dari molekul. Menurut Ricardson dkk 1986 Pemisahan
dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang
dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu
medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen- komponen
protein tersebut akan mulai bermigrasi (Ricardsondkk. 1986).

9
 Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan
besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan,
konsentrasi elekrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut
dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada
suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah
yang berlawanan. Lintasan yang ditempuh oleh suatu partikel bermuatan sesuai
dengan :

Ute U ,V
d = qk = L (persamaan 2.1)

dimana V= tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U

= Mobilitas ion pada saat t,q = Luas penampungan dan d = Lintasan yang
ditempuh (Kopkar, 2008).

Efisiensi pemisahan elektroforesis diatur oleh dua faktor utama: mobilitas

elektroforesis analit dan aliran elektroosmosis (EOF) dari solusi missal .(Andreas
Manz, et.al, 2010)

a. Mobilitas elektroforesis

Mobilitas elektroforesis μep merupakan parameter spesifik untuk senyawa

yang diberikan. menentukan dari kecepatan suatu senyawa dalam medan listrik
diterapkan. senyawa dengan berbeda dapat dipisahkan satu sama lain.

Ketika pertukaran ion q diposisikan kedalam medan listrik E,

pengalamannya sebuah gaya listrik Fef:
Fef = q.E (persamaan 2.2)

Gaya listrik mempercepat ion yang bermuatan positif menuju electrode

negative (katoda). Ion yang bermuatan negative dipercepat menuju elektroda
negative (anoda). Pergerakan ion ditentang oleh gaya gesekan, Ffr dari molekul
menengah. gaya ini berbanding lurus dengan jari-jari ion, r dan kecepatan migrasi
elektroforesis, Vep serta viskositas medium, ἠ. (Andreas Manz, et.al, 2010)

10
 Ffr = 6 . ἠ . π . r. Vep (persamaan 2.3)
Pada gaya listrik yang konstan, keseimbangan tercapai antara gesekan dan
gaya listrik (persamaan 2.4), maka partikel ion bergerak dengan kecepatan
konstan, Vep (persamaan 2.5).
Fef = Ffr (persamaan 2.4)
Vep = q.E (persamaan 2.5)
6. ἠ.π.r
Mobilitas elektroforesisμep didefinisikan sebagai rasio dari kecepatan
migrasi Vep atas kekuatan medan elctric, E (persamaan 2.6). μep lebih sering
digunakan daripada VEP untuk menggambarkan migrasi ion.
μep = Vep / E = q.E (persamaan 2.6)
6. ἠ.π.r

Untuk media pemisahan diberikan viskositas adalah konstan. maka

mobilitas elektroforesis μep menjelaskan biaya untuk rasio ukuran q / r. seperti
yang disebutkan sebelumnya, dua spesies ion dapat dipisahkan satu sama lain atas
dasar rasio q / r, ketika mereka bergerak dengan kecepatan yang berbeda dalam
medan listrik. perubahan pH penyangga mengubah muatan suatu analit dan
dengan demikian elektroforesisnya. (Andreas Manz, et.al, 2010)

b. Aliran elektroosmosis (EOF)

Banyak bahan yang digunakan untuk pemisahan elektroforesis seperti

kaca, menyatu silika dan agarosa pameran biaya permukaan. untuk pemisahan
yang paling bioanalitik, pH buffer dasar sehingga ion analit bermuatan negatif
yang dihasilkan. Kelompok Silanol (-SiOH) pada permukaan kapiler memisahkan
jika pH> 4. Oleh karena itu, permukaan kapiler menjadi negatif . Ini
menyebabkan perbedaan potensial antara permukaan kapiler dan solusi massal.
(Andreas Manz, et.al, 2010)

Dalam penerapan medan listrik kation dilapisan difus bergerak menuju katoda
dan tarik solusi massal dengan mereka. gerakan ini dari solusi massa disebut
aliran elektro osmosis. Dalam elektroforesis gelphenomenonofEOF juga disebut

11
sebagai electro endo osmosis. Kecepatan dari EOF ,VEOF berbanding lurus dengan
konstanta dielektrik dan potensizeta, dari buffer serta kekuatan medan listrik
diterapkan, E.Veof berbanding terbalik dengan viskositas buffer pemisahan.

