UJI

EFEKTIVITAS
VITAMIN
 Vitamin
Vitamin adalah zat senyawa kompleks yang sangat
diperlukan oleh tubuh yang berfungsi untuk
membantu pengaturan atau proses kegiatan tubuh.
Vitamin juga berfungsi dalam berbagai macam
fungsi tubuh lainnya seperti regenerasi kulit, system
susunan syaraf, penglihatan, dan lain sebagainya.
PENGGOLONGAN VITAMIN

VITAMIN LARUT
DALAM LEMAK

VITAMIN

VITAMIN LARUT
DALAM AIR
LARUT DALAM AIR:
• Vitamin B
• Vitamin C

LARUT DALAM LEMAK:

• Vitamin A
• Vitamin D
• Vitamin E
• Vitamin K
 Vitamin A
 Vitamin A atau retinol merupakan senyawa polisoprenoid
dari sumber hewani selain karotenoid yang
memperlihatkan aktivitas biologic vitamin A. Selain itu,
vitamin A juga mengandung cincin siklohesinil
 Vitamin A bersumber dari minyak hati ikan, susu,
mentega, telur, hati, wortel, bayam, pisang dan lain-lain
 Selain berfungsi untuk Kesehatan mata vitamin A juga
berfungsi untuk pembentukan gigi dan tulang yang baru
Angka kecukupan gizi vitamin A bervariasi berdasarkan
usia antara lain:
Usia Asupan (IU/hari)
1-3 tahun 1000 IU
4-8 tahun 1320 IU
9-13 tahun 2000 IU
Pria >14 tahun 3000 IU
Wanita > 14 tahun 2310 IU
Ibu hamil usia 14-18 tahun 2500 IU
Ibu hamil usia >19 tahun 2565 IU
Ibu menyusui < 19 tahun 4000 IU
Ibu menyusui > 19 tahun 4300. 

IU (International Unit) merupakan satuan yang menunjukkan jumlah kandungan vitamin. 1

mikrogam sama dengan 40 IU
 Metode Uji Efektivitas Vitamin A
1. Spektofometri

Spektrum absorbs ultraviolet vitamin A dan vitamin A asetat

mempunyai absorbansi maksimal pada panjang gelombang
antara 325 sampai 328 nm dalam berbagai pelarut.

Jika larutan vitamin A menyerap lurus pada daerah Panjang

gelombang antara 325-328 nm, maka koreksi geometri
dapat digunakan. Koreksi ini digunakan untuk mengoreksi
senyawa pengganggu yang mempunyai absorbansi tetap
2. Kolorimetri

Dalam pengujian kali ini menggunakan metode Carr-Price.

Metode ini di dasarkan pada pembentukan kompleks warna
biru antara antimoni triklorid atau asam trifluoroasetat dengan
retinol dalam kloform yang dapat diukur absorbansinya di
panjang gelombang 620nm. Pembacaan biasanya dilakukan
dalam waktu 10-15 detik setelah sampel ditambah pereaksi
Prosedur
Untuk sampel dengan kadar vitamin A rendah
● 10 + 0,1 g sampel ditambah 75 ml alcohol 95% dan 25 ml KOH 50%
● Didihkan dengan memakai pendingin balik
● Campuran dipindah ke labu pemisah dan dilakukan ekstraksi dengan ditambah dietil
eter
● Ekstrak eter dicuci dengan H2O, kemudian ditambahkan Na-sulfat anhidrat
● Eter diuapkan dengan penangas air, kemudian gas N2 > diperoleh ekstrak kering
● Ekstrak kering dlarutkan dalam kloroform

Untuk sampel yang kaya vitamin A

● Diilarutkan sampel dalam kloroform (konsentrasi akhir=20% w/v)
● 4 ml reagen Carr-Price ditambah 1 ml kloroform
● 0,5 ml larutan sampel dalam kloroform ditambah 2 ml reagen Carr-Price, dicampur
merata
● Absorbansi campuran diter pada 620 nm
● Dibuat kurva standar (kisaran konsentrasi vitamin A=0 – 15 IU/ml)
3. Parameter kromatografi
● Kolom : 15 cm x 4.5 mm dipadati dengan 3 mm silika
(Apex silika)
● Fasa mobil : isokratik, heptane dan isopropanol (1-5%)
● Deteksi : UV 340 nm
● Flow rate : 1-2 ml/menit
 Vitamin D
 Vitamin D adalah senyawa yang stabil sehingga tidak
rusak oleh pemasakan makanan, penyimpanan atau
penanganan pasca panen
 Vitamin D bersumber dari minyak ikan, telur, sinar
matahari, keju dan lain-lain
 Vitamin D dapat larut dalam alcohol dan propilen – glikol
 Vitamin D memiliki spektrum serapan karakteristik
maximum 265 nm
 Metode Uji Efektivitas Vitamin D
1. Uji Vitamin D dengan Pemanasan menggunakan Hidrogen Peroksida

Prinsip : Umumnya vitamin D stabil terhadap pemanasan, asam dan oksigen.

