1.

Ekstraksi Enzim

1
Ekstraksi Enzim
Proses pengeluaran enzim dari sumbernya.

 Tanaman : papain, bromelain, dll

 Hewan : rennin, dll
 Mikrobia : lignoselulase, xilanase, dll

2
Ekstraksi enzim dari tanaman atau hewan
No Metoda Aplikasi
(asal enzim)
1 Pelarutan & pengadukan Tepung biji-bijian
2 Penghancuran (mincing), Bahan yang lunak
pengepresan, penyaringan misal buah, umbi,
daging
3 Penghalusan (dengan mortir, Daun, bahan yang
homogenizer, waring blender) agak keras

4 Penghalusan dengan tambahan Bahan yang sangat

pasir/glass bead keras, misal akar
3
Ekstraksi enzim dari mikrobia
Enzim mikrobia ada 3 macam:
1. Intraseluler
2. Ekstraseluler
3. Terikat membran

Bedakan dengan pengelompokan enzim berdasar sifat

katalitiknya:
1. Endo enzim
2. Ekso enzim
4
 Ekstraksi enzim dari mikrobia
 1. Enzim intraseluler
Mikrobia mempunyai dinding sel sehingga lebih keras,
sehingga harus dihancurkan. Metoda penghancuran:

No Metoda Contoh metoda

1 Perusakan mekanis a. Penghalusan dengan
tambahan pasir/glass bead
b. penghancuran dengan
tekanan (misal French
Press)
c. sonikasi

2 Enzimatis (u/ bakteri Menggunakan enzim lisozim

 lisis) atau glukuronidase 5
Ekstraksi enzim dari mikrobia
 2. Enzim ekstraseluler
 Enzim ada diproduksi di dalam sel, kemudian
dikeluarkan dari sel
 Prinsipnya memisahkan sel dari supernatannya
dengan sentrifugasi
 Supernatan = enzim ekstraseluler

6
 SUMBER ENZIM
(Tanaman/ Hewan/ KULTUR MIKROBIA
Kultur Mikrobia)

PENGHANCURAN

SENTRIFUGASI SENTRIFUGASI

ENZIM ENZIM
Intraseluler Ekstraseluler
(Enzim kasar) (Enzim kasar)
7
Ekstraksi enzim dari mikrobia
 3. Enzim terikat membran

 Secara umum detergent dapat merusak membran dan

mengekstrak lipoprotein yang terdapat / terikat pada
membran sehingga menjadi larut.
 Macam detergent :
 Garam bile alami (misal cholate)
 Detergent non-ionik (misal Triton X-100)
 Detergent ionik (misal SDS, CTAB, CHAPS)
 detergent ionik menyebabkan aktivitas enzim hilang

 Cara yang lain dapat menggunakan :

 Solven organik
8
Sifat ekstrak enzim
 Kelarutannya dipengaruhi oleh :
 pH : titik isoelektrik  kelarutan paling rendah
 Konsentrasi garam
 kandungan solven organik
 Suhu
 Adanya substrat (menaikkan kelarutan)
 Stabilitasnya naik dengan adanya :
 DTT & mercaptoetanol  melindungi gugus sulfhidril
 chelating agent (misal EDTA)
 Senyawa penghambat aktivitas enzim tertentu (misal DFP,
penghambat enzim proteolitik) 9
2. Pemurnian Enzim

10
Pemurnian
 Pemurnian : pemisahan protein enzim dengan
senyawa/protein lain penyebab tidak murni (impurities)
 Metoda :
1. Pemisahan berdasarkan ukuran massa
 Sentrifugasi
 Gel filtrasi
 Dialisa
 Ultrafiltrasi
2. Pemisahan berdasar kelarutannya (pengendapan)
 Pengendapan dengan garam / perubahan kekuatan
ionik
 Pengendapan dengan pelarut organik
 Perubahan pH 11
3. Pemisahan berdasar polaritas muatan
 Kromatografi penukar ion
 Kromatofocusing
 Elektroporesa
 Isoelektrik focusing
 Kromatografi hidrofobik

