PEMANFAATAN SALMONELLA TYPHI SEBAGAI VEKTOR ANTI KANKER

Anggi Prayoga
Fakultas Ilmu Tarbiyah dan Keguruan Tadris IPA Biologi
IAIN Syekh Nurjati Cirebon
angyog16@gmail.com
Abstrak: Kurangnya kekhususan agen terapeutik adalah keterbatasan utama dalam pengobatan
tumor. Penggunaan istimewa mereplikasi bakteri sebagai agen terapeutik adalah sebuah
pendekatan inovatif untuk pengobatan tumor. Hal ini didasarkan pada pengamatan bahwa
obligat atau anaerob fakultatif bakteri tertentu mampu mengalikan selektif dalam tumor dan
menghambat pertumbuhan mereka. Bakteri telah dipekerjakan sebagai agen antitumor yang
mampu istimewa memperkuat dalam tumor dan menghambat pertumbuhan mereka. Selain itu,
faktor bakteri yang diturunkan memiliki efek kekebalan-stimulasi. Oleh karena itu, bakteri
dapat mentransfer gen terapeutik ke dalam sel-sel tumor menggunakan kemampuan infektif
mereka. Di sini, kami memperkenalkan aplikasi bakteri untuk terapi tumor dan fokus pada
Salmonella, yang telah banyak digunakan untuk terapi tumor. Salmonella terutama telah
diterapkan sebagai vektor gen-pengiriman, aktivator kekebalan antitumor dan pemicu kematian
sel tumor. Penelitian ini tidak hanya akan mengevaluasi efektivitas terapi Salmonella untuk
pengobatan tumor, tetapi juga akan menjelaskan mekanisme yang mendasari kegiatan
antitumor dimediasi oleh Salmonella, yang melibatkan tuan rumah respon imun dan respon
molekul seluler. Ada sedikit investigasi bakteri sebagai vektor pengiriman gen. Di sini, kita
menunjukkan bahwa rekayasa genetika Salmonella telah banyak sifat-sifat yang diinginkan dari
vektor pengiriman, termasuk penargetan beberapa tumor dari situs inokulasi jauh, replikasi
selektif dalam tumor, keterbelakangan tumor, dan kemampuan untuk mengekspresikan gen
efektor, seperti herpes yang simplex virus timidin kinase (HSY TK). Ketika tipe liar Salmonella
diperkenalkan ke tikus melanoma-bantalan, bakteri yang ditemukan dalam tumor pada tingkat
melebihi 109 per g, meskipun sebagai patogen, mereka menyebabkan kematian tikus. Namun,
ketika dilemahkan, mutan auksotrofik hyperinvasive digunakan, tumor-penargetan dan
fenomena amplifikasi dipertahankan, sedangkan patogenisitas mereka terbatas.

Pendahuluan
Baru-baru ini, perawatan tumor umum termasuk operasi, terapi radiasi, dan kemoterapi
telah menunjukkan beberapa keterbatasan. Operasi dan terapi radiasi terbatas pada tumor lokal,
dan kemoterapi dapat menyebabkan efek samping yang parah. Salmonella merupakan bakteri
gram-negatif, anaerob fakultatif yang merupakan penyebab umum dari infeksi usus. Karena
imunostimulasi besar diproduksi oleh Salmonella lipopolisakarida (LPS) dan komponen
lainnya, infeksi sistemik dengan Salmonella menginduksi ekspresi sitokin proinflamasi dan
infiltrasi sel kekebalan dalam host. Sistemik diberikan Salmonella adalah istimewa akumulasi
dalam tumor untuk setidaknya satu bulan, membentuk rasio tumor-to-normal jaringan melebihi
1000-10,000 ke 1. Selanjutnya, akumulasi ini disertai dengan keterlambatan dalam
pertumbuhan tumor. Salmonella dapat tumbuh di bawah kedua kondisi aerobik dan anaerobik,
sehingga mereka mampu menjajah tumor metastatik kecil serta tumor yang lebih besar.
Salmonella dilemahkan menghambat pertumbuhan tumor di berbagai tumor manusia dan tikus.
pertumbuhan tumor dihambat untuk waktu yang lama, bahkan sampai beberapa minggu.
Observasi ini, ditambah dengan kemudahan manipulasi genetik, menunjukkan bahwa
Salmonella adalah kandidat yang baik untuk agen antitumor terapi, dan rekayasa genetika
Salmonella telah dikembangkan untuk mengekspresikan gen eksogen, yang bertujuan untuk
meningkatkan efek antitumor.
Kanker merupakan penyakit yang menempati peringkat kedua se- bagai penyebab
kematian. Hal ini menyebabkan pengembangan pene- litian untuk menemukan obat-obat baru
terus berkembang, bahkan dari bahan alampun kini banyak diteliti untuk pengobatan penyakit
kanker ini (Anderson, 2001).
Kejadian dan jenis penyakit kanker erat hubungannya dengan berbagai faktor antara lain
adalah jenis kelamin, usia, ras, dan paparan terhadap beberapa zat yang bersifat karsinogenik
(Katzung, 1992). Zat yang bersifat karsinogen ini dapat dibagi dalam beberapa kelompok baik
yang sintetik maupun yang ber- asal dari alam (Winek, 1977).
Salmonella merupakan bakteri yang ditemukan di Amerika pada tahun 1899
(Dharmojono, 2001). Salmonella typhi disebut juga Salmonella choleraeszls serovar typhi,
Salmonella serovar typhi , Salmonella enterica serovar typhi (Holt, et al., 1994 dan Anonimous,
2001). S. typhi adalah strain bakteri yang menyebabkan terjadinya demam tipoid. Sakit yang
disebabkan oleh Salmonella disebut salmonelosis.
1. Morfologidan Struktur Salmonella typhi

