Anal. Chem.

2004, 76, 2239-2247

Skrining dan Identifikasi Glikosida di Sampel Biologi

Menggunakan Energi-Gradient Netral Rugi Scan dan
Liquid Chromatography Mass Spectrometry Tandem

Juni Qu, Quonglin Liang, Guoan Luo, * dan Yiming Wang

Departemen Kimia, Sekolah Ilmu dan Teknologi, Universitas Tsinghua, Beijing, 100084, PR China
menganalisa glikosida tertentu dalam sampel biologis.
Metodologi termasuk
* Penulis yang sesuai. E-mail:
Sebuah strategi yang cepat, selektif, dan qujun99@mails.tsinghua.edu.cn. Fax: 86-10-
62781688. Tel: 86-10-62.781.688.
dapat diandalkan telah devel-oped untuk
(1) Pratt, DE; Hudson, BJF Dalam Makanan Antioksidan;
skrining dan identifikasi glikosida dalam Hudson, BJF, Ed .; Elsevier Applied Science: New York, 1990; pp
sampel biologis: ekstrak kasar langsung 173-179.
(2) Frankel, EN; Kanner, J .; Genman, JB; Taman, E .; Kinsella,
diinfus untuk triple-quadrupole MS / MS, dan
JE Lancet tahun 1993, 341, 454-461.
glikosida utama disaring keluar dengan (3) Kim, HS Pharmacol. Biochem. Behav. 1996, 53, 185-190.
keyakinan tinggi dengan scan energi gradien
kerugian netral (EGNLS) untuk hilangnya gula- 10.1021 / ac030413t CCC: $ 27.50 © 2004 American Chemical Society
Ditampilkan di Web 2004/03/13
(s); kemudian glikosida tersebut lebih lanjut
diidentifikasi dengan LC / MS / MS. Metode
EGNLS yang diusulkan pem-likasikan dan
dioptimalkan dengan 16 glikosida perwakilan
(termasuk ginsenosides dan glikosida flavon,
antrakuinon, dan terpenoid). Metode EGNLS
memiliki dua keuntungan besar atas tetap
berenergi netral memindai kerugian
konvensional: (1) Yang terakhir adalah
bertanggung jawab untuk '‘menghilangkan’
beberapa senyawa target karena
ketidakcocokan biasa antara energi tabrakan
yang telah ditetapkan dan tertarik senyawa'
tabrakan Opti-mal energi (OCE), sedangkan
EGNLS memecahkan ini prob-lem oleh
scanning atas berbagai energi. (2) EGNLS
secara bersamaan mengukur senyawa
disaring OCE, yang tidak hanya parameter
penting untuk LC / MS / MS analisis lebih
lanjut tetapi juga membawa beberapa
struktural infor-masi, seperti yang dibuktikan
oleh penelitian ini. Strategi ini telah berhasil
menunjukkan dengan analisis glikosida
diScutellaria viscidula Bge dan ditransformasikan
Panaxakar rambut (konstitusi glikosida dari
kedua belum dipelajari sebelumnya): tanpa
pemisahan melelahkan pro-cesses; Informasi
glikosida yang komprehensif tentang dua
tanaman diperoleh dengan prosedur yang
cepat dan sederhana. Strategi ini sangat
berharga untuk studi glikosida dalam sampel
yang kompleks.
Glikosida adalah salah satu kelas yang paling luas dari
senyawa biologis dan penting dalam bidang-bidang seperti
Phytochem-istry, farmakologi, biokimia, dan nutriology. com-
pound ini dimetabolisme dari flavonoid, antrakuinon, ter-
penes, dll, dan kebanyakan dari mereka adalah biologis aktif. 1-
3
Studi numer-ous telah dilakukan di masa lalu untuk

