Pemisahan fragmen DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Pemisahan fragmen DNA dilakukan melalui elektroforesis gel agarosa berdasarkan Ausubel
dkk. (2002: 2-13). Gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 1 % dalam TBE buffer 1x. Sampel
DNA ditambahkan dengan 6 x loading dye. Campuran kemudian dihomogenisasi dengan cara
pemipetan dan campuran dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Marker 1 kb DNA ladders
dimasukkan ke dalam masing-masing sumur gel sebagai pembanding ukuran fragmen DNA.
Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 100 V selama 25 -- 30 menit. Gel agarosa
dimasukkan ke dalam wadah berisi etidium bromida (EtBr) selama 15--30 menit. Hasil
elektroforesis dapat dilihat di bawah sinar UV, kemudian difoto menggunakan kamera digital.
Hasil positif ditandai dengan munculnya 3 fragmen DNA berukuran 4000 bp, 3500 bp dan
830 bp.
Caranya:
Dilarutkan 5 g bubuk agarosa ke dalam tabung erlenmeyer yang telah
berisi 50 ml larutan buffer TBE, kemudian dipanaskan campuran hingga semua
agarosa larut dan larutan menjadi bening. Didinginkan larutan hingga mencapai
suhu 60 C, selanjutnya dipasang sisir pembentuk sumur di atas tempat pencetak
gel, lalu secepatnya larutan agarosa yang hangat dituang ke dalam cetakan.
Dipastikan jangan sampai ada gelembung udara di bawah atau diantara ruas-ruas
dari tempat pencetak gel. Dibiarkan gel mengeras (sekitar 30-40 menit pada suhu
ruang), lalu diangkat sisir pembentuk sumur dan diletakan gel pada tangki
elektroforesis dan ditambahkan larutan buffer TBE sampai larutan buffer
menutupi seluruh permukaan gel. Dicampur 5 l DNA dengan 1 l buffer loading
dye, lalu dibuat campuran untuk penanda (1 l buffer loading dye, 4 l akuades,
1 l Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Marker). Dimasukkan campuran-campuran
tersebut ke dalam sumur pada gel secara perlahan dengan menggunakan
mikropipet ukuran 10 l. Selanjutnya ditutup tangki elektroforesis dengan
penutupnya kemudian dihubungkan dengan arus listrik pada tegangan 135 volt
selama 20 menit. Setelah itu, dilakukan pewarnaan gel dengan EtBr.

Elektroforesis
Elektroforesis dilakukan untuk melihat kandungan plasmid dan kemurniannya dari berbagai
campuran seperti RNA dan lain-lain. Adapun langkah-langkahnya adalah sebagai berikut:
1.

Agarose 0,4 g dicampurkan dengan TAE 1X sebanyak 40 ml dan dipanaskan

menggunakan microwave hingga larut sempurna, lalu ditunggu sampai hangat ,
kemudian ditambah SYBR Safe DNA Gel Stain sebanyak 1 l.

2.

Cetakan agar beserta sisir elektroforesis disiapkan, lalu larutan agarose yang telah
ditambah SYBR Safe DNA Gel Stain dituangkan, lalu tunggu sampai padat.

3.

Sisir elektroforesis dilepaskan dari agar dan agar dimasukkan kedalam tangki
elektrofoersis, kemudian agar direndam menggunakan TAE.

4.

DNA sampel sebanyak 5 l dan loading dye 6 X 1 l dihomogenkan, lalu dimasukkan

kedalam sumuran yang terbentuk.

5.

Ladder akan dimasukkan kedalam sumuran berikutnya.

6.

Running dengan voltase 100 V dan waktu 30 menit.

7.

DNA divisualisasikan menggunakan UV Transilluminator..

Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Gel agarose 1 % dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x (Tris-HCl
pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM, EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM,
asam borat 83 mM, EDTA 1 mM), dipanaskan hingga jernih dengan microwave. Setelah suhu
tidak terlalu panas (60 C), gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan
dipasang sisir untuk membuat sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir dilepas kemudian gel
dipindah ke dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 l DNA dicampur dengan larutan
pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25 %, xylene cyanol FF 0,25 %, sukrosa 40 %).
Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, yang dipotong dengan
enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai
migrasi, direndam dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di atas UV setelah dicuci
dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA
plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng.
Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.