Salmonella typhi merupakan kuman batang Gram negatif, yang tidak memilikispora,
bergerak dengan flagel peritrik, bersifat intraseluler fakultatif dan anerob fakultatif'. Ukurannya
berkisar antara 0,7- 1,5X 2-5 pm, memiliki antigen somatik (O),antigen flagel (H) dengan 2
fase dan antigen kapsul (Vi). Kuman ini tahan terhadap selenit dan natrium deoksikolat yang
dapat membunuh bakteri enterik lain, menghasilkan endotoksin, protein invasin dan MRHA
(Mannosa Resistant Haemaglutinin).

Bakteri Salmonella typhi pada pewarnaan Gram

Salmonella typhi mampu bertahan hidup selama beberapa bulan sampai setahunjika
melekat dalam, tinja, mentega, susu, keju dan air beku 4,5. Salmonella typhi adalah parasit
intraseluler fakultatif, yang dapat hidup dalam makrofag dan menyebabkan gejala-gejala
gastrointestinal hanya pada akhir perjalanan penyakit, biasanya sesudah demam yang lama,
bakteremia dan akhirnya lokalisasi infeksi dalam jaringan limfoid submukosa usus kecil.
2. Epidemiologis Salmonella typhi
Menurut Jay (2000), secara epidemiologis Salmonella dapat dibedakan menjadi tiga kelompok:
1. Salmonella yang hanya menginfeksi manusia, diantaranya S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi
C. Kelompok ini termasuk agen yang menyebabkan demam typhoid dan paratyphoid, yang
menjadi penyebab sebagian besar serangan salmonella. Demam typhoid memiliki masa
inkubasi terpanjang, menghasilkan suhu badan yang tertinggi, dan memiliki angka mortalitas
yang tertinggi. S. typhi dapat diisolasi dari darah dan kadang-kadang feses dan urin penderita
yang menderita demam enterik. Sindrom paratyphoid lebih lemah dibanding typhoid.
2. Serovar yang beradaptasi dengan host (beberapa patogen untuk manusia dan mungkin
disebarkan dari makanan) diantaranya S. galinarum (ayam), S. dublin (sapi), S. abortus-equi
(kuda), S. abortus-ovis (domba), dan S. choleraesuis (babi).
3. Serovar yang belum beradaptasi (tidak membutuhkan host). Salmonella ini sangat patogen pada
manusia dan hewan, diantaranya termasuk seluruh foodborne serovar. COX (2000)

menjelaskan berdasarkan model skema antigen Kauffmann-White, serovar salmonella dapat

dikelompokkan berdasarkan perbedaan reaksinya terhadap antibodi yang spesifik.
Berdasarkan tipe minor permukaan sel antigen dapat dikelompokkan menjadi:
a) Perbedaan komponen epitope lipopolisaccharida (LPS), yaitu suatu komponen major membran
luar bakteri Gram-negatif yang membentuk somatic antigen (O antigen) dan diberi symbol
angka (1-67),
b) Variasi flagellinnya (H antigen) yaitu subunit protein flagella, beberapa serovar hanya
membentuk satu bentukan flagelin (monophasic) dan yang lainnya diphasic bahkan triphasic.
Phase 1 H antigen diberi kode huruf kecil atau kombinasi huruf kecil dan angka, sedangkan
phase 2 H antigen diberi kode angka. Dengan dasar tersebut, sejak tahun 1996 diketahui ada
2.435 serovar Salmonella enterica dan sebanyak 58,9% termasuk kedalam subspesies enterica.
Menurut Cox (2000) genus Salmonella termasuk dalam famili Enterobacteriaceae, adalah
bakteri Gram-negatif berbentuk batang langsing (0.7 1.5 x 2-5 m), fakultatif anaerobik,
oxidase negatif, dan katalase positif.
Sebagian besar strain motil dan memfermentasi glukosa dengan membentuk gas dan asam.
Menurut Dahmojono (2001) salmonella umumnya terdapat sendirian (tunggal), jarang
membentuk rantai lebih dari dua sel. Dalam kultur ekstrak agar (yeast extract agar), koloni
bakteri terlihat licin, mengkilat dan transparan. Tetapi dalam kultur dengan ifusi ayam (chicken
infusion), koloni tumbuh lebih subur dan aspeknya tidak begitu transparan. S. typhi dapat
memproduksi H2S tetapi tidak dapat membentuk gas dari glukosa. Berbeda dengan lainnya S.
typhi tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon, tidak dapat melakukan dekarboksilasi
terhadap ornitin, dan tidak memfermentasi rhamnosa. Bakteri ini dapat tumbuh pada suhu
antara 5-47 0C, dengan suhu optimum 35-37 0C. Beberapa sel tetap dapat hidup selama
penyimpanan beku. Salmonella dapat tumbuh pada pH 4,1- 9,0 dengan pH optimum 6,5-7,5.
Nilai pH minimum bervariasi bergantung kepada serotype, suhu inkubasi, komposisi media, aw
dan jumlah sel. Pada pH dibawah 4 dan diatas 9 salmonella akan mati secara perlahan (Supardi
dan Sukamto, 1999).
Menurut Ray (2001) salmonella umumnya memfermentasi dulcitol, tetapi tidak laktose,
menggunakan sitrat sebagai sumber karbon, menghasilkan hidrogen sulfida, decarboxylate
lysine dan ornithine, tidak menghasilkan indol, dan negatif untuk urease. Merupakan bakteri
mesophylic, dapat dimatikan pada suhu dan waktu pasteurisasi, sensitif pada pH rendah ( 4,5)
dan tidak berbiak pada Aw 0,94, khususnya jika dikombinasikan dengan pH 5,5 atau kurang.
3. Mikroskopis dan makroskopis Salmonella typhi

