Untuk memisahkan senyawa bahan obat, dikembangkan berbagai macam metode di

antaranya cara Stas – Otto. Dengan cara tersebut dapat dipisahkan lebih dari 100 macam
campuran senyawa obat.

Cara analisisnya berdasarkan prinsip :

1. Pembagian Senyawa kedalam fase air dan fase pelarut organik yang tidak tercampur
dengan air. Pada sebagian besar obat ( Khususnya yang berbentuk padat ). Pemisahan
dengan cara membedakan ke dalam fase air dan fase pelarut organik saja masih kurang
memuaskan, sehingga dilakukan prinsip yang kedua yaitu :
2. Pembentukan atau penguraian garam. Prinsip ini menyangkut perbedaan kelarutan,
yaitu bahwa garam lebih bersifat hidrofil. Sedangkan bentuk asam atau basanya lebih
bersifat lipofil.

Kebasaan atau pun ke asaman larutan serta bermacam – macam ( keragaman ) sifat pelarut
( Lipofil/kurang lipofil ) memungkinkan pemisahan sebagai berikut :

Fraksi IA Asam karbonat,fenol,Zat netral

Fase Eter ( Suasan Asam )
Fraksi IB
Fase Eter ( Suasana Basa )
Fraksi II
Ekstrak Kloroform dalam suasan
asam tartrat
Fraksi III
Ekstrak eter ( Suasan Basa )
Fraksi IV
Ekstrak Kloroform-Iso Propanolol
dalam suasana basa amoniak
Fraksi V
Senyawa yang tidak terekstraksi
dengan pelarut organik
Glutemid,Propilfenazon,pentobarbital,dietilbestrol,
Warfarin,Asam Salisilat,Paracetamol,Dietilbestrol,
Barbital,Fenobarbital,Nitrazepam.
Senyawa Netral
Benzokain,Glutetimid,Meprobamat,Hidrokortison,
Diazepam,bisakodil.
Asam,Fenol dan zat netral yang larut kloroform
Amitriptilin,imipramin,defenhidramin,siklobarbital,
Nitrazepam,Kafein,reserpin,Klordiazepoksida.
Berbagai senyawa basa
Efedrin,kodein,kinidin,etilmorfin,atropin,strihnin
Berbagai basa Fenol
Pilokarpin,Sulfanilamid,Paracetamol,Tetrasiklin.
Asam hidrofil,sulfonamida,karbohidrat,asam
amino,ammonium kuarterner,ampisilin,asam
glutamat,asam
askorbat,isoniazid,hidrokortiazid,sulfaguanidin.
 Jika dilihat dari tabel diatas berdasarkan Fraksi tersebut dengan menggunakan metode
Stass-Otto untuk pemisahan senyawa Kafein dan Paracetamol, untuk senyawa kafein
berada di Fraksi II ( Ekstrak kloroform dalam suasan asam Tartrat ). Dan untuk pemisahan
senyawa Paracetamol berada di Fraksi IV ( Ekstrak kloroform-Iso Propanolol dalam
suasana basa amoniak ).

