MODUL

POKOK BAHASAN :

Teknik Pewarnaan Bakteri

Teknik Pewarnaan GRAM (Pewarnaan Differensial) TUJUAN PRAKTIKUM : 1. Mempelajari cara menyiapkan apusan bakteri dengan baik sebagai prasyarat untuk mempelajari teknik pewarnaan; 2. Mempelajari prosedur Pewarnaan Gram, memahami tahapan prosedur dan reaksi kimiawi yang terlibat dalam prosedur. TINJAUAN PUSTAKA : Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri secara lebih jelas dikembangkan teknik pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion protoplasma sel. Terdapat dua kelompok zat pewarna bakteri, yaitu : (1) bersifat Asam, berupa anion dan umum digunakan dalam bentuk garam natrium. (2) bersifat Alkali, berupa kation dan umum digunakan dalam bentuk klorida. Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil rekasi zat warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan istilah zat Pematek yang akan melekatkan zat warna pada plasma sel.

Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu : Pewarnaan Sedehana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam zat warna seperti : Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin. Pewarnaan Differensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna.

Pengamatan morfologi bakteri hasil pewarnaan dilakukan di bawah pengamatan mikroskop.

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012 Page 19

Berdasarkan Pewarnaan GRAM, bakteri diklasifikasikan ke dalam 2 (dua) kelompok besar yaitu : Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Perbedaan utama di antara keduanya adalah struktur dan komposisi dinding selnya. Bakteri Gram Positif mampu mempertahankan zat warna utama dalam pewarnaan Gram, yaitu Gentian Violet, sehingga nampak berwarna ungu saat pengamatan dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini tersusun oleh sebagian besar Peptidoglikan, yang mampu mengikat zat warna dan tidak rusak saat dicuci dengan alcohol. Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki komposisi dinding sel yang sebagian besar tersusun dari lapisan lipid, sehingga pada saat pewarnaan kurang dapat mempertahankan zat warna utama terutama saat dicuci dengan alcohol (lipid rusak saat dicuci dengan alcohol), akibatnya kelompok bakteri ini memberikan kenampakan warna merah (warna dari zat warna ke dua : safranin atau air fuchsin) di akhir kegiatan pewarnaan Gram. Seri reagen yang digunakan dalam Teknik Pewarnaan Gram meliputi : Zat Warna I (Gentian/Crystal Violet), Larutan Iodine, Alcohol, dan Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin). Adapun ilustrasi kondisi sel bakteri saat pewarnaan Gram tampak seperti pada Gambar berikut :

Gambar : Kondisi Sel Bakteri saat Pewarnaan Gram Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012 Page 20

PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM : 1. TEKNIK PEMBUATAN APUSAN BAKTERI Alat : Jarum Ose Gelas Object Bunsen Prosedur : Sumber dari biakan Padat (Agar Culture) 1. Dengan menggunakan Jarum Ose, ambil 2 loop NaCl Fisiologis, tempatkan di atas Object Glass; 2. Dengan menggunakan Jarum Ose (ujung runcing), ambil 1 koloni bakteri dari biakan Padat, tempatkan di atas suspensi NaCl Fisiologis yang sudah ada di atas Object Glass, 3. Ratakan suspensi dengan membentuk area apusan; 4. Keringkan suspensi pada suhu ruang untuk beberapa menit; 5. Lewatkan suspensi di atas api bunsen untuk fiksasi apusan. Sumber dari biakan Cair (Broth Culture) 1. Dengan menggunakan Jarum Ose, ambil 2 loop Biakan Cair (Broth Culture), tempatkan di atas Object Glass; 2. Ratakan suspensi dengan membentuk area apusan; 3. Keringkan suspensi pada suhu ruang untuk beberapa menit; 4. Lewatkan suspensi di atas api bunsen untuk fiksasi apusan. Bahan : Biakan (Agar Culture/ Broth Culture) NaCl Fisiologis Spiritus

Ilustrasi Teknik Pembuatan Apusan bakteri dapat dilihat pada Gambar berikut :

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012

Page 21

Gambar : Teknik Pembuatan Apusan Bakteri

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012

Page 22

2. TEKNIK PEWARNAAN GRAM Alat : Object Glass Cover Glass Pipet Tetes Botol Semprot Bunsen Bahan : Apusan Bakteri Zat Warna Gentian Violet Iodine Alcohol Zat Warna Safranin/ Air Fuchsin Aquades Spiritus

Prosedur : 1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya; 2. Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet) ke atas area apusan, biarkan selama 20 detik; 3. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik; 4. Teteskan 1 tetes Larutan Iodine ke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1 menit; 5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak berwarna (sekitar 10 20 detik); 6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik; 7. Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin), biarkan selama 20 detik; 8. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik; 9. Keringkan di suhu ruang; 10. Amati di atas mikroskop dengan perbesar 100 x Objektif, dengan bantuan minyak imersi;

Ilustrasi Prosedur Pewarnaan Gram dapat dilihat pada Gambar berikut :

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012

Page 23

Gambar : Prosedur Pewarnaan Gram

PARAMATER YANG DIAMATI :

No Sumber Isolat Positif GRAM Negatif Perbesaran Mikroskop

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012

Page 24