Salmonella typhi adalah bakteri yang selnya berbentuk batang berukuran 0,7-1,5pm x
2,0-5,0 pm, bersifat Gram-negatip sehingga mempunyai komponen outer layer (lapisan luar)
yang tersusun dari LPS (lipopolisakariada) dan dapat berfungsi sebagai endotoksin, bergerak
dengan flagel peritrik, tidak membentuk spora. Pada media MacConkey koloni transparan
karena bakteri tidak memfermentasikan laktosa, dengan diameter koloni 2-4 mm. Media
MacConkey adalah media yang engandung garam empedu dan Kristal violet yang fungsinya
dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram-positip. Selain itu media tersebut mengandung
laktosa dan indikator neutral red yang dapat untuk menunjukkan terjadinya perubahan pH pada
media sehingga dapat untuk membedakan antara bakteri yang memfermentasikan laktosa
secara cepat, lambat atau tidak memfermentasikan laktosa. (Koneman, et all. 1992;Holt et al.,
1994; Talaro et al., 2A0D. Sealain itu bakteri S.typhi juga memiliki pilli atau fimbriae yang
berfungsi untuk adesi pada sel host yang terinfeksi. Pilli merupakan bentukan batang lurus
dengan ukuran lebih pendek dan lebih kaku bila dibandingkan dengan flagella. Pilli tersusun
atas unit protein yang disebut pillin, mempunyai struktur yang berbentuk pipa, mempunyai
peran dalam proses konjugasi, sebagai reseptor bagi bakteriofag dan berperan pula dalam proses
perlekatan (adesi) antara bakteri dengan permukaan sel inang. OIeh karena itu pilli mempunyai
peran dalam proses patogenesis bakteri, selain itu pilli mampu menginduksi terbentuknya
respon imun pada hewan yang terinfeksi.
4. Sifat fisiologis Salmonella typhi
Salmonella typhi adalah bakteri yang berdasarkan kebutuhan oksigen bersifat fakultatif
anaerob, membutuhkan suhu optimal 37'C untuk pertumbuhannya, memfermentasikan Dglukosa menghasilkan asam tetapi tidak membentuk gas, oksidase negatip, katalase positip,
tidak memproduksi indol karena tidak menghasilkan enzim tryptophanase yang dapat memecah
tryptophan menjadi indol, methyl red (NIIR.) positip menunjukkan bahwa fermentasi glukosa
menghasilkan sejumlah asam yang terakumulasi di dalam medium sehingga menyebabkan pH
medium menjadi asam (pH=4,2), dengan penambahan indikator metyl red maka warna medium
menjadi merah. Voges-Proskauer(VP) negatip, citrat negatip, menghasilkan H2S yang dapat
ditunjukkan pada media TSIA (Triple Sugar lron Agar). Bakteri menghasilkan H2S yang
merupakan produk hasil reduksi dari asam amino yang mengandung sulfur, H2S yang
dihasilkan akan bereaksi dengan garam Fe dalam media yang kemudian menjadisenyawa FeS
berwarna hitam yang mengendap dalam media. Urease negatip, nitrat direduksi menjadi nitrit,
lysin dan ornithin dekarboksilase positip, laktosa, sukrosa, salisin dan inositol tidak
difermentasi, Uji ONPG negatip karena tidak menghasikan enzim betha galaktosidase sehingga
bakteri tidak dapat memfermentasikan laktosa, oleh karena itu strain bakteri S.typhi termasuk
5

anggota familia enterobacteriaceae yang bersifat tidak memfermentasikan laktosa (non lactosa
fermenter ), IiPase dan deoksiribonuklease tidak diproduksi ( Brenner, et al.1984; Koneman, et
al. 1992; Talaro et al.,2002).

Metode dan hasil dari penelitian

Kanker merupakan penyakit yang menempati peringkat kedua sebagai penyebab
kematian. Hal ini menyebabkan pengembangan penelitian untuk menemukan obat-obat baru
terus berkembang, bahkan dari bahan alampun kini banyak diteliti untuk pengobatan penyakit
kanker ini (Anderson, 2001). Kejadian dan jenis penyakit kanker erat hubungannya dengan
berbagai faktor antara lain adalah jenis kelamin, usia, ras, dan paparan terhadap beberapa zat
yang bersifat karsinogenik (Katzung, 1992). Zat yang bersifat karsinogen ini dapat dibagi dalam
beberapa kelompok baik yang sintetik maupun yang berasal dari alam (Winek, 1977).
Strain bakteri rekombinan secara khusus bisa untuk menargetkan jaringan tumor dan
menghasilkan terapi agen langsung di dalam jaringan neoplastik. Dengan demikian, Salmonella
enterica serovar