ε .ᶊ. E
VEOF = 4 . π .ἠ
( persamaan 2.7)

μEOF = VEOF / E (persamaan 2.8)

Seringkali arah mobilita selektro osmosis dari solusi massal adalah melawan arah
darii onanalit. Ini adalah karena bagi kebanyakan pemisah anbio meleculari
onanalit bermuatan negatif dan akan diseret kearah anoda sedangkan EOF
diarahkan katoda.

Profil aliran EOF memiliki bentuk plug. kecepatan aliran identik atas selurh
diameter kapiler , kecuali untuk bergerak lebih lambat lapisan difus dekat dengan
dinding kapiler. Distribusi kecepatan homogeneus meminimalkan pelebaran pita
dan dengan demikian meningkatkan efisiensi pemisahan. situasiyang sangat
berbeda terjadi dengan tekanan aliran didorong digunakan dalamC hromatografy
cair.disini profil aliran parabola kecepatan aliran memiliki distribusi besar atas
diameter kolom. Analit dalam arus tengah jauh lebih cepat dari pada analit lebih
dekat kedinding saluran.Hasil ini dalam pelebaran pita dan hilangnya efisiensi
pemisahan.

Kontrol EOF

Dalam kapiler, eof dapat dikontrol oleh: 1). beroperasi pada pH rendah, 2).
permukaan kimia modification, 3). pelapisan dinamis dinding kapiler misalnya
dengan lapisan polimer atau, 4). menggunakan aditif yang mengubah viskositas
1). Biaya permukaan dinetralkan dengan mengoperasikan atapH cukup rendah
untuk protonate kelompok silanol. ini namun hanya terjadi pada pH, 4, pHdi mana
banyak biomolekul tidak stabil.
2). Modifikasi kimia dari gugus silanol pada dinding kapiler dapat dilakukan
untuk membuat mereka sangat hydophilic atau sangat hidrofobik. permukaan

12
hidrofilik, diperoleh dengan pengobatan dengan asam sulfonat, mempertahankan
konstan, EOF tinggi. kelompok fungsional hidrofobik melekat memimpin
permukaan penekanan EOF. masalah dengan modifikasi kimia adalah bahwa
stabilitas jangka panjangnya sering sangat redah.
3). Alternatif adalah lapisan dinamis dinding saluran dengan menambahkan
polimer seperti polietilena glikol (PEG) ke bufferrun. lapisan polimer kental
terbentuk pada dinding kapiler,yang topeng biaya dan menekan EOF.
4). Aditif netral seperti hidroksil etil selulosa atau Polyvinil alkohol meningkatkan
viskositasbuffer menjalankan dan dengan demikian mengurangi kecepatannya.
Selanjutnya, mereka menekan interaksi permukaan analit. sama, pelarut organik
seperti asetonitrilmetahnol dan dapat digunakan untuk mengurangi atau
meningkatkan viskositas masing-masing. surfaktan kationik seperti
dedocyltrimetilamonium bromidamenyerapkedindingcapillarlydandengan
demikian mengubahmuatan permukaan. inimembalikkanarahEOF.
surfaktanharusdigunakanpada konsentrasi
rendahuntukmenghindaripembentukanmisel, yangdapatmenggangguproses
pemisahan.
c. Efisiensi Pemisahan dan Resolusi

Efisiensi dan resolusi pada pemisahan elektroforesis dipengaruhi oleh aliran

elektroforesis (EOF). mobilitasnyata

μappdarisuatuanalitditentukanolehjumlahdarimobilitaselektroforetiknyaμep dan
mobilitaselektroosmosisμEOF.(Andreas Manz, et.al, 2010)

μapp = μep + μEOF (persamaan 2.9)

Jika EOF mendominasi gerakan elektroforesis, maka semua komponenan alit

bergerak menuju katoda. mereka dipisahkan dari satu sama lain karena perbedaa

nmereka dalam mobilita sjelas. Kation memiliki μapp tertinggi karena mereka

berada diarah yang sama dengan μEOF. Spesies netral tidak memiliki μep.

13
Karenanya mereka diseret pada kecepatan dari solusi massal.Anion mencapai

katoda terakhir, μepnya menentangarah μEOF.

