SPEKTROFLUOROMETRI

TUJUAN

• Memahami proses fluoresensi dan fosforesensi

• Mengetahui molekul obat yang berfluoresensi dan berfosforesensi

• Membedakan senyawa yang berfluoresensi secara alami dan karena

perlakuan tertentu

• Analisis kuantitatif senyawa obat dengan metode spektrofluorosensi

ANALISIS OBAT DENGAN SPEKTROFLUOROMETRI

PROSES FLUORESENSI DAN FOSFORESENSI

Suatu senyawaa obat atau senyawa kimia dapat tereksitasi bila dikenai
oleh radiasi elektromagnetik dan kemudian memancarkan kembali sinar
dengan λ yang sama atau berbeda dengan sinar semula (λ eksitasi)

• Fluorosensi: waktu singkat (10-8 det)

• Fosforesensi: waktu relatif lebih lama (10-4 det)

Elektron berpasangan/spin berlawanan

• Ground state: So
• Keadaan tereksitasi: S1

Peristiwa deaktivasi
• Fluoresensi resonansi: energi diemisikan kembali
• Konversi internal: energi vibrasional hilang sehingga S1 S2 So
mengemisikan λ yang lebih panjang
• Fluoresensi yang jauh lebih lambat melalui proses relaksasi vibrasional dan
perlintasan antar sistem ke keadaan tereksitasi triplet (T1), spin-spin elektron
tidak berpasangan
Fluoresen terjadi ketika suatu orbital elektron dalam suatu melekul atau atom berelaksasi ke
keadaan dasarnya melalui emisi foton atau cahaya sesudah eksitasi ke keadaan kuantum
energi yang lebih tinggi

Eksitasi:

Fluoresen (emisi):

dimana adalah energi foton, h = konstanta Planck, = frekuensi cahaya

S0 adalah keadaan dasar dari molekul berfluoresens (fluorofor) dan S 1 adalah keadaan eksitasi
pertama.

Suatu molekul pada kondisi S1, dapat berelaksasi dengan beberapa jalan.

• Relaksasi non radiatif, energinya didisipasi sebagai panas (vibrasi) terhadap pelarut.

• Relaksasi melalui konversi ke keadaan triplet yang dapat berelaksasi melalui fosforesensi
atau melalui non-radiatif relaksasi sekunder.

• Relaksasi S1 dapat juga terjadi melalui quenching fluoresen. Molekul oksigen merupakan
quenching yang sungguh efisien.
 HUBUNGAN INTENSITAS FLUORESENSI DAN KONSENTRASI
Intensitas fluoresensi (F) sebanding dengan banyaknya sinar yang diserab
oleh molekul analit. Sesuai hukum Lambert-Beer, maka:

It/Io = e-abc .......................... (1)

1 – It/Io = 1 – e-abc ............... (2)

Io – It = Io (1 – e-abc) ........... . (3)

Io – It : banyaknya sinar yang diserap, maka

F = (Io – It) Φ ........................ (4)

Φ: efisiensi kuantum (hasil kuantum), yaitu fraksi molekul-molekul tereksitasi

yang berelaksasi ke keadaan dasar melalui fluoresensi

Φ = Jumlah foton diemisikan/jumlah foton diabsorbsi

Φ : semakin tinggi intensitas fluoresensi

Φ = 0, molekul tidak berfluorsensi
 F = Io (1 – e-abc) Φ ....................... (5)

Intensitas fluoresensi berbanding langsung dengan intensitas radiasi (Io)

Jika bagian abc < 0,05, yang dapat dicapai pada konsentrasi rendah, maka
F dapat diekspresikan:

F = Ioabc Φ ................................. (6)

atauF = kIoc k = tetapan proporsionalitas

Pada konsentrasi rendah, maka plot F vs c merupakan garis linier, maka:

F’ = Fk’

F’: fluoresensi terukur

k’: konstanta proporsionalitas yang lain

F’ = k’Ioc
NILAI Φ BEBERAPA SENYAWA BERFLUORESENSI

Senyawa Pelarut Φ

9-aminoakridin etanol 0,99

Naftalen heksan 0,10
Fenol air 0,22
Fluoresein NaOH 0,1N 0,92
Urasil asetat air 0,04
Natrium salisilat air 0,28
Natrium sulfanilat air 0,07

Robinson, dkk 2005 dalam Ganjar dan Rohman, 2012

 9-aminoakridin Naftalen Fluoresein

Urasil asetat Sodium salisilat Sodium sulfanilat

 BEBERAPA VARIABEL YANG MEMPENGARUHI FLUORESENSI

Struktur molekul
Struktur molekul menentukan rigiditas (kekauan), misalnya bifenil dan fluoren