Typhimurium

dan

spesies Clostridium telah

intensif

dieksplorasi. Menggabungkan imun intrinsic dimediasi dan terapi bakteri berbasis vektor
ekstrinsik bisa menjadi strategi pengobatan baru dan inovatif untuk pasien kanker dimasa
depan. Wild type bakteri (WT) akan menyebabkan berat septikemia dengan hasil yang
fatal. Bakteri terlalu kuat dilemahkan tidak akan merangsang sistem kekebalan tubuh cukup
atau tidak mungkin mencapai tumor sama sekali. Yang terakhir ini mungkin penjelasan untuk
mengecewakan hasil dari uji klinis pertama di mana yang aman varian S. Typhimurium dengan
lipid dimodifikasi A bagian dari LPS digunakan.
Strategi pelemahan alternatif adalah digunakan lipopolisakarida (LPS). Struktur LPS
telah diubah dengan menghapus gen yang terlibat dalam sintesis nya. LPS dikenal penting
untuk integritas bakteri pembawa. Di sisi lain, LPS sangat imunostimulan. Lipid a, sebagai
bagian struktural terdalam LPS yang kemungkinan besar diperlukan untuk invasi optimal tumor
padat oleh bakteri. Untuk mengakomodasi dua tuntutan yang berlawanan, pertama kita uji
mutan dengan struktur LPS dimodifikasi untuk kinerja mereka di vitro dan pada tikus yang
menderita tumor. Hanya varian dimana LPS struktur inti menunjukkan data pro keselamatan
diterima. Untuk mendamaikan fitur ini dengan immunostimulatory diperlukan potensi dan
terapi, LPS kemudia dilengkapi dengan mutan memungkinkan membangun ekspresi induksi
dan melengkapi gen.
Strain dan kondisi pertumbuhan bakteri. Untuk strain bakteri dan plasmid yang
digunakan dalam penelitian ini dan genotipe dan sumber mereka, dalam bahan
6

tambahan. Bakteri ditumbuhkan dalam medium LB di 37 C baik untuk mid-log fase untuk
subkultur (3 jam) atau semalam. Untuk induksi PBAD ekspresi, 0,2% (wt / vol) arabinosa
adalah

ditambahkan

ke

subkultur

sebelum

inokulasi.

Melengkapi

konstruksi.

Mutan rfaD dan rfaG gen dari ATCC 14028 diamplifikasi melalui PCR dengan primer dengan
situs restriksi yang sesuai sebagai berlebihan. Dalam kasus rendah-copy-nomor plasmid
pCMVm4A, PBAD promotor telah dipindahkan dari pHL302 sebelumnya. Untuk kromosom
integrasi ke dalam araBAD lokus, yang araBAD lokus ditukar dengan yang rfaD dan rfaG gen
oleh lambda Red-dimediasi rekombinasi (3 2, 33).

Gambar 1. stimulasi Salmonella-dimediasi kekebalan antitumor. Salmonella-diaktifkan sel

dendritik atau makrofag oleh komponen bakteri, seperti lipopolisakarida (LPS), asam
lipoteikoat (LTA), dan flagellin. Salmonella menghambat tumor dengan meningkatkan sel
infiltrasi atau dengan ekspresi sitokin.
Antibodi dan Salmonella
Sel B memainkan peran penting dalam aktivitas antitumor dimediasi oleh Salmonella.
Meskipun Salmonella akumulasi dalam tumor di B sel-kekurangan tikus, beban bakteri dari
organ yang sehat lebih tinggi daripada yang di-tikus liar. Sitokin inflamasi dan bakteremia
ditemukan di B tikus sel-kekurangan setelah pengobatan Salmonella. Ketika Salmonella
akumulasi dalam tumor, sel B menghambat penyebaran Salmonella ke organ sehat lainnya.
Sebuah sumber utama antibodi alami tampaknya menjadi sel bagian B-1. Ada juga bukti
antibodi alami dengan kekhususan untuk berbagai antigen bakteri. Antibodi alami yang
dihasilkan oleh sel B mengambil bagian dalam kendali Salmonella diseminasi pada tikus yang
menderita tumor. Antibodi alami yang dihasilkan oleh sel B menghasilkan total jumlah sedikit
7