4 5
metode kolorimetri, kromatografi lapis tipis, kromatografi
cair tinggi perfor-Mance (HPLC),6-9 kapiler electrophore-sis,10,11
kromatografi gas-spektrometri massa (GC / MS), 12,13 MALDI-
TOF MS,14 LC / MS / MS, 15-20 dan LC / NMR / MS. 21Bagaimana-
pernah, sebagian besar metode tersebut tidak dapat
digunakan untuk glikosida layar (baik dikenal dan tidak
dikenal) dalam sampel biologis. Karena konstitusi glikosida
dalam sampel biologis sering rumit, metode yang mampu
menyaring glikosida di matriks kompleks berharga karena
petunjuk itu dapat memberikan.
Kami melaporkan dalam sebuah makalah baru-baru
ini22pencarian yang cepat dan identifikasi glucuronides dan
aglycons mereka dalam ekstrak tumbuhan: pemutaran dari
glucuronides oleh MS / MS kerugian netral scan hilangnya
asam glucosiduronic, diikuti oleh identifikasi glucuronides dan
aglycons mereka dengan LC / MS / MS. Dalam penelitian ini,
kami mengusulkan strategi universal untuk skrining cepat dan
dapat diandalkan dan identifikasi glikosida di matriks biologi:
glikosida tertarik disaring keluar dan optimal
(4) Tatsuma, T .; Komori, K .; Yeoh, HH; Oyama, N. Anal.
Chim. Acta 2000, 408, 233-240.
(5) Tanaka, H .; Putalun, W .; Tsuzaki, C .; Shoyama, Y. FEBS
Lett. 1997, 404, 279-282.
energi tabrakan (OCE) untuk senyawa yang diperoleh
dengan scan energi gradien kerugian netral (EGNLS)
dengan MS / MS; maka glikosida yang lebih
diidentifikasi dengan mencari database dan selanjutnya
dikonfirmasi oleh LC / MS / MS.
Netral kehilangan scan menggunakan MS / MS adalah
pendekatan berguna untuk bioanalysis, dan ada beberapa
23-25
laporan tentang aplikasi dari teknik ini. Sejauh
kerugian pemindaian netral harus dipekerjakan di bawah
energi tabrakan yang telah ditetapkan. Namun, sejak OCE
untuk kerugian dari bagian yang sama sering beragam
antara berbagai jenis senyawa, senyawa yang OCE sangat
berbeda dari energi tabrakan yang telah ditetapkan tidak
akan efisien terfragmentasi menjadi produk yang
diharapkan dan dengan demikian dapat memberikan
sinyal miskin atau tidak ada sinyal sama sekali. Akibatnya,
menggunakan energi tabrakan tetap untuk memindai
hilangnya netral mungkin berakibat pada “kelalaian” dari
beberapa senyawa, sensitivitas rendah untuk beberapa
orang lain, atau keduanya. Ini adalah salah satu alasan
utama mengapa saat kehilangan pemindaian netral tidak
populer digunakan, meskipun kenyamanan dapat
memberikan.26Dalam laporan ini, kami mengembangkan
metode EGNLS, yang tidak hanya menghindari kelalaian
senyawa tertarik disebabkan oleh ketidaksesuaian energi
tabrakan tetapi juga dapat mengukur OCE senyawa
tersebut, memberikan informasi struktural tambahan pada
senyawa disaring.
Metode ini dikembangkan dan dioptimalkan menggunakan
16 Representa-tive O-glikosida. Untuk menguji kepraktisan
pendekatan, kita diuji dua tanaman: Scutellaria viscidula Bge,
dan biologis yang dihasilkan Panax ginseng akar rambut
(Konstituen glikosida dari kedua tanaman belum
dipelajari sebelum pekerjaan ini.). Menggunakan prosedur
yang cepat dan sederhana didirikan pada penelitian ini,
glikosida minat mereka ekstrak minyak mentah
disaring keluar dan diidentifikasi, dan ditemukan bahwa isi
absolut dan relatif dari beberapa glikosida dalam dua tanaman
(6) Rehwald, A .; Meier, B .; Sticher, OJ Chromatogr., A 1994, 677,