Kecepatan perpindahan ,V pada analit didefinisikan sebagai produk dari

mobilitas nyatanya , μapp, dan peranan kekuatan medan listrik, E (persamaan 2.8).
kekuatan medan, E, adalah perbandingan dari voltase, V, panjang kapiler, L.
Karena itu v, dapat dijelaskan sebagai:

v = μapp . E = (μep + μEOF ) . V/L (persamaan 2.10)

Dalam teori jutaan pelat teoritis per meter bisa kita dapatkan dengan
elektroforesis membuat teknik ini unggul dari LC, di mana jumlah plate per
kolom biasanya di urutan sepuluh ribu. Dalam prakteknya, bagaimanapun, plat
nomor yang lebih rendah diamati pada elektroforesis. pelebaran pita disebabkan
oleh injeksi sampel dan adsorpsi analit pada matriks pemisahan yang mengarah ke
plat nomor di urutan ratusan ribu ketimbang jutaan .

Resolusi, Rs, antara dua ion tergantung dari perbedaan dalam mobilitas

elektroforesis antara dua spesies, ∆μep (yaitu selektivitas pemisahan), tegangan

pemisahan,V, mobilitas elektrofoersis nyata, μapp , dan koefeisien difusi, D.

√
1
Rs = ∆μep . √ V . 1
μ app
. 4 . √2 D
(persamaan 2.14)

Cara terbaik untuk mengoptimalkan resolusi elektroforesis, Rs adalah

untuk meningkatkan selektivitas pemisahan∆μep. ini dapat dicapai misalnya
dengan mengubah pH buffer run atau dengan mengubah modus electroporesis.
meningkatkan tegangan pemisahan, juga meningkatkan resolusi. resolusi tinggi
untuk molekul besar seperti ini memiliki koefisien difusi yang kecil

2.2 Jenis – Jenis Elektroforesis

14
 Metode elektroforesis merupakan salah satu metode pemisahan
konvensional yang telah mengalami perkembangan teknik dan metode yang lebih
canggih atau modern sebagai penyempurnaan dari metode koinvensional yang
sebelumnya. Adapun jenis-jenis elektroforesis yang dikenal 2 (dua) kelompok
teknik elektroforesis, yaitu:
a. Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak /
moving boundary)
Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik
isoelektrik suatu protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh
larutan dan posisinya sebagai fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini adalah
mahal dan pemamfaatan kurang.
b. Dengan pengemban padat atau matriks seperti:
- Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah)
- Elektroforesis Kertas
- Elektroforesis selulosa asetat
- Elektroforesis gel
1. Elektroforesis Zone (Elektroforesis Wilayah)
Elektroforesis wilayah, ada berbagai faktor yang mempengaruhi laju
perpindahan elektroforesis wilayah, faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan
ion-ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinnya, macam larutan buffernya, pH yang
digunakan, kuat ion zat terlarut, temperatur, ada atau tidaknya fenomena
elektroforesis atau elektroosmosis. Medium yang umum digunakan adalah kertas
saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrelimida dan bubuk gel (Kopkar,
2008).
Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat,
penentuan komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan
perubahan mobilitas atau konformasi.
2. Elektroforesis Kertas
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan
biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular
DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith

15
mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan
zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida
2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan
yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya
yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA
terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan
‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki
kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis
ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung
alat elektroforesis.

Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran

kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya
perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara
(intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-
monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas
saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis
komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan
mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion
kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang
system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau
valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi
elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.

3. Elektroforesis Tirai (elektroforesis kontinu),

Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara
kontinu. Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam suatu
larutan buffer. Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel

16
masuk dalam aplikator dari suatu resevoir sampel. Kedua ujung kertas saring
dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda.

4. Elektroforesis Gel (GE)

Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi

molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam
matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul
sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR,
kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode
karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk
memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau
oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,
dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang
memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam
nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang
digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur

(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel
ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,
arah pergerakan adalah menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif

17
alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju
perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk
menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi
dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan

(staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida,
perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk
keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya
setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet.
Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut
dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak
setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari
"sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis
mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis
dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul
tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan
campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk
menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis
marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur
marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan
ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma
ukuran molekul.

DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel

agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan
elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus
diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.