Bifenil Fluoren
Suhu
Jika temperatur semakin tinggi, maka Φ semakin rendah; tumbukan antar
molekul dengan pelarut semakin tingggi

Pelarut
Polaritas semakin maka F semakin ; energi proses transisi menurun
Jika pelarut mengandung atom-atom yang berat (Br, F, dll), misalnya CBr4,
C2H5I, maka kebolehjadian fluorosensi , sementara fosforesensi
 pH
Berpengaruh pada letak kesetimbangan antara bentuk terionisasi dan
bentuk tidak terionisasi yang akan berpengaruh pada λ.

Oksigen terlarut
Adanya oksigen akan F, karena terjadinya oksidasi senyawa

Contoh beberapa senyawa obat yang berfluoresesni secara intrinsik

Senyawa Pelarut pH λeks λem

Adriamisin air 4 495 580

Barbital air 13 277 420
Hidralazin H2SO4p - 320 353
Dikumarol etanol - 370 435
Piridoksin HCl etanol - 290 355
Sulfanilamid air 3-10 275 350

Ganjar dan Rohman 2012

Adriamisin/Doxorubicin Barbital

Dikumarol

Hidralazin

Piridoksin Sulfanilamid
Mengubah Senyawa Menjadi Fluoresen
Senyawa yang yang tidak berfluorosensi secara intrinsik agar dapat dianalisis
secara fluorometri maka harus terlebih dahulu diubah menjadi senyawa
berfluorosen

Senyawa tdk Senyawa

Analisis
berfluoresens berfluoresen

Induksi Kimia
• UV
• Hidrolisis
• Dehidrasi
• Reagen fluorometrik (fluorofor)
Contoh Obat tidak berfluorosensi

Difenilhidantoin dan metildopa: dapat diukur secara fluorometri

setelah diubah menjadi fluorofor;
* Oksidasi dengan KMnO4 dalam suasana basa
* Ekstraksi dengan heptan
* Ekstraksi dengan H2SO4
* Ukur dengan fluorometer

n On

OH-

Benzofenon

Difenilhidantoin
 O
Oksidasi
CH3
O N
H
Metildopa Penataan ulang

OH

CH3
HO N
H
Dihidroksi indol
Contoh Obat yang diukur dengan fluorosensi setelah induksi kimia

Senyawa Metode
Klorokuin Induksi fotokimia
Imipramin Direaksikan dengan formaldehid dan asetilaseton
Klordiazepoksid Pembentukan laktam
Oksitetrasiklin Kompleksasi dengan Mg2+ dan EDTA

Klorokuin
Imipramin

Klordiazepoksid Oksitetrasiklin
Catatan
Laktam adalah suatu senyawa amida siklis (lakton + amida)

β-lactam γ-lactam δ-lactam ε-lactam

EDTA, Ethylenediaminetetraacetic acid

 Beberapa senyawa obat yang dapat dianalisis dengan metode
fluorosensi setelah diubah menjadi fluorofor

Senyawa Metode λeks λems

Amantadin Reaksi dengan fluoresamin 395 475
Amfetamin Reaksi dengan fluoresamin 395 475
Atrofin Penggabungan dengan eosin Y 365 556
Meskalin Penggabungan dengan formaldehid 375 515
Kanamisin Reaksi dengan fluoresamin 405 485
Metotreksat Oksidasi dengan KMnO4 280, 370 450
Prokain Reaksi dengn fluoresamin 405 485
 Amfetamin

Amantadin

Meskalin

Atrofin
Kanamisin

Metotreksat

Prokain
INSTRUMEN

INSTRUMEN

Sumbe sinar
Monokromator eksitasi
Kontainer Sampel
Monokromator emisi
Detektor
Display
ANALISIS OBAT DENGAN METODE FLUOROSEN

1. Analisis Etinilestradiol

Tablet mengandung dosis rendah sehingga interferensi bahan tambahan dapat

menimbulkan masalah serius jika dianalisis dengan UV-Vis. Oleh karena itu
sebaiknya dianalisis dengan teknik fluorosens. Sampel diukur pada λeks 280
nm dan λems 320 nm