25-33.
(7) Deliorman, D .; Calis, saya .; Ergun, F .; Tamer, UJ Liq.
Chromatogr. Relat. Technol. 1999, 22, 3101-3114.
(8) Merken, HM; Beecher, GRJ Agric. Makanan Chem. 2000, 48,
577-599.
(9) Derksen, GCH; van Beek, TA; de Groot, AE; Capelle, AJ
Chromatogr., A 1998, 816, 277-281.
(10) Tomasbarberan, FA Phytochem. Anal. 1995, 6, 177-192.
(11) Frazier, RA; Ames, JM; Nursten, HE elektroforesis 1999,
20, 3156-3180.
(12) Mazur, W .; Fotsis, T .; Wahala, K .; Ojala, S .; Salakka, A .;
Adlercreutz, H. Anal. Biochem. 1996, 233, 169-180.
(13) Chassagne, D .; Crouzet, J .; Bayonove, CL; Baumes, RLJ
Agric. Makanan Chem. 1998, 46, 4352-4357.
(14) Wang, J .; Sporns, PJ Agric. Makanan Chem. 2000, 48,
1657-1662.
(15) Vanbreemen, RB; Huang, CR; Lu, ZZ; Rimando, A .; Fong,
HHS; Fitzloff, JF Anal. Chem. 1995, 67, 3985-3989.
(16) Wang, XM; Sakuma, T .; Asafu-Adjaye, E .; Shiu, GK Anal.
Chem. 1999, 71, 1579-1584.
(17) Nielsen, SE; Freese, R .; Cornett, C .; Dragsted, LO Anal.
Chem. 2000, 72, 1503-1509.
(18) Layang-layang, GC; Howes, MJR; Leon, CJ; Simmonds, MSJ
cepat Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 238-244.
(19) Wang, XM; Plomley, JB; Newman, RA; Cisneros, A. Anal.
Chem. 2000, 72, 3547-3552.
(20) Mellon, FA; Bennett, RN; Holst, B .; Williamson, G. Anal.
Biochem. 2002, 306, 83-91.
(21) Lommen, A .; Godejohann, M .; Venema, DP; Hollman,
PCH; Spraul, M. Anal. Chem. 2000, 72, 1793-1797.
(22) Qu, J .; Wang, Y .; Luo, G .; Wu, ZPJ Chromatogr., A 2001, 928,
155-162.
Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004 2239
secara signifikan berbeda dengan yang ada di mereka spesies
congeneric.
BAGIAN EKSPERIMENTAL
Bahan dan Reagen. Rhapontin, proscillaridin, quercetin-3-
O-glukosida, salisin, Aesculin, dan rutin yang dibeli dari Sigma
(St Louis, MO). Luteolin- 7-O-glukosida adalah dari Beijing
Institute of Tanaman Obat Penelitian (Beijing, Cina), dan
emodin-8-O-glukosida, Phloretin-2-O-glukosida dan gossypin
berasal dari Kunming Institute of Fitokimia (Yunan, Cina ).
Semua standar glikosida lainnya dikonfirmasi berasal dari Cina
Drug Administrasi Negara (SDA, Beijing, Cina). HPLC asetonitril
kelas dan metanol berasal dari Suntuk Inc (Fairfield, OH). Akar
kering Scutellaria baicalensis Georgi (dibudidayakan di Provinsi
Henan, Cina), Scutellaria amoena CH Wrignt (dibudidayakan di
Kuichow Province, China), S. viscidula Bge (tipe liar, dijemput
di timur laut Cina), P. Ginsen CA Meyer ( 4 tahun,
dibudidayakan di China utara), Panax quinquefolius L.
(23) Yates, JR; Eng, JK; McCormack, AL; Schieltz, D. Anal.
Chem. 1995, 67, 1426-1436.
(24) Jackson, PJ; Brownsill, RD; Taylor, AR; Walther, BJ Mass
Spectrom. 1995, 30, 446-451.
(25) Schlosser, A .; Pipkorn, R .; Bossemeyer, D .; Lehmann,
WD Anal. Chem. 2001, 73, 170-176.
(26) Arnott, D. Dalam Protome Penelitian: Spectrometry Massa;
James, P., Ed .;
Springer: New York; 2001; pp 23-34.
cukup
mudah
 Preparasi Sampel. Semua sampel tanaman kering secara
terpisah tanah untuk bubuk halus oleh semprot a. Adapun
tanaman Scutellaria, jumlah 0,2-g bubuk ditempatkan di 25-mL
tertutup labu berbentuk kerucut dan 5 mL metanol
ditambahkan. labu ditutup, dan ekstraksi dilakukan selama 10
menit dalam mesin cuci ultrasonik. Suhu berkisar 35-45°C
setelah ekstraksi. Kemudian ekstrak disentrifugasi selama 10