lebih rendah dari bakteri dalam situs tumor, tetapi menurun peradangan dan produksi sitokin
dalam organ yang sehat setelah perawatan Salmonella sistemik. Sebuah studi fase I dilemahkan
Salmonella (VNP20009) pada manusia dengan melanoma dilaporkan. Tidak ada tanggapan
antitumor yang diamati dan VNP20009 terdeteksi pada lokasi tumor hanya 12,5% dari pasien .
Studi klinis ini tidak berhasil, yang mendorong pertanyaan tentang bagaimana faktor-faktor ini
dalam host mempengaruhi akumulasi Salmonella dalam tumor padat. Salmonella memiliki
potensi besar sebagai stimulan kekebalan tubuh. Namun, setelah pemberian Salmonella,
kekebalan tuan rumah yang kuat dapat berkembang. Selain itu, antibodi yang ditujukan
terhadap Salmonella juga disintesis. Tanggapan anti-Salmonella kekebalan yang ada di
pengaruh tuan potensi tumor-penargetan Salmonella setelah pemberian sistemik. Hilangnya
akumulasi Salmonella dalam tumor kontribusi terhadap penghambatan respon antitumor
Salmonella-dimediasi. Hasil ini mungkin menjelaskan akumulasi terbatas Salmonella dalam
situs tumor dan respon antitumor non-signifikan setelah pemberian sistemik dalam uji klinis.
Salmonella membunuh tumor
Salmonella telah dilaporkan memiliki aktivitas antitumor. Mekanisme yang mendasari
kegiatan antitumor langsung mereka sebagian besar tidak diketahui. Penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa induksi apoptosis tumor berkorelasi dengan akumulasi Salmonella di situs
tumor. Salmonella di tumor apoptosis diinduksi oleh beberapa mekanisme, termasuk kompetisi
untuk nutrisi dan stimulasi kekebalan respon. Selain itu, racun dari bakteri dapat menginduksi
apoptosis tumor. Seperti replikasi bakteri pada tumor dan lisis selanjutnya sel tumor dapat
menyebabkan respon kekebalan yang dimediasi sel ke sel tumor, oncolysis tinggi dapat
menjelaskan, sebagian, untuk infiltrasi meningkat dari sel-sel kekebalan tubuh pada tumor. Selsel yang mengalami kematian sel Salmonella yang diinduksi menunjukkan heterogen fitur
morfologi. Hal ini jelas bahwa lebih dari satu mekanisme yang terlibat dalam pembunuhan
Salmonella diinduksi sel. Baru-baru ini, kami menunjukkan bahwa Salmonella dapat
menyebabkan kematian sel melalui apoptosis dan autophagic jalur dengan menggunakan
inhibitor autophagy (3-methyladenine) dan inhibitor apoptosis (Z-VAD-FMK). Autophagy
terlibat dalam penghapusan pertahanan sel bakteri. Jalur sinyal yang menyebabkan aktivasi
bakteri-diinduksi autophagy pada sel tumor tetap harus dijelaskan. AKT yang / mTOR /
p70S6K jalur sinyal negatif mengatur autophagy. Kami menetapkan bahwa tingkat AKT
terfosforilasi, mTOR, dan p70S6K mengalami penurunan secara signifikan dalam sel tumor
Salmonella-diperlakukan. Hasil ini menunjukkan bahwa Salmonella dapat menginduksi
aktivitas autophagic.

Gambar 2. Salmonella-dimediasi jalur kematian sel pada sel tumor.

Panah menunjukkan bahwaSalmonella menginduksi jalur sinyal. datar menunjukkan bahwa
Salmonella menghambat sinyal. Salmonella menginduksi kematian sel tumor dengan
mengaktifkan caspase atau down-mengatur AKT / mTOR sinyal jalur. Autophagy dapat coterjadi dengan apoptosis pada sel tumor terkena Salmonella. Selanjutnya, pada tahap akhir dari
infeksi, autophagy mungkin sebagian berpartisipasi dalam pelaksanaan kematian sel tumor
dengan meningkatkan apoptosis. Ketika apoptosis diblokir, sel-sel tumor yang terinfeksi
menjalani meningkat autophagy. Data ini menunjukkan bahwa pengobatan Salmonella efisien
menginduksi baik autophagy dan apoptosis, yang mitra untuk menginduksi kematian sel
kooperatif dengan memodifikasi Beclin-1 dan ekspresi caspase. Apoptosis dan autophagy ada
crosstalk antara dua jalur. Salmonella diinduksi baik apoptosis dan autophagy. Kedua apoptosis
dan autophagy bekerja sama untuk menyebabkan kematian sel tumor setelah infeksi
Salmonella.
Garis sel dan di Vitro Invasion Tes

Bakteri yang tipe liar Salmonella typhimurium galur 14028 (ATCC CDC65 I 6-60) dan
turunannya auksotrofik berikut: YS72 tpur =); YS72 l
(Pur ", ilv-); YS7211 (pur>, u: arg-); YS7212 tpur "; u : ura-); dan
YS7213 (pur "; ilv"; ter- cium). baris melanoma manusia M2 diberikan oleh Dr. C. Cunningham
(Harvard Medical School, Cambridge, MA). sel Bl6Fl0 disediakan oleh Dr. I. J. Fidler (M. D.
Anderson Cancer Center, Houston, TX). Semua baris sel lainnya diperoleh dari American Type
Culture Collection. invasi bakteri dari sel hewan berbudaya dilakukan di Datang termos kultur
jaringan (25 cm2) dengan menggunakan sulfat gentamisin, sebagaimana telah diubah dari Lee
dan Falkow (4). Berikut 15- atau periode invasi dan 30-min incubations 30-menit dengan 50 ug
9

/ ml gentamisin, sel-sel hewan yang kuantitatif menilai di counter Coulter (Coulter Electronics,
Inc.), dan bakteri yang kuantitatif menilai oleh pengenceran serial pada LB agar. Data
dinyatakan sebagai jumlah menginfeksi bakteri / 106 sel hewan (gentamisin-tahan).