Proses identifikasi menggunakan pemisahan yang paling umum dilakukan adalah

ekstraksi. Kelarutan setiap senyawa terhadap pelarut tertentu tergantung dari sifat-sifat
kimia masing-masing zat dan afinitasnya terhadap pelarut tersebut pada kondisi tertentu.
memisahkan senyawa obat melalui metode Stass-Otto. Metode ini terbagi ke dalam lima
fase. Pada tiap fase pemisahan senyawa ini, senyawa dibagi ke dalam fase air dan fase
organik. Fase organik yang digunakan adalah eter dan kloroform. Sedangkan untuk
mengefektifkan hasil yang didapat, maka dilakukan reaksi penggaraman dengan cara
mengubah pH pada tiap fasenya sesuai dengan yang tertera dalam prosedur. Maksudnya
disini adalah setelah senyawa melewati fase tertentu dengan suasana asam (lipofil), maka
selanjutnya pH senyawa tersebut diubah menjadi basa untuk memasuki fase selanjutnya,
begitu pula sebaliknya untuk senyawa dengan suasana basa (lipofil), sehingga terbentuk
senyawa garam yang bersifat hidrofil atau lebih larut dalam air.
Fase pertama dalam metode Stass-Otto diekstraksi dengan cara dilakukan reaksi
penggaraman terlebih dahulu. Kemudian dilanjutkan dengan ekstraksi eter pada suasana
asam dan diperoleh hasil fase air dan fase eter. Disini, senyawa yang dapat dipisahkan
dalam fase eter antara lain Asam karbonat, Fenol, dan senyawa-senyawa netral. Setelah
itu, fase eter pertama ini digaramkan kembali dan di ekstraksi dengan penambahan larutan
basa, sehingga turunan asam karbonat dan fenol masuk ke dalam fase air, sedangkan fase
eter yang tertinggal adalah berbagai senyawa netral yang kelarutannya tidak dipengaruhi
basa. Fase eter yang diperoleh dari proses pemisahan tersebut dinyatakan sebagai fraksi
IB yang berisi senyawa netral.
Selanjutnya fase air yang didapat dari pemisahan pada fraksi I B diasamkan
dengan H2SO4 3N dan diekstraksi kembali dengan eter. Hasil fase eter yang diperoleh
dinyatakan sebagai fraksi IA yang terdiri dari berbagai senyawa karbonat, fenol dan
ureida larut basa.
Fase air dari fase pertama digaramkan kembali hingga suasana asam kemudian
diekstraksi dengan kloroform. Fase kloroform yang didapat dinyatakan sebagai fraksi II
(senyawa asam, fenol dan netral larut kloroform). Sedangkan fase airnya diekstraksi
kembali pada suasana basa dengan pelarut eter, fase eter yang diperoleh dinyatakan
sebagai fraksi III (senyawa basa).
Prosedur terakhir Stass-Otto, fase air dari pemisahan fraksi III digaramkan dengan
penambahan asam dan amoniak, lalu diekstraksi dengan kloroform-isopropanol. Fase
kloroform yang didapat dinyatakan sebagai fraksi IV (senyawa basa fenol) sedangkan
fase air yang didapat dinyatakan sebagai fraksi V (senyawa tidak terekstraksi).
Kelima fraksi yang didapat dari metode Stass-Otto tersebut selanjutnya dianalisis
dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan cara dipekatkan kemudian
ditotolkan pada plat KLT. Penotolan hasil pemisahan senyawa (fraksi) dari metode
Stass-Otto pada KLT ini bertujuan untuk mengetahui secara spesifik senyawa yang
terkandung di dalamnya melalui panjang gelombang yang dimilikinya.
Dalam suatu sistem Kromatografi Lapis Tipis sendiri terdapat dua fase, yaitu
fase diam dan fase gerak. Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap
berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata-rata
partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik
efisiensi dan resolusi KLT. Penjerap yang digunakan pada praktikum ini adalah Silika gel
60 F 254 yang merupakan silika gel yang mempunyai ukuran pori 60 Å (10 Å = 1 nm)
dengan fluoresensi pada panjang gelombang emisi 254. Fase gerak pada KLT yang
paling sederhana adalah eluen campuran 2 pelarut organik, karena daya elusi campuran
kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa, sehingga pemisahan dapat terjadi
secara optimal. Pemilihan fase gerak pada praktikum ditentukan dari: (Gandjar I. G dan
Rohman, A., 2012)
1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi, karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa, sehingga harga Rf terletak
antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti
juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan.
4. Solut-solut ionik dan polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai
fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan
 tertentu. Penambahan sedikit Asam etanoat atau Amonia masing-masing akan
meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam.
Usai penotolan, sebelum menuju ke tahap pembacaan hasil pada Spektrofotometri,
lempeng KLT dimasukkan ke dalam bejana (chamber) yang telah diisi dengan fase gerak
(eluen) yang sesuai atau yang lebih dikenal dengan proses elusi. Selama proses elusi,
bejana kromatografi harus ditutup rapat dan sedapat mungkin fase volume gerak sesedikit
mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang
telah ditentukan). Ketika proses elusi selesai, dilanjutkan dengan deteksi noda yang
dilakukan dengan cara mengamati lempeng di bawah lampu UV yang dipasang
panjang gelombang emisi untuk menampakkan solut sebagai noda yang berfluoresensi
terang pada dasar yang berfluoresensi seragam. Noda yang terlihat antara lain;
● Fraksi IA pada totol sampel Kafein, Metronidazole, Allopurinol, dan Ibuprofen.

● Fraksi IB pada totol sampel Metronidazol dan Aminofenazon.

● Fraksi II pada totol sampel Kafein, Metronidazol, Cotrimoksazol,

Meloxicam, Ibuprofen, Sulfaguanidin, dan Aminofenazon.
● Fraksi III pada totol sampel Aminofenazon.

● Fraksi IV pada totol sampel Kafein, Cotrimoksazole, dan Sulfaguanidin.

● Fraksi V pada totol sampel Furosemid, Ethambutol, Piridoksin, Allopurinol,

Salbutamol, Ibuprofen, Sulfaguanidin, dan Vitamin C.
Noda yang terdeteksi kemudian ditandai untuk menghitung nilai Rf masing-
masing solut dengan rumus = a
, dimana a = jarak yang ditempuh senyawa (noda) dan b
= jarak yang ditempuh fase gerak (eluen). Nilai Rf tersebut merupakan parameter yang
digunakan untuk identifikasi senyawa pada metode KLT.