18
 DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di
medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif.
Pergerakan kecepatannya tergantung dari :

a. Ukuran molekul DNA

b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan

penyangga muatan perwarnaloadingbuffer (dye), yang berfungsi untuk :

1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari

sumur
2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam
sumur.
3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen

DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda
ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.
Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai
berikut.

a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda,

mengetahui susunan sekuens berbagai genom
b. DNA Fingerprinting
c. Mendeteksi kelainan genetik.
d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan
tertentu
e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel
organisme atau percobaan perlakuan gen
f. Mempelajari evolusi tingkat molecular
g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam

19
 h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan
protein tertentu.
i. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
j. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan
DNA plasmid
k. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR

Dalam elektroforesis gel, pemisahan terjadi dalam media hidrogel elektrik

non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid (PA) yang berisi, buffer
elektrolit. pori-pori fungsi gel molekuler saringan, yang menghambat molekul
bermigrasi menurut ukuran mereka. Selanjutnya, gel bertindak sebagai media
pendukung anticonvective, yang dapat meminimalkan difusi dari molekul sampel,
dan dengan demikian mengurangi pelebaran pita. karenanya, nomor plat tinggi
dan resolusi tinggi dapat dicapai, terutama untuk molekul berat molekul tinggi
seperti DNA atau protein.a jumlah yang sangat besar senyawa karenanya dapat
dipisahkan dalam bentuk tunggal .. sebagai EOF ditekan dalam elctroporesis gel,
hanya analit dengan muatan bersih dapat dipisahkan. senyawa netral tidak
bermigrasi melalui gel bawah pengaruh medan listrik diterapkan. elektroforesis
gel adalah agak lambat dan tenaga kerja - metode intensif, yang tidak mudah
otomatis.

Sejumlah mode pemisahan yang mungkin. Dalam gel native elektroforesis

dibebankan analit dibedakan menurut mobilitas jelas mereka, dan ukuran. natrium
dedocylsulfate-poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) analit diperlakukan
sedemikian rupa sehingga mereka semua menunjukkan muatan yang sama untuk
sixe rasio. maka mereka hanya dipisahkan oleh perbedaan ukuran mereka.

Gel Media

Elektroforesis Gel poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang

umum digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu :
mudah atau cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul
biologic, biaya pemisahan yang sangat besar.

20
 Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat
dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary
electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik
elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul
ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi
dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari
molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis
daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa
dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose
poliasetat. Adapaun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah
disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan
vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena
mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat
sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan
pemisahan yang lebih baik.

Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida

dan menganalisis pemanjangan primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151).

Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa yang

dapat diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa
dilarutkan dalam buffer yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan
dituangkan ke dalam tangki elektroforesis. pada pendinginan gelasi terjadi. pori-
pori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm konsentrasi 1% (10 mg mL-1)

21
sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1). pori-pori besar hanya
terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam nukleat. untuk
sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive.

Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen cross-

linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih. ukuran
pori dan sifat pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada konsentrasi total
serta tingkat silang C%

Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor

sebagaberikut:

1. Ukuran molekul DNA.

Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak
yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.

2. Konsentrasi gel.
Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul
DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA
berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah
mempermudah molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.
3. Bentuk Molekul

Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat
melewati gel.

4. Densitas muatan
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan
molekul dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan
per unit volume molekul.
5. Pori-pori gel.

22
 Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati
gel, sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh
molekul DNA.
6. Voltase.
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal
tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.
7. Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik
sehingga migrasi DNA akan lebih cepat.

5. Elektroforesis Kapiler (CE)

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk

memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan
resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.Elektroforesis
kapiler merupakan pengembangan konsep elektroforesis konvensional. Konsep
dasar elektroforesis kapiler adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan
sebagai partikel bermuatan (ion), baik bermuatan positif (kation) maupun
bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan kepada larutan molekul
bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju elektroda yang
berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju anoda.
Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya

kertas atau gel yang masing-masing ujung tercelup dalam larutan buffer. Cuplikan
berupa campuran (misalnya campuran protein) diteteskan pada bagian tengah
media tersebut. Salah satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda platina
atau batang karbon dengan kutub negatif arus searah dan larutan buffer lainnya
dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub positif
arus searah. Oleh karena itu komponen-komponen campuran bermuatan listrik
maka komponen-komponen campuran tersebut bermigrasi ketika arus listrik

23
searah dialirkan. Komponen-komponen yang bermuatan positif bergerak menuju
katoda (kutub negatif). Sebaliknya komponen-komponen yang bermuatan negatif
bergerak menuju anoda (kutub positif). Sedangkan komponen-komponen yang
netral tidak bergerak. Hasil pemisahan elektroforesis konvensional ditunjukan
oleh adanya noda-noda berwarna sepanjang media pemisah(Sumar Hendayana,
Ph.D, 2006).