Isolasi Auxotrophs dan Pengujian virulensi pada Mencit

Strain 14.028 dan YS72 yang termutasi dengan 50 ug / ml nitrosoguanidin (20 menit pada 37
C) dan radiasi UV (50 J / m2, A = 254 nm; Ref 15.). Dalam satu studi, tiga pur "klon mutan
auksotrofik terpisah diisolasi dari
14.028, dan tiga terpisah pur + reversi klon diisolasi dari YS72 dan diuji untuk virulensi pada
tikus dan potensi invasi ke sel melanoma M2 in vitro. Dalam studi lain menggunakan YS72
sebagai strain induk, polyaux otrophs YS72 saya, YS72 l i, YS72 l 2, dan YS72 l 3 dibangun
dan juga diuji untuk virulensi dan invasif. Virulensi diuji dengan menyuntikkan kelompok tikus
C57B6 i.p. dengan 106 bakteri dan mengukur waktu yang berarti mati (12). Metode ini dipilih
atas bahwa metode LDso karena menghasilkan direproduksi, hasil yang signifikan secara
statistik dengan tikus yang lebih sedikit. C57BL6 tikus (n = 8-12 hewan) disuntik i.p. dengan
masing-masing mengisolasi, tikus diizinkan untuk makan dan minum ad libitum, dan kandang
dimonitor untuk tikus mati atau sekarat. Semua hewan yang masih hidup eutanasia 10, 30, atau
60 hari setelah inocu lation dengan bakteri. tergantung pada percobaan. Data dinyatakan
sebagai berarti: : survival SD setelah inokulasi dengan bakteri (dalam hari).

Implantasi Tumor dan Penghitungan Bakteri

C57B6 dan DBA / 2J mencit diinokulasi S.C. di wilayah bahu kiri dengan 5 X iOS Bl6Fl0 dan
Cloudman S91 sel tikus melanoma, masing-masing. BALBc nu / nu tikus diinokulasi dengan 2
X 107 sel A549 karsinoma paru-paru manusia, manusia usus karsinoma HCT 116, karsinoma
payudara manusia 4 singkatan yang digunakan adalah: HSY TK, herpes simplex virus timidin
kinase; GCV, gansiklovir; LB, Luria broth; cfu, koloni-forming unit (s); EM. mikroskop
elektron; TK. timidin kinase; T / C, diperlakukan terhadap kontrol; LPS. lipopolisakarida; T.I.,
intratumoral.

SAI.MONEUA sebagai antitumor VECTOR

10

BT20, manusia karsinoma ginjal CRL 1611, atau manusia hepatoma HTB 52. Ketika tumor
teraba dikembangkan, tikus lanjut diinokulasi i.p. Salmonella mengisolasi YS72 di cfu
ditunjukkan. Pada saat yang ditunjuk, hewan-hewan itu dikorbankan, dan tumor dan hati telah
dihapus dan ditimbang. Sebuah bagian tengah tumor disiapkan untuk mikroskopi, dan sisa
tumor dihomogenisasi dalam 5 volume LB per g jaringan berat basah dan kuantitatif menilai
untuk bakteri dengan pengenceran serial pada LB piring agar
Efek bakteri pada Pertumbuhan Tumor dan Kelangsungan Hidup

lnoculi dari 1-4 x 106 cfu / i.p. tikus dari polyauxotrophs tidak mematikan untuk setidaknya 28
hari, dan beberapa strain tikus ditoleransi inoculi setinggi
5 x 107 cfu. Dosis di kisaran 106 cfu dipilih sebagai yang paling berguna untuk
menyelidiki beberapa faktor yang berbeda yang harus diperhitungkan:
virulensi, penargetan tumor, amplifikasi, dan penekanan pertumbuhan. Delapan hari setelah
implantasi tumor, tikus lanjut diinokulasi i.p. dengan 4 x l 06 cfu dari YS721, YS721 l, YS7212,
atau YS7213. Sepuluh hari inokulasi berikut
bakteri, tikus secara rutin diberikan Baytril (enrofloxacin, 0,2 mg / ml dalam air minum) untuk
total 2 minggu, pengobatan yang, dalam studi banding tidak ditampilkan, menghasilkan
peningkatan moderat dalam kelangsungan hidup tikus. pertumbuhan tumor dinilai dengan
pengukuran caliper periodik (dalam mm). Volume tumor
dihitung dengan rumus: panjang x lebar x tinggi x 0,5236 = volume (di
mm '). Hewan eutanasia ketika tumor mereka mencapai 4000 mm 3 atau ketika mereka menjadi
hampir mati.

Analisis mikroskopis

Untuk analisis mikroskopis cahaya, bagian-bagian dari tumor yang tetap di formalin, tertanam
dalam parafin, belah, dan diwarnai dengan H & E atau noda jaringan Gram (Brown-Brenn
noda). Untuk EM, jaringan itu tetap dalam setengah-kekuatan fiksasi Kamovsky untuk 6 hat 4
C, diikuti dengan mencuci di cacodylate penyangga semalam, postfixed dengan l% Os04 dan
1,5% kalium ferrocyanide di cacodylate penyangga selama 2 jam, dan tertanam dalam resin
Spurr ini . bagian ultrathin diwarnai dengan uranil asetat dan sitrat memimpin dan difoto
melalui Zeiss 109 EM.