Contoh
Suatu ekstrak metanolik tablet etinilestradiol diukur dengan spektrofotometri
fluoresen. Standar yang mengandung obat murni juga diukur dengan kondisi
yang sama.
Hitung kandungan tiap tablet dari data berikut ini:
Berat 20 tablet = 2, 5673 g
Berat serbuk yang dianalisis = 0,5257 g
Volume ekstrak metanol tablet = 50 mL
Pembacaan fluoresensi ekstrak metanol tablet = 64,1

Pembacaan fluoresensi setelah penambahan NaOH 0,1 M = 3,5

Konsentrasi larutan standar etinilestradiol =4,85 µg/mL

Pembacaan fluoresen larutan standar = 62,3

Pembacaan fluoresen larutan standar setelah penambahan NaOH 0,1 M = 4,1

Pembacaan terkoreksi untuk ekstrak tablet = 64,1 – 3,5 = 60,6

Pembacaan terkoreksi untuk standar = 62,3 – 4,1 = 58,2

Banyaknya etinilestradiol dalam ekstrak tablet = 60,6/58,2 x 4,85 µg = 5,02 µg/mL

Total kandungan dalam ekstrak: 50 mL x 5,02 µg/mL = 251 µg

Banyaknya tablet dalam serbuk tablet yang dianalisis: 2,5673/0,5257 = 4,884 tablet

Kandungan etinilestradiol pertablet: 251/4,885 = 51,4 µg

Analisis Asam Nalidiksat

Asam nalidiksat dapat dianalisis dengan spektrofluorometri setelah dikomplekskan

dengan terbium klorida (TbCl3) dengan adanya heksamin.
Dibuat kurva kalibrasi dengan memindahkan 1,0 mL TbCl 3, 5x10-5 M ke labu ukur 25
mL yang telah berisi asam nalidiksat dengn konsentrasi 0,1-2,4 ppm lalu tambahkan
1 mL heksamin pada pH 7,2 lalu tamahkan H2O hingga tanda batas.
Ukur intensitas fluoresens pada λ eks (310 nm) dan λems (490 nm)
Untuk sampel tablet, gerus 20 tablet, timbang secara seksama serbuk setara 20 mg
asam nalidiksat.
Pindahkan ke labu dan ekstraksi 3 kali dengan kloroform masing-masing 30 mL,
saring, masukkan ke labu takar 100 mL, lalu diukur, demikian juga untuk standar.

Asam nalidiksat
Analisis Sefuroksim
Prosedur Umum
Alikuot larutan sefuroksin diencerkan secara sesuai Murillo, dkk (1994), ditambah
dengan NaOH 1 M, dan panaskan pada suhu 90°C selama 1 jam untuk menghasilkan
senyawa berfluoresensi.
Dinginkan larutan pada suhu kamar dalam penangas es dan atur pH larutan menjadi 7
dengan menambahkan HCl.
Alikuot yang dihasilkan dipindahkan ke labu takar 25 mL sedemikian hingga larutan
yang dihasilkan mengndung 0,05 – 1,70 µg/mL sefalosforin terhidrolisis
Tambahkan 5,0 mL buffer pH 10,5 dan encerkan larutan dengan air hingga batas tanda
Intensitas fluoresensi diukur pada λeks (380 nm) dan λems (436 nm), hal yang sama
terhadp blanko.

Sefuroksim
Sefalosforin
Injeksi

Kandungan dalam vial injeksi dimasukkan dalam labu takar 100 mL

Encerkan dengan aquades sampai garis tanda
Suatu alikuot larutan yang mengandung obat 5 mg diencerkan dan lakukan perlakuan
suhu seperti terdahulu.
Persentase antibiotika dihitung dari kurva kalibrasi yang diperoleh menggunakan
standar sefuroksim

Suspensi

Sejumlah serbuk yang sesuai membuat suspensi yang setara dengan 0,025 mg
sefuroksim (sebagai natrium sefuroksim) dipindahkan ke dalam labu takar 25 mL
Sefuroksim asetil larut dalam NaOH, sehingga dapat dihidrolisis agar dihasilkan
senyawa sefuroksim asetil yang berfluoresen.
Setelah pendinginan, saring dan dilanjutkan dengan proses umum yang sudah
dijelaskan.
TUGAS

Metode spektorofotmetri fluoresensi banyak digunakan dalam analisis kuantitatif

bahan aktif obat.
a. Jelaskan prinsip dasar analisis dengan metode fluoresensi
b. Faktor-faktor yang mempengaruhi sifat fluorosesensi
c. Cara mengubah suatu obat agar berfluorsensi
d. Jelaskan langkah-langkah pekerjaan dalam analisis kuatitatif