4. Pemisahan berdasarkan sisi pengikat spesifik

 Kromatografi afinitas
 Kromatografi ligan zat warna
 Kromatografi Imunoafinitas

12
Simple chromatography, using a siphon to generate the mobile-
phase flow.
13
A typical elution profile of A280 vs elution volume with event
marker pulses.
14
Contoh 1.2
Gel filtration chromatography
Pemisahan berdasarkan ukuran masa
 Also called size exclusion chromatography or molecular
sieve chromatography.
 How does it work? If we assume proteins are spherical…
size Molecular mass
(daltons)
10,000

30,000

100,000
 Gel filtration chromatography

flow
 Gel filtration chromatography

flow
Gel filtration chromatography

flow
Gel filtration chromatography

flow
Gel filtration chromatography

flow
CONTOH 2.1
SOLUBILITY
 Salting-in
 Salting-out
 Umumnya amonium sulfat digunakan pada cara ini
 Garam akan menstabilkan muatan positip berbagai macam
gugus dalam protein dan menaikkan polaritasnya sehingga
mendorong kelarutan dalam air (salting in).
 Jika kekuatan ioniknya naik dengan kenaikan konsentrasi
garam maka molekul protein tersebut akan mengendap
(salting out)
 Metoda ini dipakai pada step awal pemurnian untuk
mengurangi volumenya
Contoh 3.1
Kromatografi penukar ion

Ionisation characteristics of CM- and DEAE- substituent groups.

23
Ion exchange chromatography
 Ion exchange resins contain charged groups.
 If these groups are acidic in nature they interact with positively charged proteins
and are called cation exchangers.
 If these groups are basic in nature, they interact with negatively charged molecules
and are called anion exchangers.

- +
CH2-COO + Positively
CH2-COO- + charged (basic)
CM cellulose + protein or enzyme
cation exchanger

Negatively
CH2-CH2 -NH+(CH2CH2) - charged (acidic)
-
CH2-CH2 -NH+(CH2CH2) protein or enzyme
-
-
DEAE cellulose
anion exchanger
 Ion exchange chromatography
For protein binding, the pH is fixed (usually near neutral) under low salt
conditions. Example cation exchange column…

+ Positively charged protein

CH2-COO- + or enzyme bind to the
CH -COO-
2 + column
+
CM cellulose
cation exchanger
-
-
-
- Negatively
- charged proteins
- pass through the
- column
-
Ion exchange chromatography
To elute our protein of interest, add increasingly higher amount of salt
(increase the ionic strength). Na+ will interact with the cation resin and Cl-
will interact with our positively charged protein to elute off the column.

+ + Increasing
CH2-COO- + [NaCl] of the
CH -COO- +
2 elution buffer
+
CM cellulose
cation exchanger

- Na+ Na+2 Cl-

CH2-COO Cl- +
- Na +
-
+
CH -COO
2 Cl
-
+
CM cellulose Na+2 Cl +
cation exchanger
Contoh 41.
Affinity chromatography
 How does it work?
 Ligand - a molecule that specifically binds to the protein of interest.

Inert support + +

Spacer arms Ligand

Affinity material
Inert support
prepared
Affinity chromatography

Inert support

Mixture of proteins

Inert support

Unwanted proteins
Affinity chromatography

Inert support

Elute with competitive ligand.

Inert support

Remove from competitive ligand

by dialysis.
Pengujian kemurnian enzim

 Elektroporesa dengan SDS

 Isoelektrik focusing
 Terminal-N

30
 Electrophoresis

 Didasarkan pada perbedaan kecepatan pergerakan

antara molekul yang bermuatan pada gel yang dialiri
listrik
 Kecepatan pergerakan dipengaruhi oleh : muatan,
ukuran dan bentuk
 Keberadaan protein dapat diketahui dengan
pewarnaan
 Medium yang umum digunakan adalah a polimer
dari agarose atau acrylamide
Experimental set-up for discontinuous PAGE. 32
ELECTROPHORESIS