Kloning dan Expresmn atau HSV TK di Salmonella typhimurium

11

PCR. Plasmid DNA dari pHETK2 vektor (16) disiapkan oleh lisis alkali, ekstraksi fenolkloroform, dan curah hujan etanol. primer PCR berdasarkan urutan lengkap untuk HSV TK
(17) adalah: maju, 5 '-Ga T CATGCA TGGCITCGTACCCCGGCC-3'; dan reverse, 5'CTAGATGCAT CAGTGGCTATGGCAGGGC-3 ', sesuai dengan basis 310-328 (depan) dan
1684-1701 (reverse) dari urutan diterbitkan, dengan menambahkan GATCATG CAT atau
urutan CTAGATOCAT (Ns, 1 situs dan spacer) di akhir the5 'primer masing-masing. Setiap
campuran reaksi 25-.l terkandung 50 ng template DNA, 10 pmol primer masing-masing, 100
mM deoksinukleotida trifosfat, 1,5 mM Mg, dan 0,5 unit Taq polimerase (Perkin-Elmer / Cetus,
Norwalk, CT). Amplifica itu perfonncd oleh 35 siklus 94 C selama 1 menit; 50 C selama 15
s; 55 C selama l menit; dan 72 C selama 2 menit. Band ukuran yang benar dikloning ke
dalam (a) pBluescript II KS + dan sequencing dengan T3 dan T7 primer untuk mengkonfirmasi
DNA yang benar telah dikloning dan (b) dipotong p279 dengan Pstl, yang menyediakan 3laktamase urutan sinyal (18). Transforman disaring menggunakan probe yang dihasilkan dari
template asli oleh priming random (Boehringer Mann heim, Indianapolis, IN) menggunakan
[a-32 P] dCTP. klon positif lanjut disaring oleh imunoblot.

SOS-PAGE dan lmmunoblot. SOS-PAGE dilakukan pada bakteri

Menurut Weber dan Osborn (19). Immunoblots dilakukan menurut Towbin et al. (20). antibodi
anti-TK primer (hadiah dari William Summers, Yale University, New Haven, CT)
weregenerally digunakan pada pengenceran 1: 1000. antibodi antimouse sekunder yang alkali
fosfatase conju gerbang (Promega, Madison, WI) digunakan pada 1: 7500 pengenceran, dan
incu antibodi bations diikuti oleh nitroblue tetrazolium dan 5-bromo-4-chloro-indolyl fosfat
deteksi kolorimetri (Promega).

12

LPS fenotip mutan. Semua strain dikultur semalam

di LB menengah. LPS dipisahkan oleh 16,5% MiniProtean Tris-Tricine Gel (BioRad) SDS-PAGE dan
divisualisasikan dengan pewarnaan perak. Sebagai kontrol
WT, LPS dari ATCC 14.028 digunakan. Gambar
disamping merupakan gambaran dari mutan gen rfaL,
rfaH, rfaG, dan rfaD LPS kekurangan O antigen. Seperti
yang diharapkan, rfaL mutan diperlihatkan kurangnya O
antigen,
repetitive.

seperti
rfaH

yang

ditunjukkan

mutan

konsisten

oleh

hilangnya

dengan

hilangnya

gula

tambahan,

mirip

dengan mutan rfaG dengan inti luar dikurangi lebih lanjut. Dalam mutan gen rfaP normal
Struktur O-antigen sebenatnya ada, namun sebagian dari LPS dipotong pada intinya.
Uji motilitas. Semipadat piring renang yang mengandung 0,3% (wt / vol) agar
disiapkan. Koloni tunggal diambil dengan tusuk gigi dan diletakkan ke dalam agaragar. Setelah 4 jam 37 C, mutan galur motilitas diuji dengan mengukur diameter koloni dan
dibandingkan dengan WT motilitas. Hasil yang didapat yakni tidak ada motilitas terdeteksi di
mutan rfaG, rfaD, dan rfaL dalam 4 jam. Meskipun pada 24 jam pertama diamati
pada rfaG dan rfaD mutan motilitasnya terbatas. Para mutan dikultur dalam 5 ml LB atau
minimal semalam menengah. Pada hari berikutnya, 650 l glutaraldehid (konsentrasi akhir, 2%)
ditambahkan untuk memperbaiki bakteri. Campuran itu disimpan dalam lemari es pada suhu 4
C. Untuk transmisi mikroskopis electron observasi, bakteri negatif diwarnai dengan 2% uranil
asetat cair dengan film karbon diendapkan
pada mika. Sampel diperiksa di Zeiss TEM
910 pada tegangan percepatan 80 kV dengan
dikalibrasi

magnitude.

Perangkat

kamera

(ProScan, 1024 oleh 1024) dengan ITEMSoftware

(Olympus

Lembut

Pencitraan

Solusi). Mikroskop elektron menunjukkan

bahwa

mayoritas

mutan rfaD tidak

menunjukkan adanya flagella, seperti terlihat

pada gambar disamping. Berkurangnya jumlah
flagella ini yang menyebabkan kurangnya
motilitas pada bakteri Salmonella.