Pemanasan dengan hydrogen peroksida tidak merusak vitamin D tetapi vitamin
A akan rusak.

Prosedur :
• Masukkan 10 tetes zat yang diuji (misalnya minyak ikan) ke dalam tabung
reaksi
• Tambahkan 10 tetes larutan H2O2 5% kocoklah campuran kira-kira 1 menit
• Panaskan di atas api kecil perlahan-lahan sampai tidak ada gelembung-
gelembung gas keluar. Usahakan jangan sampai mendidih
• Dinginkan tabung di bawah air keran
• Lalu lakukan uji dengan pereaksi Carr-Price
• Amati perubahan warna yang terjadi
2. Uji Efektivitas Vitamin D dengan Antimoni Triklorida

Vit D2 + D3 dengan antimoni-trikhlorida dalam chloroform akan

berwarna orang – kuning yang segera mencapai intensitas serapan
maximum pada 500 nm.

Prosedur :
● Dimasukkan 2 ml larutan yang diuji dalam tabung spectrometer dan
ditambah 4 ml larutan jenuh Antimoni-trikhlorida dalam chloroform
bebas air
● Ditunggu 10-15 menit dan serapannya dibaca pada 500 nm
● Kadar vitamin D dapat dihitung dengan persamaan kurva standar
3. Uji Efektivitas Vitamin D dengan Pereaksi Gliserol Dikhlorohidin

• Vitamin D2 + D3 bereaksi dengan gliserol-dikhlorohidrin, dengan adanya

asetil khlorida atau halide-asam lainnya
• Vitamin D2 dengan cepat membentuk warna kuning, yag kemudian berubah
hijau dalam 1 menit dan mencapai maximum dalam 15 menit, serta akan
stabil selama beberapa jam dengan serapan maximum pada 625 nm
• Dengan ergosterol segera muncul warna pink pucat yang berubah menjadi
jingga dalam 15-20 menit dan kemudian menjadi hijau
• Dengan 7-dehidrokholesterol tidak nampak warna pada beberapa menit
pertama kemudian muncul warna pink pucat yang akan menjadi intensif
dalam 24 jam
• Dengan cholesterol tidak muncul warna
• Reaksi tersebut dapat membedakan antara vitamin D2 dari ergosterol dan 7-
dehidrasi-cholesterol dan juga membedakan antara ergosterol dengan 7-
dehidrokholesterol
 Vitamin E
 Vitamin E disebut sebagai vitamin antisterilitas
 Sumber yang mengandung vitamin E yaitu ikan, ayam,
kecambah, ragi dan sebagainya
 Kelompok vitamin E terdiri dari alfa, beta, gamma
tokoferol dan beberapa esternya semisal ester asetat dan
allofanat
 Metode Uji Efektivitas Vitamin E
1. Kromatografi (KCKT)
Prinsip uji efektivitas untuk produk makanan umum
dimana sampel disaponifikasi dengan reflux, diekstrak
dengan heksan dan diinjeksi kedalam fase normal kolom
HPLC yang disambungkan pada detector fluoresensi.
Prinsiip untuk margarin dan minyak nabati sampel
dilarutkan dalam heksan, MgSO4 ditambahkan untuk
mengganti air kemudian difilter dan diuji dengan HPLC
Prinsip untuk minyak dilarutkan dalam heksan dan
diinejksi secara langsung ke dalam kolo HPLC
2. Metode Serimetri
Metode ini berdasarkan atas sifat mereduksi tokoferol
setelah tokoferol asetat dihidrolisis dengan asam. Maka
tokoferol tidak stabil dalam larutan basa.

