Antigen Retrieval

Arya

1
ABC Protocol
 Fixation
• Fiksasi sangat penting dalam menentukan outcome
reaksi antigen-antibodi
• Manfaat fiksasi :
– Menjaga keutuhan komponen sel (protein struktural dan
soluble)
– Mencegah autolisis dan perubahan penyusun sel (antigen
dan enzim)
– Stabilisasi material sel dari akibat prosedur tindakan
– Fasilitasi pengecatan konvensional dan imunostaining
• Ada dua macam cara fiksasi
– Fiksasi cross linking (non koagulasi)
– Coagulating fixatives
 Cross-linking Fixation
• Gold standard :
formaldehid
• Mekanisme dasar fiksasi :
pembentukan addition
product antara formalin
dan grup amino reaktif yg
tak bermuatan (-NH atau
NH2) membentuk cross-link
• Jika terdapat hidrogen
reaktif kedua maka akan
terbentuk methylene
bridge
 Antigen retrieval
• AR bertujuan untuk optimalisasi imunoreaksi
• Tahap fiksasi akan mengubah struktur tersier protein
(antigen) sehingga sulit bereaksi dengan antibodi
• Metode untuk memulihkan perubahan akibat fiksasi
• AR terutama diperlukan pada jaringan yang difiksasi dengan
cross-link fixative
• Tanpa AR, Ab poliklonal lebih mudah deteksi Ag dibanding Ab
monoklonal
• Prosedur AR yang paling banyak dipakai
– Metode enzimatik
– Metode heat-based retrieval
– Cara lain : inkubasi slide dalam larutan alkali kuat, urea, larutan
asam, borohidrid, larutan sukrosa
 A.R enzimatik
• Huang et al mengenalkan metode protease-induced
epitope retrieval (PIER)
• Enzim yang dipakai : tripsin, proteinase K, pronase,
ficin, pepsin
• Efek dipengaruhi : konsentrasi dan tipe enzim,
parameter inkubasi (waktu, suhu, pH), dan durasi
fiksasi
• Waktu digesti enzimatik berbanding terbalik
dengan lama fiksasi
• Kelemahan metode PIER
– Rendahnya jumlah antigen
– Perubahan morfologi jaringan
– Destruksi epitop
 A.R heat-based
• Heat-induced epitope retrieval
(HIER) dikenalkan oleh Shi et al
• Konsep : reaksi kimia antara protein
dan formalin dapat dipulihkan/dibalik
dengan pemanasan atau hidrolisis
dengan alkali kuat
• Pemanasan dapat membuka epitop
melalui hidrolisis cross-link metilen
• Pemanasan suhu tinggi (100°C)
dengan durasi singkat (10 menit)
akan mendapat hasil yang lebih baik
dibanding pemanasan suhu rendah
dengan waktu yang lama