menit pada 8000 rpm, dan supernatan dipindahkan ke gelas
kimia. Prosedur ekstraksi di atas diulangi selama 4 kali. Semua
supernates digabungkan. Prosedur ekstraksi untuk tanaman
Panax adalah sama dengan yang untuk tanaman Scutellaria,
kecuali bahwa ekstrak diencerkan 4 kali lipat dengan 10 mM
amonia asetat di 20: 80 air / metanol sebelum analisis.
Instrumentasi. Sebuah Applied Biosystems (Toronto,
Kanada) API 3000 tiga-quadrupole spektrometer massa
tandem, dilengkapi dengan antarmuka Turbo Ionspray dan
Agilent 1100 sistem biner HPLC, digunakan untuk EGNLS dan
LC analisis / MS / MS.
Energi-Gradient Netral Rugi Scan. campuran standar
atau ekstrak tanaman secara langsung diresapi dengan MS /
MS pada tingkat 0,3 mL / jam. Untuk meminimalkan volume
yang mati, sampel diperkenalkan ke jarum semprot melalui
150 0,075 mm id leburan silika kapiler. MS / MS dioperasikan
dalam mode ion negatif, dan kehilangan memindai netral
untuk kehilangan gula yang tepat (s) dilakukan selama rentang
m / z 200-1200 dengan ukuran langkah 0,3 Amu dan waktu
tinggal dari 2 ms. Spektrometer massa diprogram untuk
melakukan scan hilangnya netral terus menerus selama
rentang energi tabrakan dari 0 hingga 100 eV dan total waktu
scan adalah 23 menit / sampel. Hal ini diwujudkan dengan
meningkatkan Quad 2 batang offset (RO2) tegangan linear 11-
2240 Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004
di Panax ekstrak tumbuhan adalah sebagai berikut: pelarut
A adalah 12 mM amonium asetat dalam air (buffered untuk
pH 7,5 dengan amonia berair). dan pelarut B adalah 12
mM amonium asetat di 20:80 air / asetonitril. elusi adalah
7 menit isokratik 10% pelarut B, diikuti oleh gradien linier
dari 10 33% B (8-35 menit), 33-39% B (35-48 menit), dan
39 sampai 85% B (48-65 menit). Laju aliran adalah 0,2
mL / menit, dan volume injeksi adalah 20sayaL. Untuk MS /
MS, beberapa reaksi monitoring (MRM) digunakan untuk
deteksi glikosida ditemukan oleh EGNLS. Transisi dan
sesuai energi tabrakan mereka untuk MRM dari glikosida
disaring diperoleh dari langkah EGNLS sebelumnya. Waktu
tinggal untuk setiap transisi adalah 200 ms, dan waktu
jeda untuk perubahan parameter adalah 6 ms.
HASIL DAN DISKUSI
Pembentukan dan Optimalisasi Metode EGNLS.
(a) Investigasi Gula Pembelahan Efisiensi dari Glikosida.
Efisiensi belahan dada CAD gula diselidiki dengan 16 glikosida
(ditunjukkan pada Gambar 1, yang mewakili beberapa kelas
yang paling umum dari glikosida seperti glikosida flavonoid,
turunan flavonoid, antrakuinon, terpen, iridoid, cou-marins,
dan glikosida jantung) di bawah kedua mode ion positif dan
negatif. Untuk mempelajari pengaruh jenis aglycons pada
efisiensi pembelahan gula glikosida, kita hanya terfokus pada
perpecahan dua keterkaitan gula yang umum: keterkaitan
dengan glukosa (hilangnya 162) dan rhamnose (hilangnya
146). Dalam beberapa percobaan lain, kami menemukan
bahwa glikosida dengan gula lain (seperti galaktosa,
arabinosa, dll) dipamerkan efisiensi pembelahan mirip dengan
yang dengan glukosa dan rhamnose (data tidak ditampilkan).
111 V dengan kenaikan dari 0,5 V untuk setiap scan,
sedangkan Quad 3 batang offset (RO3) dan Stubbies 3 (ST3)
ditetapkan bergantung RO2 dengan penyadapan masing-
masing 2 dan 20 V. Inter Quad 1 lensa (IQ1) ditetapkan pada