13

Melengkapi sensitivitas. Darah manusia diambil dari relawan, dan serum diisolasi
dengan tabung Microvette serum (Sarstedt). Bacteria disesuaikan dengan 2 10 7 CFU dan
menantang dengan serum oleh mencampurnya 1: 1. Serum disiapkan oleh inaktivasi panas pada
56 C selama 2 jam sebagai kontrol. Campuran reaksi diinkubasi selama 30 menit pada 37
C. Sisa CFU ditentukan oleh plating. Pengembangan Tumor setelah infeksi dipantau sampai
tumor baik yang dibersihkan atau outgrew (mencapai 1.000 mm ). Selain itu, berat badan
diukur. Berat badan Tikus yang eutanasia turun di bawah 80% dari berat badan awal. Dalam
rangka untuk menentukan beban bakteri, darah, limpa, hati, dan tumor dipanen pada 12 dan 36
HPI. CFU dihitung, dan beban bakteri diterjemahkan sebagai jumlah CFU per gram jaringan.
Hasil yang didapat yaitu mutan msbB, rfaD, dan rfaG berhasil dilemahkan dan tikus pulih
dengan cepat setelah penurunan berat badan awal, meskipun dampak dari mutan msbB jauh
lebih parah. Sebaliknya, rfaH, rfaL, dan rfaP mutan yang sangat virulen dan tikus menyerah.
Efek pelemahan dari mutasi ini sudah jelas dalam waktu singkat. Oleh karena itu, bakteri strain
tersebut mungkin lebih sensitif terhadap efektor mekanise dari sistem kekebalan tubuh
bawaan. Pengobatan dengan serum manusia (darah manusia) mengungkapkan bahwa WT
Salmonella tidak terpengaruh oleh komplemen. Sementara pelengkap diinduksi lisis dari mutan
LPS adalah lebih kuat dari struktur LPS. Semua bakteri mutan rfaD segaris dalam waktu 30
menit. Modifikasi lipid A dengan mutasi msbB tidak sesuai perilaku bakteri terhadap molekulmolekul efektor bawaan.
In vivo menipisnya makrofag. Liposom klodronat (0,3 sampai 3 m; Clodrosome)
digunakan untuk menguras makrofag. Hasil yang didapat yakni rfaG mutan mudah diambil
oleh makrofag, sementara penyerapan mutan rfaD sangat lambat. Namun yang terpenting
jumlah rfaD, rfaG, dan msbB mutan berkurang secara signifikan pada 18 HPI. Hal ini
menunjukkan bahwa mutan tersebut tidak bisa menahan mekanisme efektor dari sel
fagosit. Sebaliknya, mutan rfaL, hanya kurang O antigen, masih mampu mereplikasi di
makrofag meskipun pada tarif yang lebih rendah.

Hasil Penelitian

Isolasi aerobik Hyperinvasion Mutan. Invasi Sallmonella ke dalam sel hewan diatur oleh
sejumlah faktor lingkungan, termasuk oksigen, osmolaritas, dan pH (2-5). Misalnya, mutan dari
lokus hil telah dijelaskan sebelumnya yang hyperinvasive dalam kondisi aerobik biasanya
represif (2, 4-5). Menggunakan teknik yang sama seperti yang digunakan untuk mutan hil, kami
berusaha untuk mengisolasi mutan yang menunjukkan kapasitas invasif ditingkatkan menuju
14

sel melanoma manusia ketika bakteri tumbuh aerobik di fase logaritmik awal. ATCC 14028
terpilih sebagai tipe liar karenaitu dikenal sangat virulen pada tikus dan kami menemukan itu
menjadi inheren invasif menuju sel melanoma manusia dalam budaya. Ketegangan itu termutasi
sehingga frekuensi mutan auksotrofik.

Kesimpulan
Penggunaan bakeri Salmonella enterica serovar typhimurium sebagai vector antikanker
ini dapat digunakan dengan cara memodifikasi gennya. Namun didalam tubuh salmonella typhi
terdapat strain pathogen yang dapat membahayakan. Oleh sebab itu strain pathogen ini harus
dilamahkan oleh lipopolisakarida (LSP). Mutan yang dilemahkan yakni rfaL, rfaG, rfaH, rfaD,
rfaP, dan msbB. Dari berbagai uji yang dilakukan didapatkan hasil yang signifikan dari mulai
mutan rfaL, rfaH, rfaG, dan rfaD yang kekurangan O antigen, melemahnya motilitas dari
mutan rfaL, rfaH, rfaG, dan rfaD, terganggunya perakitan atau produktifitas flagella dan
jumlah rfaD, rfaG, dan msbB mutan berkurang secara signifikan pada 18 HPI karena
penyerapan oleh makrofag.
Salmonella untuk pengobatan tumor. Namun, tidak ada agen terapeutik yang kuat tersedia
untuk membasmi berbagai jenis tumor. Salmonella adalah agen antitumor berguna karena
potensinya tumor-penargetan, kemampuan antitumor, dan kemampuan untuk memberikan gen
terapi. Dengan demikian, terapi tumor Salmonella-dimediasi mungkin memiliki peran penting
dalam pengobatan tumor. Hasil ini akan memberikan kontribusi untuk penelitian baru yang
memberikan pemikiran untuk interaksi kompleks antara bakteri dan kekebalan tuan rumah
untuk memaksimalkan peluang keberhasilan terapi.

15

DAFTAR PUSTAKA

Anderson R.N. 2001. Deaths: Leadingcauses for 1999. National Vital Statistics

Reports.

Hyattsville, Maryland; National Center for Health Statistics. 49:11

Darmawati, S. 2009. Keanekaragaman Genetik Salmonella Typhi. Analis Kesehatan Fikkes
Unimus.
John M. P, K. Brooks. L, and David B. 1997. Tumor-targeted Salmonella as a Novel Anticancer
Vector.
Maksum.R. 2004. Uji Mutagenisitas Dan Anti Kanker Ekstrak Aseton Dan N-Heksana Dari
Kulit Batang Sesoot (Garcinia Picrorrhiza Miq.).
Masniari.P, Iyep. K Dan Susan M. Noor. Bahaya Salmonella Terhadap Kesehatan.
Michael. F, Sebastian. F., Dino. K., Manfred .R., Michael .H., Roy .C.I., Marc .E, and Siegfried
.W. 2015 . Efficiency Of Conditionally Attenuated Salmonella Enterica Serovar
Typhimurium In Bacterium-Mediated Tumor Therapy.
Yatnita, Y.P. 2011. Bakteri Salmonella Typhi Dandemamtifoid.
Winek, C.L. 1977. Toxicology Annual, Vol II, Marcel Dekker Ind, New York

16