Elektroforesis konvensional mudah dilakukan menggunakan peralatan

sederhana. Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang
satu dengan yang lain kadang-kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih
sebagai akibat dari noda-noda tersebut yang terlalu melebar. Kendala lain dari
elektroforesis konvensional ini adalah tidak dapat mendeteksi konsentrasi
cuplikan yang rendah. Selain itu waktu yang diperlukan untuk melakukan satu
analisis terlalu lama. Untuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan dengan cara
menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini
disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga
menurunkan efisiensi pemisahan(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Elektroforesis konvensional nampaknya tidak dapat diharapkan lebih

banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan
campuran yang lebih komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang
sangat sedikit dengan konsentrasi sangat rendah. Untuk menanggulangi kendala-
kendala yang terdapat pada elektroforesis konvensional ini maka telah diadakan
modifikasi peralatan dan muncullah istilah elektroforesis kapiler(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

Aliran Elektroforentik.

Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan,
kation akan bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan
bergerak menuju anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak

24
akan bergerak. Aliran ion-ion menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut
aliran elektroforetik yang diperlihatkan dalam gambar 2. Aliran elektroforetik
inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam elektroforesa klasik (Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

Aliran elektroosmotik.

Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan
media kertas atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan
buffer dipakai sebagai pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut
berkontak dengan larutan dalam air maka permukaan gelas akan dilapisi anion
(SiO-) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika dengan air sehingga permukaan
pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-kation yang berasal dari
buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan kedua pada
permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan
diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan
pipa kapiler tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan
kation yang cepat ke katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran
elektroosmotik diilustrasikan dalam gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan lebih

dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian secara
keseluruhan aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam kenyataannya
semua molekul baik yang bermuatan maupun netral akan terbawa ke katoda.
Tentunnya ion positif (kation) bergerak menuju katoda paling cepat karena aliran
elektroforetiknya searah dengan aliran elektroosmotik. Molekul netral menepati
urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling lambat karena aliran
elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar Hendayana,
Ph.D, 2006).

Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen

elektroforesis kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami
konsep gerakan ion-ion atau molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu

25
analogi. Aliran elektroosrnotik dapat dianalogikan sebagai aliran sungai yang
deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan sebagai ikan yang sedang berenang
ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan sebagai ikan yang
sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai ikan
mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam
sungai akan menuju ke hilir.

Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda

dipengaruhi oleh medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut

V = μef E + μeo E (persamaan 2.15)

V menyatakan kecepatan solut menuju katoda, μef adalah mobilitas elektroforetik,

μeo adalah mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

Efisiensi Elektroforesis kapiler.

Seperti dalam kromatografi moderen, efisiensi (N) merupakan faktor

penentu keberhasilan pemisahan. Oleh karena itu keluaran elektroforesis kapiler
menyerupai kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indikator efisiensi,
semakin tajam suatu peak semakin efisiensi pemisahan tersebut. Selain efisiensi
pemisahan elektroforesis dapat dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC,
efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dinyatakan dengan formula
berikut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

( μef + μeo) E
N= 2D (persamaan 2.16)

Seperti dalam persamaan, μef menyatakan mobilitas elektroforetik, μef

menyatakan mobilitas elektroforentik, μeo adalah mobilitas elektroosmotik, E
adalah tegangan listrik yang diberikan, dan D adalah koefisien difusi solut(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

