ISOLASI ENZIM AMILASE A.

Analisa prosedur
1. Pemotongan jaringan hepar sebanyak 1 gr dengan menggunakan gunting dilakukan untuk memperkecil ukuran sehingga memudahkan proses ekstraksi enzim. 2. Penggerusan jaringan menggunakan mortar dingin untuk menghancurkan sel dan ditambahkan pasir kuarsa untuk memudahkan penggerusan (pemecahan mekanik). Perlakuan ini dilakukan dalam suasana dingin supaya enzim tidak rusak. 3. Penambahan PBST PMSF sebanyak 3 ml berfungsi untuk melisiskan dinding sel sehingga enzim amylase dapat terekspose keluar (pemecahan kimiawi). Penambahan PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride) berfungsi sebagai penghambat protease yang dapat mencegah degradasi enzim amylase. 4. Sonikasi 50 Hz selama 10 menit dilakukan untuk merusak dinding sel dengan menggunakan gelombang ultrasonik sehingga enzim amylase terekspose keluar. 5. Pendinginan sampel dalam lemari es Berfungsi untuk menjaga stabilitas enzim 6. Sentrifugasi 6000 rpm selama 15 menit untuk memisahkan endapan yang merupakan organel sel dengan supernatan yang mengandung enzim amylase. 7. Penambahan etanol absolute kedalam supernatant sebesar 1:1 berfungsi untuk mengendapkan enzim. 8. Penyimpanan di dalam lemari es selama 1 malam sampai terebentuk endapan berfungsi untuk mengoptimalkan proses pengendapan. 9. Sentrifugasi 10000 rpm selama 15 menit dilakukan untuk memisahkan endapan yang merupakan enzim amylase yang diinginkan dengan supernatan. 10.Pengeringanginan sampel untuk menghilangkan etanol yang masih tersisa di dalam sampel.

11.Penambahan buffer Tris Cl 20 mM sebagai penyangga supaya protein tetap pada kondisi tersebut.

B. pembahasan Enzim merupakan molekul yang tidak stabil dengan sifat fisik dan kimia tertentu. Jika sifat fisik dan kimia berubah maka dapat menyebabkan penurunan aktivitas enzim atau bahkan dapat inaktif. Oleh karenanya isolasi enzim dilakukan dalam kondisi pH, kekuatan ionik dan suhu yang terkendali (Anonymous, 2009) http://www.molecular-plant-biotechnology.info/enzymebiotechnology/isolation-and-purification-of-enzymes.htm Beberapa hal yang perlu dipertimbangkan selama isolasi enzim yaitu teknik ekstraksi dan medium yang digunakan seperti pH, buffer garam, detergen, agen pereduksi, chelator atau ion logam, penghambat protease (Janson and Ryden, 1998). Jason, J.C and Ryden L. 1998. Protein Purification (Principles, High-Resolution Methode, and Applications). Second Edition. A John Willey and Sons, Inc Plubication. Canada Dalam proses ekstraksi, sebagian besar protein yang diinginkan berikatan pada membran atau partikel atau teragregasi karena bersifat hidrofob. Dalam kasus tersebut interkasi tersebut harus dikurangi dengan menggunakan detergen atau agen chaotropic. Detergen merupakan molekul amphipatic, ketika konsentrasinya meningkat maka akan terbentuk micell yaitu disebut critical micell concentration (CMC). Enzim amylase merupakan enzim endoseluler sehingga untuk mengekstraknya perlu merusak dinding sel. Proses isolasi enzim dilakukan dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik dilakukan dengan penggerusan dengan mortar dan sonikasi. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian suatu bahan yang dapat merusak membran sel salah satunya dengan detergen. Isolasi enzim secara kimiawi dilakukan dengan penambahan PBST yang mengandung NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, dan tween-20. Tween 20 merupakan detergen non ionic yang memiliki nama lain yaitu polisorbat 20. Menurut Machmud (2006), penambahan detergen dalam isolasi enzim endoseluler dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik detergen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein-detergen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hodrofobik, demikian juga dengan detergen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. (2005. 1X Phosphate Buffered Saline Tween-20 (PBST) Recipe. http://www.thelabrat.com/protocols/PBST.shtml). Selain itu pada proses isolasi dilakukan penambahan PMSF (phenyl methyl sulphonyl fluoride) yang merupakan serin protease inhibitor. PMSF secara

spesifik berikatan pada residu serin pada sisi aktif serine protease sehingga sifat katalitik enzim hilang (2009. PMSF.http://www.wikipedia.org/wiki/pmsf). Isolasi enzim secara kimiawi dikombinasikan dengan cara mekanik yaitu penggerusan dengan mortar dan sonikasi. Sonifikasi adalah metode yang digunakan untuk merusak sel dengan menggunakan gelombang bunyi frekuensi tinggi. Gelombang bunyi tersebut menyebabkan rusaknya dinding sel. Setelah sel rusak, komponen sel yang tidak larut dapat dipisahkan dengan melalui sentrifugasi (Seidman and Mowery, 2009). http://www.matcmadison.edu/biotech/resources/proteins/purification/sonicGuide.htm alcohol dapat merusak ikatan hidrogen yang terjadi antara gugus amida dalam struktur sekunder protein. Karena gugus amida rusak sehingga protein terdenaturasi dan mengendap (Ophart, C.E. 2003. virtual chembook. Elmhurst Collage). Beberapa pelarut organik seperti aseton, metanol, dan etanol dapat digunakan untuk mengendapkan protein karena air cenderung larut dalam etanol sehingga menurunkan kelarutan protein dan memulai pengendapan (Anonymous. 2009. Precipitation . http://www.molecular-plant-biotechnology.info/enzyme-biotechnology/preparation-ofcrude-enzymes.htm Hasil dari isolasi enzim menggunakan metode diatas maka dihasilkan ekstrak enzim amylase kasar. Enzim ini selanjutnya digunakan untuk pemurnioan dan uji aktivitas selanjutnya.