PERCOBAAN MENGHITUNG SEL RAGI DALAM BILIK HITUNG

TUJUAN

Menghitung jumlah sel ragi dengan menggunakan bilik hitung

PRINSIP PERCOBAAN

Percobaan menghitung sel ragi ini menggunakan hemasitometer sehingga perhitungannya

pun sama dengan perhitungan sel darah merah. Hemasitometer memiliki luas 1mm 2 dengan
kedalaman 0,1 mm, sehingga volume kotak besar = 0,1 mm3 yang setara dengan 10-4 ml. Bila
sel bakteri dihitung pada kotak besar, maka jumlah sel yang diperoleh dikalikan faktor
kebalikan (104) untuk mendapatkan jumlah bekteri per ml. Dalam kotak besar, ada 25 kotak
medium dengan dimensi 0,2mm x 0,2mm x 0,1mm sehingga volume = 0,04mm 3 yang setara
dengan 1/25 kotak besar. Dalam kotak medium terdapat 16 kotak kecil dengan dimensi
0,05mm x 0,05mm x 0,1mm = 2,5 x 10-5 mm3.

DASAR TEORI

Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung

jumlahkoloni bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Secara mendasar ada dua
cara penghitungan bakteri, yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa
cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu
bahan (preparat sedrhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung
(counting chamber). Sedangkan perhitungan secara tidak langsung hanya mengetahui jumlah
mikroorganismepada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam
pelaksanaannya ada beberapa cara yaituperhitungan pada cawan petri (total plate count /
TPC, perhitungan melalui pegenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat
(MPN methode), calorimeter/cara kekeruhan atau turbidimetri (Anonim, 2013).

Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif
koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa
dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan
analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform
dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak
langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan
berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang
dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini
(Dwidjoseputro, 1994).

Pada tiap perhitungan bakteri ketepatan berkurang dengan meningkatnya konsentrasi sel-
sel. Begitu halnya bila jumlah yang dihitung terlalu kecil. Bahan yang mengandung sejumlah
bakteri (kira-kira lebih dari 104/ml) biasanya diencerkan dari 1:105 atau lebih tergantung
pada bahan pemeriksaan atau metode hitung, sehingga hasil hitungan yang diperoleh dapat
diandalkan dan memudahkan perhitungan. Perhitungan dapat dilakukan dengan dua cara
yaitu perhitungan secara langsung dan perhitungan secara tidak langsung (Rizki, 2013).

Menurut Hadietomo (1990) menyatakan bahwa perhitungan secara tidak langsung dapat
dilakukan dengan beberapa cara yaitu:

1. Penentuan volume total

Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hematokrit pada pengukuran volume total
butir-butir darah, misalnya 10 ml biakan dimasukkan ke dalam tabung reaksi khusus (tabung
hopklins) yang bagian bawahnya berupa silinder dan bergaris ukuran.

2. Metode turbidometri

Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur keker han suspensi atas dasar penyerapan
dan pemencaran cahaya yang dilintaskan, sehingga yang mengandung lebih dari 107-
108 sel/ml, tampak lebih keruh oleh mata telanjang. Suatu volume biakan yang telah ditakar
ditempatkan dalam tabung khusus yang jernih dengan diameter tertentu.

Menurut Jimmo (2013), menyatakan bahwa prinsip dari perhitungan metode hitungan
cawan adalah bila sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium, maka mikroba
tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan
kemudian dapat dihitung tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dibedakan
atas dua cara, yaitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan (surfacelspread plate).
Pada metode tuang, sejumlah sampel (1 ml atau 0,1 ml) dari pengenceran yang dikehendaki
dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambhkan agar-agar cair yang steril yang telah
didinginkan (47-50oC) sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya menyebar.
Metode ini merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah jasad renik,
dengan alasan :

1. Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung

2. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus

3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang terbentuk
mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik.

Selain keuntungan-keuntungan tersebut di atas, metode hitungan cawan juga memiliki

kelemahan sebagai berikut :

1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan hasil yang sebenarnya, karena beberapa sel yang
berdekatan mungkin membentuk koloni.

2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang
berbeda pula.

3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk
koloni yang kompak, jelas, dan tidak mnyebar.

4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan

koloni dapat dihitung.

Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang hidup dapat
berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan adalah indeks bagi
jumlah mikroorganisme yang terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dari
metode ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut.
Setelah inkubasi, jumlah semua koloni diamati untuk memenuhi persyaratan statistik. Cawan
yang dipilih untuk menghitung koloni adalah cawan yang mengandung antara 30 sampai 300
koloni. Organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah
koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Lud,
2007).

Salah satu metode cepat yang digunakan untuk menghitung massal sel adalah melalui
perhitungan kekeruhan (turbidity). Kekeruhan dapat diukur dengan menggunakan fotometer
atau spertofotometer. Pengukuran kekeruhan ini didasarkan atas pertikel-pertikel kecil yang
menyebarkan cahaya lengsung secara propisional (sampai batas-batas tertentu) dengan
konsentrtasinya. Zat cahaya melewati tabung yang berisi suspensi mikroba, maka cahaya
akan dihamburkan (Pelczar, 1989).

Ada dua Metode plate count yang sering digunakan, yaitu metode sebaran dan metode
tuang. Asumsi digunakannya metode ini adalah bahwa setiap satu sel mikroba dapat tumbuh
dan akhirnya membentuk satu koloni yang dapat dilihat dengan kasat mata. Pada metode
sebaran, volume yang dibutuhkan adalah 0.1 ml agar sampel tersebut sapat tersebar,
terendam, dan teresap. Karena jika lebih, maka sampel akan mengendap dan mengumpul
sehingga menyulitkan dalam perhitungan (Ali, 2008).

Menurut Yulneriwanti (2013), menyatakan bahwa perhitungan langsung dapat dilakukan

dengan cara sebagai berikut :

1. Perhitungan sel langsung

Cara ini menggunakan bilik hitung (hemoci tometer) yang menghasilkan hitungan total,
karena semua sel terhitung, baik sel yang hidup maupun sel yang mati. Karena bakteri itu
kecil, maka perhitungan yang dilakukan secara statistik dapat diterima, namun harus dibuat
suspensi sekurang-kurangnya 107 / ml.

2. Menghitung dengan alat penghitung elektronik

Dengan alat ini dapat dihitung beribu-ribu bakteri dalam beberapa detik. Penggunaan alat
ini banyak didasarkan atas kerja dengan lobang pengintai elektronik (dapat disamakan
dengan mata elektronik) kerjanya tergantung pada interupsi dari berkas cahaya elektronik
yang melintasi suatu ruang antara dua ruang elektron yang berdekatan letaknya. Tiap partikel
yang karena perbedaan kkonduktivitas sel dan cairan. Interupsi ini dicetak oleh suatu alat
secara elektris.

3. Menghitung dengan filter membran

Contoh cairan yang disaring dan ditakar dengan filter steril yang terbuat dari membran
berpori. Bakteri yang tertahan oleh filter itu kemudian dihitung langsung. Dalam hal ini
banyak bakteri dalam cairan tersebut tidak boleh terlalu banyak dan tersebar rata.

Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan

hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks bagi
jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik pengitungan ini membutuhkan
kemampuan melakukan pengenceran dan mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan
tersebut kemudian diinkubasi dan kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan
yang dipilih untuk penghitungan koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang
berisi 30-300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal dihitung dengan
cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan
bersangkutan (Filzahazny, 2013).

Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan

caramenambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar.
Contohnya diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau
dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut (Anonim, 2013).

Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam
suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan
volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya
atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam
biakan. Kekeruhan dapat disebut optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada
panjang gelombang 520 nm 700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar
dapat memperlihatkan jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungancawan)
hingga pengukuran optical density/ditentukan dengan spektrofotometer (Anonim, 2013).

Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan

caramenambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar. Contohnya suatu
sampel pada suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam sppesies diencerkan
dalam suatu taung tersendiri. Enceran ini kemudian diambil barang 1 ml untuk diencerkan
lagi ke tabung yang berisi pelarut. Enceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan
lebih lanjut Jumlah terbaik yang digunakan untuk perhitungan mikroba antara 30-300
koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal (Dwidjoseputro, 1994).

ALAT DAN BAHAN

Alat : Bahan :

Mikroskop Suspensi ragi

Pipet

Hemasitometer