26
Berdasarkan persamaan diatas, efisiensi ditentukan oleh tegangan listrik dan
koefisien difusi. Semakin besar tegangan listrik yang diberikan maka semakin
efisien pemisahan. Oleh karena itu, tegangan listrik yang dialirkan ke dalam
sistem elektroforesis sangat besar (10.000-30.000 V). Molekul kecil akan lebih
cepat berdifusi lambat atau D besar, sebaliknya molekul besar akan terdifusi
lambat atau D kecil. Efisiensi pemisahan (N) dalam elektroforesis kapiler
berbanding terbalik dengan koefisien difusi (D). Semakin kecil koefisien difusi
maka semakin besar harga N. Artinya, pemisahan elektroforesis akan semakin
baik untuk molekul-molekul yang besar. Gambar 4 terlihat bahwa harga N naik
tajam dengan kenaikan tegangan listrik hingga mencapai 20 kv dan mencapai
puncaknya pada 30 kv. Pemberian tegangan yang terlalu tinggi (>30 kv) tidak
menyebabkan kenaikan harga N lagi. Hal ini disebabkan sistem tidak dapat lagi
menghilangkan panas yang ditimbulkan oleh tegangan tinggi. Ingat, rendahnya
efisiensi dalam elektroforesis konvensional diaktivkan oleh panas yang
ditimbulkan oleh tegangan listrik yang tinggi(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

2.3 Instrumentasi Elektroforesis

1. Elektroforesis Gel

Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan thermostat

pendingin dan komponen utama yang diperlukan untuk elektroforesis gel.
pemisahan dapat dilakukan secara vertikal atau horizontal. catu daya memberikan
tegangan typi xallally 200-500 V dengan arus listrik cof 400 Artikel Baru 100.
elektroda dicelupkan ke dalam waduk penyangga di setiap sisi gel. untuk sebagian
pemisahan biomolekuler, pH Sochen bahwa analit bermuatan negatif. sehingga
analit bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk
melindungi pengguna dari tegangan tinggi .

Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit.

gel vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex dengan 0,5

27
sampai 1 cm id dan 3 sampai 10 cm panjangnya. alternatif gel dapat berperan
sebagai lempengan persegi panjang tipis di mana beberapa sampel dapat
dijalankan secara paralel. gel slab dapat dipolimerisasi pada foil lembam untuk
pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam tangki vertikal. ketebalan gel slab
adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang dan lebar sekitar 8cm x 8
cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya digunakan.

Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa solusi

kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di
upper reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama pengecoran dengan
menggunakan sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk dari sampel sumur,
bergerak analit dalam bentuk pita yang sempit dan lebar

Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol temperatrue

memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka membantu untuk
mengusir panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi termal. Pemisahan
dapat memnggunakan waktu beberapa jam. setelah selesai gel dihapus dari
pemegangnya. Pita analit daripada divisualisasikan, biasanya dengan pewarnaan.

Gambar 2.7 Bentuk –bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk

horizontal; c. bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010)

28
Preparasi Sampel Dan Sistem Buffer

Contoh ini dilarutkan dalam larutan kepadatan tinggi, biasanya mengandung

gliserol dan diterapkan pada sumur sampel. untuk menghindari pemblokiran untuk
gel sampel pori-pori harus tidak mengandung partikel padat. konsentrasi tinggi
dan garam dan penyangga dalam sampel dapat mengganggu pemisahan
elektroforesis. maka harus dijaga agar tetap minimum, biasanya, 50 nm. jumlah
sampel yang diperlukan tergantung pada metode deteksi, jumlah khas di ordee g.
yang volume sampel tergantung pada ukuran sampel juga, yang bisa berkisar dari
L ke Ml

Visualisasi Dan Deteksi

Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan pewarnaan

dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan commomly
digunakan adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan alkohol
asam ini temperatur tinggi pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam, pewarna
Kelebihan ini kemudian dihapus oleh jumlah mencuci langkah. Deteksi batas
untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1. pewarnaan perak lebih sensitif dengan
batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip dengan protografhy

Metode Gel Elektroforesis

A. Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS – PAGE)

Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan ukuran

protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan adanya
deterjen anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya
melibatkan pemanasan protein pada temperature 95 0C. dengan adanya SDS yang

berbih dan agen tiol-reducing seperti ᵝmercapto etanol. Hasilnya lengkap

diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan tersier. Molekul melintang melalui
jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino

B. Isoelektrik Focussing (IEF)

29
Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic seperti
protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan untuk
pemisahan dan pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis serta
skala preparatif. Gel agarose dan PA keduanya digunakan pada metode IEF.

C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)

Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel tunggal.