11 V dan perbedaan tegangan (RO2-IQ1) didefinisikan sebagai
energi tabrakan. Sebuah potensi lubang dikompromikan pada
80 V digunakan, dan tegangan ion semprot dan fokus cincin
tegangan yang ditetapkan pada-4000 dan -160 V, masing-
masing. Tekanan gas sasaran (argon) untuk disosiasi
collisionally diaktifkan (CAD) adalah 4,8 mTorr. intensitas yang
diperoleh (Y axis) terhadap waktu (sumbu X) spektrum diubah
dengan intensitas (Y axis) dibandingkan energi tabrakan
(sumbu X) spektrum dengan menghitung nilai energi tabrakan
atas dasar durasi setiap scan dan ukuran langkah untuk
kenaikan dari energi tabrakan. glikosida disaring yang
ditampilkan pada spektrum hilangnya netral diekstraksi pada
energi tabrakan yang tepat. Semua arus ion penggalian (XIC)
glikosida disaring diselidiki, dan OCE masing-masing ion
ditentukan sebagai energi tumbukan yang sesuai ke puncak
puncak pada intensitas yang ion versus XIC energi.
Identifikasi lebih lanjut oleh LC / MS / MS. Pemisahan
semua ekstrak tumbuhan dilakukan pada Dikama Diamonsil
C18 (Ukuran partikel 5 sayam, 150 2.1 mm) kolom
dipertahankan pada 40 °C. Fase gerak untuk pemeriksaan
tanaman Scutellaria terdiri dari dua pelarut: air dan asetonitril.
Proporsi asetonitril adalah 15% dalam 5 menit pertama dan
kemudian linear meningkat menjadi 40% di 25 menit, dan 40%
asetonitril dipertahankan sampai akhir analisis. Kondisi gradien
untuk analisis ginsenosides
Semua glikosida belajar di sini dipamerkan kerugian netral gula
(s) di kedua mode ionisasi.
Modus ion negatif ditemukan lebih cocok untuk
memindai hilangnya netral dari glikosida dari modus
positif: pertama, fragmen dengan oksigen eter bermuatan
negatif pada aglikon, yang hasil dari hilangnya gula (s),
cukup stabil dalam ion negatif mode; ini memastikan
sensitivitas scan kehilangan netral. ion kedua, natrium
+ +
atau kalium aduk ([M+ na] atau [M + K] ) Dari glikosida
sering diamati dalam mode ion positif, dan dalam
beberapa kasus, orang-orang ion jauh lebih intensif
+
daripada [M + H] ; ion adisi akan mempersulit spektrum
hilangnya netral; Namun, ion aduk relatif jarang dalam
mode negatif.
(b) Reproduktifitas dan Spesifisitas Nilai OCE. Dalam
percobaan kami, kami menemukan nilai-nilai OCE untuk
kehilangan gula (s) dari glikosida yang direproduksi. Kami
menyelidiki reproduc-ibility belahan dada gula OCE untuk 16
glikosida, pada konsentrasi yang berbeda dan di kedua solusi
pelarut rapi (dalam metanol) dan berduri sampel serum
manusia (mewakili matriks kompleks). Hasil perwakilan
disajikan pada Tabel 1. Nilai-nilai OCE untuk semua glikosida
belajar di sini ditemukan cukup direproduksi dan independen
dari konsentrasi analit dan matriks sampel. Para penulis
percaya bahwa itu adalah karena keteguhan energi aktivasi
reaksi CAD (ESebuah) Dan parameter termodinamika yang
relevan. Selain reproduktifitas nilai-nilai OCE, kami juga
menemukan bahwa nilai-nilai OCE yang khusus untuk
aromaticities glikosida. Ketika sekelompok glikosida memiliki
aromaticities yang sama, nilai-nilai OCE mereka tergantung
pada m / z ion induk, seperti yang disarankan oleh penelitian
sebelumnya;27 namun ketika dua kelompok glikosida dengan
aromaticities berbeda
dibandingkan, aromaticities muncul untuk memainkan
peran yang lebih penting dalam menentukan OCE glikosida
-