3. Metode Kolorimetri
Penetapan kadar vitamin E dalam makanan baik dalam
bentuk kering maupun basah dilakukan secara kolorimetri.
Alfa-tokoferol diekstraksi dari sampel dengan pelarut
organic.
 Vitamin K
 Vitamin K digolongkan sebagai senyawa kimia yaitu
quinone
 Sumber yang mengandung vitamin K seperti susu, kuning
telur, sayuran segar.
 Untuk analisis vitamin K dalam susu formula, prsedur
Rose-Gottlieb telah dimodifikasi dengan mengganti
perlakuan ammonia/etanol yang diasamkan.
 Vitamin K dari sayuran, buah-buahan, serelia, daging dan
ikan telah diekstraksi dengan menggerus sampel dalam
mortar hingga diperoleh granul halus sebelum di ekstraksi
dengan aseton.
 Metode Uji Efektivitas Vitamin K
 Metoda efektivitas kuantitatif berdasar padainteraksi 2,4-
dinitro-fenilhidrazin dengan 2-metil-1,4-naftoquinon
dengan adnya ammonia alkoholis yang membentuk warna
biru sampai dengan biru kehijauan.
 Metoda lainnya didasarkan pada reduksi katalitik larutan
quinon dalam butyl alcohol dengan indicator pp.
 Vitamin C
 Vitamin C biasa disebut asam karbonat merupakan salah
satu jenis vitamin yang larut dalam air. Vitamin ini paling
tidak bisa stabil (mudah teroksidasi). Serta vitamin C
rusak karena reaksi enzim askorbat-oksidase, labil pada
suhu tinggi dan stabil pada pH asam namun tidak pada pH
netral dan alkali.
 Metode Uji Efektivitas Vitamin C
1. Metode Instrumen
- Spektrofotometri
Asam askorbat dalam larutan air netral menunjukkan
absorbansi maksimum pada 264 nm. Panjang geombang
maksimum ini akan bergeser oleh adanya asam mineral.
- Spektrofluorometri
Suatu metode yang digunakan untuk uji efektivitas kadar
vitamin C dengan analisis kuantitatif vitamin adalah
berdasarkan pada reaksi antara asam askorbat (AA) dengan
metilen biru (MB)
 Metode Uji Efektivitas Vitamin C
2. Metode Non Instrumen
- Iodimetri
Dasar metode ini adalah sifat mereduksi asam askorbat.
Metode iodimetri (titrasi langsung dengan larutan baku
iodium 0,1N) dapat digunakan terhadap asam askorbat
murni atau larutannya.
 Vitamin B
• Vitamin B merupakan vitamin yang larut dalam air dan
memiliki peran penting dalam metabolism sel
• Ada beberapa jenis vitamin B yang sangat umum kita
ketahui seperti vitamin B1 (tiamin), Vitamin B2
(Riboflavin), vItamin B6 dan vitamin B12.
1. Vitamin B1 (Thamin)
• Berbentuk kristal putih bersifat higroskopis
• Berbau ragi
• Mudah larut dalam air
• Berperan penting bagi organ jantung, otot dan
system saraf agar berfungsi dngan baik
 Metode Uji Efektivitas Vitamin B1 (Thiamin)
1. Kromatografi
● Kromatografi dengan deteksi UV-Vis dan fluoresensi
merupakan metode yang paling umum digunakan untuk
analisis vitamin B1
● Tiamin tidak bersifat fluoresen, akan tetapi vitamin ini
dan ester fosfatnya dapat direaksikan dengan kalium
heksasionoferat untuk menghasilkan senyawa tiokrom
yang bersesuaian
● Penggunaan tiokrom sebagai produk oksidasi tiamin yang
spesifik dan sangat berfluoresensi telah digunakan secara
rutin
Metode analisis vitamin B1 dengan fluoremetri
melibatkan tahapan-tahapan sebagai berikut:
 Hidrolisis asam
 Hidrolisis enzimatis
 Pembersihan ekstrak
 Pembentukan tiokrom
2. Metode Argentometri
Pada penetapan ini suasananya harus asam sebab jika suasananya basa akan
terjadi reaksi antara perak nitrat dengan basa membentuk Ag(OH) yang pada
tahap selanjutnya akan membentuk endapan Ag2O, akibatnya perak nitrat tidak
hanya bereaksi dengan sampel tetapi juga bereaksi dengan basa.

3. Metode Gravimetri
Tiamin dalam tablet vitamin B1 dalam injeksi dapat ditetapkan secara
gravimetric dengan cara mengendapkan larutan tiamin menggunakan asam
silikowolframat.