Bagian yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi, berikutnya
yang lain akan terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode ini,
pencampuran seribu protein atau asam nukleat dapat dipisahkan dengan resolusi
yang tinggi. Hasil fingerprint dapat dibandingkan dengan database elektronik.
Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk mereproduksi dan metode ini secara
teknis menantang membutuhkan pengalaman personil dalam operasi.

2. Instrumen Elektroforesis Kapiler

Instrumentasi elektroferesis kapiler diperhatikan pada gambar 2.8, yang terdiri

dari beberapa komponen yaitu pipa kapiler, larutan buffer, detektor dan
rekorder(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar Diagram instrumentasi elektroforesis Kapiler

Pipa Kapiler.

Media pemisahan kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvesional diganti

dengan pipa kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara

30
25-100 μm dan panjang antara 50-100 cm. Dimensi pipa kapiler, diameter dan
panjang ternyata mempengaruhi efisiensi (N) pemisahan elektroforesis kapiler.

Gambar Pengaruh diameter pipa kapiler terhadap efisiensi (N)

elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Semakin kecil ukuran dimeter pipa kapiler maka semakin besar harga N
(pada gambar 6) oleh karena itu, semakin besar diameter (> 100 m) maka
pemisahan semakin tidak efisien.

Buffer.

Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler
tersebut tercelup dalam larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit
untuk menghantarkan arus listrik juga berfungsi pengontrol muatan molekul.
Karena sutu molekul dapat bermuatan positif, negatif atau netral bergantung pada
pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dapat menahan pH. Dengan kata lain,
pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan elektroforesis.

Sumber arus.

Dalam elektroforesis konvensional dialirkan arus searah sekitar 100 Volt

tapi dalam elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertentangan sangat tinggi
10.000-30.000 Volt seperti pada persamaan, bahwa kecepatan solut menuju
katoda berbanding dengan tegangan listrik. Oleh karena itu tidaklah
mengherankan bahwa eksperimen elektroforesis kapiler dapat dilakukan dalam
beberapa menit sementara eksperimen elektroforesis konvesional dilakukan
mungkin dalam sehari. Selain itu, tegangan listrik yang tinggi mempengaruhi
efisiensi pemisahan dalam elektroforesis kapiler, seperti pada gambar 4.

Sistem Pemasukan Cuplikan

31
 Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung
pipa kapiler yang tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam
pipa kapiler dapat dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan tekanan dan
elektrokinetika yang masing-masing dapat diformasi dengan persamaan.

∆ pπ 4 tC
Q= 8 ηL (persamaan 2.17)

Q=¿ (persamaan 2.18)

Q adalah jumlah cuplikan yang disuntikan, P adalah beda tekanan di antara kedua
ujung pipa kapiler, r adalah jari-jari pipa kapiler, t adalah lamanya pengaliran
tegangan listrik, C adalah konsentrasi cuplikan, η adalah visikositas, μef dan , μeo,
kuata rus, dan L adalah panjangh pipa kapiler. Bila ujung pipa kapiler dicelupkan
ke dalam cuplikan maka dengan gaya kapilaritas cuplikan akan terisap dengan
sendirinnya karena adanya perbedaan tekanan di antara kedua ujung pipa kapiler.
Kemudian ujung pipa kapiler tersebut dicelupkan kembali ke dalam larutan buffer.
Dengan teknik elektrokinetik, tegangan listrik dialirkan beberapa saat ketika salah
satu ujung pipa kapiler tercelup dalam cuplikan. Dengan demikian sejumlah
cuplikan akan masuk kedalam pipa kapiler.

Detektor.

Semua solut baik yang bermuatan maupun netral bergerak ke satu arah
yaitu kekatoda maka hal ini mempermudah pendeteksian. Dengan demikian
detektor dapat diletakan di salah satu ujung pipa kapiler yaitu didekat katoda.
Berbagai detektor telah digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil
pemisahan, antara lain spektrometri (seperti UV, dan Fluoresen) dan detektor
elektrokimia (seperti konduktometri dan amperometri). Detektor UV diperlihatkan
dalam gambar 2.14. Keuntungan penggunaan pipa kapiler yang terbuat dari gelas
silika adalah transparan terhadap sinar UV. Hal ini memungkinkan pendeteksian
aliran komponen hasil pemisahan secara online, artinya tidak perlu mengganggu
aliran komponen hasil pemisahan. Detektor flurosen pada gambar 2.15 dapat

32
digunakan dalam elektroforesis kapiler dengan teknik penggunaan yang sama
detector UV, detektor elektrokimia pada gambar 2.16.