Prinsip:
Thiamin + Garam Reinecke -> endapan -> dikeringkan -> ditimbang

(hanya dapat dilakukan jika sampel mengandung thiamine >50 jika kurang lebih
baik menggunakan fluorometer atau kolorimeter)
2. Vitamin B2 (Riboflavin)
• Bentuk kristal jarum orange-kuning
• Kurang larut dalam air (11 mm/100 ml)
• Dalam bentuk kristal bersifat stabil sedangkan
dalam bentuk larutan mudah rusak
• Riboflavin bersifat stabil terhadap panas
 Metode Uji Efetivitas Vitamin B2
Metode Spektrofluorometri
• Metode ini mengukur riboflavin total setelah hidrolisis asam FMN dan FAD
menjadi riboflavin bebas
• Hidrolisis disempurnakan dengan autoklav menggunakan HCl 0,1 N selama
30 menit
• Protein dipisahkan dengan mengatur pH 4,5 dan menyaring atau
mensentrifusnya untuk menjernihkan esktrak
• pH selanjutnya ditingkatkan secara bertahap sampai pH 6,8 untuk mengecek
bahwa tidak ada pengendapan lanjut yang terjadi
• Prosedur AOAC mencatat bahwa penambahan natrium hidrosulf lebih dari 20
mg tiap tabung dapat mengurangi bahan-bahan berfluoresensi yag
mengganggu yang dapat menimbulkan ketidakakuratan hasil uji
• Riboflavin dapat diperoleh dengan penyerapan
menggunakan fuller`s earth dAri ekstrak hati segar atau
ekstrak lain yang mengandung lactoflavin
• Adsorpsi umumnya selesai dalam 10 menit
• Selanjutnya dilakukan elusi dengan larutan dietilamina
10-15% atau lart NaOH 0,2%
• Kadar vitamin B2 dapat dianalisis secara fluorimetrik
3. Vitamin B6 (Piridoksin)
• Piridoksin berupa bubuk tak berwarna dan berasa pahit
• Pirikdoksin mudah larut dalam air, alcohol, dan aseton
• Bersifat stabil dalam asam, basa, dan panas, namun
terpengaruh oleh cahaya
• Piridoksin memiliki gugus fungsional fenolat, sehingga
dapat membentuk reaksi warna yang dapat dimanfaatkan
dalam tekhnik analisis
 Metode Uji Efektivitas Vitamin B6

1. Fluorometri
• Metode Fluorometri melibatkan hidrolisis asam terhadap sampel
• Metode fluorometri telah digunakan untuk menganalisis vitamin B6 pada kedelai
• Ekstraksi sampel melibatkan: sampel diautoktav dengan adanya asam sulfat, dibufer
sampai pH 4,5 lalu didigesti dengan Claradiastae, diencerkan dan kemudian disaring

2. Metode Hochberg, Meinick, dan Oser

• Piridoksin yang terikat dibebaskanmelalui hidrolisis dengan HCl dan pemanasan
• Setelah diasamkan (pH 3,0) piridoksin bebas diserap dan absorben Llioyd
• Setelah pencucian dengan HCl, dilakukan elusi terhadap piridoksin yang terserap
dalam absorben, dengan larutan NaOH
• Eluat dijernihkan dengan isopropil alkohol
4. Vitamin B12 (Cyanocobalamin)
• Vitamin yang bermanfaat untuk sel darah merah,
mengoptimalkan fungsi saraf, menghasilkan
energi, serta menjaga Kesehatan kulit dan rambut
• Bersumber dari ikan, kerrang, daging, hati, telur,
susu, yoghurt dan keju
 Metode Uji Efektivitas Vitamin B12
1. Metode Spektofometri
• Metode ini digunakan untuk produk-produk farmasetik dengan
konsentrasi tinggi
• Diukur pada Panjang gelombang 362 nm

2. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

• Pengembangan metode kromatografi ini untuk analisis vitamin b12
dibatasi oleh sensitifitas dan selektifitasnya yang rendah. Oleh karen
itu, kebanyakan prosedurnya melibatkan tahapan clean up dan
pemekatan untuk menguji vitamin ini dalam konsentrasi rendah
• Detektor spectrometer massa mampu menawarkan sensitifitas yang
lebih baik dibandingkan detector UV
5. Vitamin B9 (Asam Folat)

• Folat merupakan nama umum termasuk asam

folat
• Folat bersifat labil terhadap oksidasi, sinar panas,
dan leaching saat makanan diolah
• Asam folat merupakan sekelompok senyawa yang
bersumber pada dedaunan hijau, memiliki
karakter seperti vitamin yang memiliki
antianemia
 Metode Uji Efektivitas Vitamin B9
• Folat sampel diekstrak dalam buffer pada 100
• Ekstrak diperlakukan dengan α-amilase, protease, dan
konjugasi
• Respon pertumbuhan L. rhamnosus diukur % transmitansi
• Perlu kehati-hatian tingkat tinggi untuk mencegah folat
teroksidasi dan mengalami degradasi fotokimia
• Agen pereduksi (asam askorbat, β-mercapto ethanol, dan
dithiothreitol) efektif untuk mencegah oksidasi
TERIMA
KASIH