Gambar Detektor UV (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Semua komponen campuran (solut) bergerak ke anoda dan ketika solut melawati
sinar UV maka sinar tersebut akan teradsorbsi yang selanjutnya intensitas cahaya
yang diserap oleh solut-solut dapat diukur sebagai besaran listik.

Gambar Detektor Fluoresen (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Aplikasi Elektroforesis

1. Elektroforesis Gel (GE)

Sebuah sample pada pemisahan gel dari fragmen DNA bakteri yang
ditunjukkan pada gambar 2.17 . Pada dasarnya label fluorescent digunakan
untuk visualisasi asam nukleat. Pada satu gel , 18 sampel dan satu standar
pencampuran dijalankan secara paralel. Standar pencampuran mengandung
molekul dengan dasar berpasangan panjangnya. Pemisahan pattern dikandung
dari standar pencampuran yang juga sebagai ladder. Jumlah dasar

33
 berpasangan dari fragmen DNA dapat diperkirakan oleh perbandingan pita
ke pita dalam barisan DNA.

Gambar Elekroforesis Gel pada produksi amplikasi PCR dari

Genomic DNA dari jenis strain bakteri Pseudomonas putida

2. Elekroforesis Kapiler (CE)

Analisis Peptida.
Peptida disusun oleh beberapa asam amino , jadi molekul peptide lebih besar
daripada molekul asam amino. Hasil pemisahan sintesis peptide dengan
metode CE dan HPLC .
Detektor UV digunakan pada kedua metode pemisahan tersebut. CE
dilakukan pada pipa kapiler dengan panjang 65 cm dan diameter 50 mikrometer
dalam buffer citrate. Sedangkan HPLC dilakukan secara gradien pada kolom C-8
(220 x 2 mm) dengan fas gerak 0.1 % “ (FA dalam air dan 0,08 % TFA dalam
acetonitril. Hasilnya, CE memperlihatkan jumlah peak yang lebih banyak daripada
peak HPLC yang berarti CE memberikan resolusi yang lebih baik daripada HPLC
untuk pemisahan peptida.

Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :

34
 1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA,
setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga
membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu
cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk
PCR.
3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

2.4 Kelebihan dan Kekurangan dalam Elektroforesis

Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sedrhana,

digunakan untuk memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam
nukleat, asam amino dan karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah
dan sederhana. Akan tetapi memiliki keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang
rendah , waktu pemisahan yang relative lama, dan berlaku untuk senyawa yang
berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat arus searah yang relative
rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penambahan tegangan listrik yang
searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan noda hasil
pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan
tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan
elektroforesis menjadi tidak terlalu jelas

35
 BAB III

PENUTUP

KESIMPULAN

1. Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas

analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik
dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas,
termasuk protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat.

36
2. Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel
bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan
bergerak kekutub positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik
positif akan bergerak kekutub negative (katoda). Sementara partikel netral
tidak bergerak .
3. Jenis-jenis elektroforesis adalah elektroforesis zona (wilayah), elektroforesis
kertas, elektroforesis Gel, dan elektroforesis kapiler.
4. Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang,
misalnya :di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan
DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari.
Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.Dalam kegiatan
biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

DAFTAR PUSTAKA

Andreas Manz, et.al, 2010, “Bioanalytical Chemistry” published by Imperial

College Press, London

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher,

Oxford: xvi + 175 hlm.

37
Richardson, b. J, p. R. Baverstock and m. Adams 1986. Allozyme electro-
phoresis. A handbook for animal sys- tematics and population studies. Aca-
demic press, inc. San diego : 410 pp. Sambrook, j. & d. W. Russell. 2001.
Molecular cloning: a laboratory manual vol 2. 3rd ed. Cold spring harbour
laboratory press, new york: xvii + 3.4--14.53 + 1.44

S.M. Kopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.

Sumar Hendayana , PH.D. 2006, “ Kimia Pemisahan Metode kromatografi da

elektroforesis Modern “ PT. Remaja Rosdakarya.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth

Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.

38