(Tabel 1). Misalnya, untuk transisi CAD yang sama [M- H] f
-
[M - H - GLC] , OCE dari glikosida alifatik lebih kecil adalah
lebih tinggi dari glikosida yang lebih besar aromatik (Tabel
1, icariin (V) vs proscillaridin (XII)). Untuk glikosida
diselidiki dalam penelitian ini, nilai-nilai OCE kerugian gula
tunggal dari glikosida aromatik berkisar 17-28 eV,
sedangkan untuk glikosida alifatik berkisar 46-68 eV. Nilai-
nilai OCE selama lebih dari satu kerugian gula dari
glikosida ditemukan lebih tinggi daripada untuk loss gula
tunggal (misalnya, rutin pada Tabel 1, data lainnya tidak
diperlihatkan). Demonstrasi kedua reproduktifitas dan
kekhususan OCE dalam penelitian ini memungkinkan
penggunaan OCE sebagai indeks untuk membantu
mengidentifikasi senyawa dan, dengan demikian,
pembentukan metode EGNLS.
(c) Energi-Gradient Netral Rugi Cara Scan.
For a conventional neutral loss scan analysis
of glycosides, it is problematic that the OCE
for the sugar loss are diverse among different
types of glycosides: a collision energy value
that is optimal for one type of glycosides may
not be optimal for another. As a consequence,
any preset collision energy applied to the
neutral loss scan for sugar loss may result in
the failure to detect some glycosides. This is
especially troublesome when the com-
position of a sample is uncertain, because it
is difficult to accurately predict the types of
glycosides in the sample.
Dalam laporan ini, kami mengusulkan metode EGNLS,
yang tidak hanya memecahkan masalah di atas, tetapi
juga menyediakan informasi struktural tambahan pada
senyawa disaring. Alih-alih menggunakan energi tabrakan
tetap, kami menerapkan tabrakan gradien energi linier
saat melakukan scan hilangnya netral dengan MS / MS.
Mirip dengan LC / MS / MS kromatogram, sebuah spektrum
EGNLS dapat digunakan tidak hanya untuk mendapatkan
spektrum hilangnya netral pada setiap nilai energi
tabrakan tetapi juga untuk mengekstrak intensitas versus
energi penggalian arus ion masing-masing glikosida
disaring. Menggunakan spektrum hilangnya netral pada
energi tabrakan yang berbeda, glikosida dalam sampel
kompleks dapat disaring secara menyeluruh tanpa OCE
mereka; dengan intensitas dibandingkan XIC energi dari
glikosida disaring, OCE setiap glikosida disaring dapat
diperoleh. nilai-nilai OCE yang diperoleh memiliki dua
penggunaan yang penting: pertama, mereka adalah
parameter penting untuk LC lanjut / MS / MS analisis dari
glikosida disaring; kedua, beberapa informasi struktural
pada aglikon (yaitu, aromatisitas nya) dapat diperoleh dari
nilai OCE glikosida ini. The EGNLS spektrum untuk
pengujian campuran glukosida standar ditunjukkan pada
Gambar 2. Glikosida dengan berbagai jenis aglycons dapat
diselesaikan dengan metode EGNLS ini (Gambar 2A-D).
Hasil ini juga menunjukkan bahwa masalah menghilangkan
beberapa glikosida yang dihadapi oleh fixed-energi yang
hilang netral pemindaian dapat dihindari dengan EGNLS.
Sebagai contoh, spektrum hilangnya netral diekstraksi
pada 20 eV menunjukkan semua glikosida aromatik tetapi
sebagian glikosida alifatik tidak ditampilkan (Gambar 2D),
sedangkan pada 65 eV hanya glikosida alifatik ditemukan (27) Keski-Hynnila, H .; Luukkanen, L .; Taskinen, J .;
Kostiainen, RJ Am. Soc. Mass Spectrom. 1991, 10, 537-545.
(Gambar 2E).

Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004 2241

Gambar 1. Struktur 16 glikosida perwakilan (berat molekul): I, Aesculin (340); II, salisin (286); III, emodin-8-O-glukosida (432); IV, gossypin
(480); V, icariin (676); VI, luteolin-7-O-glukosida (448); VII, gardenoside (404); VIII, quercetin-3-O-glukosida (464); IX, Phloretin-2-O-glukosida
(436); X, rhapontin (420); XI, rutin (610,5); XII, proscillaridin (530,5); XIII, ginsenosida Rb1 (1108); XIV, Re (946); XV, Rg3 (784); XVI,
saikosaponin A (780). * GLC, glukosa; Rha, rhamnose; Gal, galaktosa.

2242 Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004

 Sebuah
Tabel 1. Investigasi Reproducibility dan Spesifisitas Optimal Tabrakan Energi (OCE) Nilai dengan Beberapa Glikosida

glycoside
aromatic
salicin
gossypin
icariin
rutin
aliphatic
gardenoside
proscillaridin
ginsenosides Re
saikosaponin A

a All OCE values were obtained under negative ion mode. b The OCE of a glycoside is the average (n ) 6) from
duplicate determinations, respectively, at glycoside concentrations of 0.5, 5.0, and 80 íg/mL in methanol. c A
human serum was spike with the glycoside level. respectively. at 0.5, 5.0. and 80 íg/mL and then extracted by
methanol. The OCE of a glycoside is the average (n ) 6) from duplicate determinations of the spiked samples,
respectively, at the three concentrations.

Figure 2. Selected spectra by an EGNLS (loss of 162 amu) of glucoside standards mixture. (A) total ion current (TIC); (B) extracting ion
current (XIC) of emodin- 8-O-glucoside (an aromatic glycoside, m/z 431); (C) XIC of ginsenoside Rg3 (an aliphatic glycoside, m/z 783); (D) the
neutral loss spectra extracted at 20 eV; (E) the neutral loss spectra extracted at 65 eV. I-X and XIII-XVI denoted in Figure 1.

Problems Associated with EGNLS. (a) Carryovers leburan silika kapiler untuk memperkenalkan sampel ke arah
among Samples. As a result of direct infusion of samples jarum penyemprotan untuk meminimalkan volume mati
after the simple extraction procedure, contamination of the tabung; kedua, kita memerah sistem pada laju alir 0,2 mL /
tubing and interface may occur. This may cause carryovers menit antara dua tes berturut-turut, menurut urutan berikut,
among samples. To avoid this, two approaches had been metanol (5 menit), 50 mM amonia berair (5 menit), dan
taken: first, we used a small-i.d. metanol (10 menit).

Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004 2243

Gambar 3. EGNLS yang dipilih (hilangnya 176 amu) spektrum untuk analisis glucuronides pada tanaman Scutellaria. (A) TIC tanaman 1; (B)
XIC dari 445 tanaman 1; (C) XIC dari 475 tanaman 1; hilangnya spektrum netral diekstraksi pada 23 eV, masing-masing, dari (D) tanaman 1,
(E) tanaman 2, dan (F) tanaman 3.
potensi dengan cepat membedakan-ing satu tanaman dari
(b) Glikosida rendah melimpah. glikosida rendah yang sejenis dengan menggunakan kelimpahan relatif dari
berlimpah merujuk kepada orang-glikosida glikosida. Atas dasar itu mencari database
dengan baik konsentrasi rendah dalam ekstrak
atau tanggapan yang rendah dengan metode
EGNLS ini (misalnya, beberapa glikosida tanpa
gugus hidroksil bebas pada aglycons). Dalam
kasus di mana glikosida seperti itu menarik,
pertama kita terletak perkiraan OCE untuk
senyawa-senyawa di TIC / XIC dari spektrum
EGNLS dan kemudian akumulasi spektrum
hilangnya netral pada energi tabrakan tetap
untuk 20-50 scan (2-6 menit). Karena karakter
kebisingan yang rendah dari metode ini, rasio
signal-to-noise dari spektrum akumulasi biasanya
memuaskan.
Analisis glucuronides di S. viscidula Bge. Akar tanaman
Scutellaria telah digunakan sebagai obat herbal mentah
penting untuk pengobatan hepatitis, diare, dan inflamma-
tions, dan senyawa aktif utama mereka adalah
glucuronides derivatif flavonoid.28Pabrik untuk penelitian
ini adalah S. viscidula Bge (tanaman 1), yang konstituen
glikosida belum SUF-ficiently diselidiki. Sebagai
perbandingan, kami juga mempelajari akar dua spesies
Scutellaria umum lainnya: S. baicalensis Georgi (spesies
Scutellaria paling banyak digunakan, tanaman 2) dan S.
amoena CH Wrignt (tanaman 3).
The EGNLS spektrum tanaman 1 untuk hilangnya 176 (rugi
dari bagian asam glucosiduronic) ditunjukkan pada Gambar 3.
Empat ion, masing-masing, pada m / z 429, 445, 459, dan 475
yang diamati pada kisaran OCE dari 22-25 eV. Ion-ion ini juga
terdeteksi pada tanaman 2 dan 3. jumlah relatif antara empat
ion yang serupa antara kedua spesies Scutellaria umum
(tanaman 2 dan 3) tapi cukup berbeda dari tanaman 1: untuk
pabrik 1, kelimpahan relatif dari ion pada m / z 429 dan 475
secara signifikan lebih tinggi daripada dua tanaman lain
(Gambar 3D-F). Oleh karena itu, metode ini menunjukkan
 terakhir dengan SDA, senyawa yang diidentifikasi sebagai
hasil dan informasi yang dikenal pada tanaman sejenis, berikut: m / z 429, chrysin-3-O-glukuronida (1); m / z 445,
kita dianggap empat ion ini mungkin dari beberapa baicalin (2) dan 5, 8 dihyroxyflavone-7-O-glukuronida (3); m / z
kemungkinan glucu-ronides seperti baicalin, wogoninoside, 459, wogoninoside (4) dan oroxylin A-7-O-glukuronida (5); m / z
dll diperlukan LC konfirmasi / MS / MS lanjut ini. Beberapa 475, 5,2¢-dihydroxy-6-methoxyflavone-7-O-glukuronida (6);
ion minor juga ditemukan dalam kisaran OCE 55-70 eV 5,2¢-dihydroxy-6¢-methoxyflavone-7-O-glukuronida (7); dan
(Gambar 3A); Namun, karena mereka glucuronides alifatik 5,2¢-dihydroxy-8-methoxyflavone-7-O-glukuronida (8). Mereka
tidak senyawa aktif utama, kami tidak menyelidiki mereka glucu-ronides juga ditemukan di kedua pabrik 2 dan tanaman
dalam penelitian ini. 3. kelimpahan Jauh lebih tinggi mutlak 1 dan 8 diamati dalam
LC / MS / MS konfirmasi dilakukan dengan menggunakan ekstrak tanaman 1 daripada di dua pabrik lainnya. Ini setuju
OCE yang glucuronides disaring dan pasangan ion produk juga dengan spektrum EGNLS. Selain kelimpahan absolut,
Previ-menerus diperoleh dengan prosedur EGNLS orangtua /. jumlah relatif dari beberapa glucuronides isomer juga
LC perwakilan / MS / MS kromatogram ditunjukkan pada ditemukan cukup berbeda di antara tiga pabrik. Untuk
Gambar 4. Untuk tanaman 1, dua isomer struktural untuk ion tanaman 1, 7 dominan antara tiga glucuronides isomer
pada m / z 445, dua untuk m / z 459, dan tiga untuk m / z 475 (Gambar 4D); Namun, jumlah relatif antara ketiga isomer
yang diamati, sementara hanya satu senyawa ditemukan lakukan
untuk ion pada m / z 429 (Gambar 4A-D). Dengan
membandingkan prekursor / produk ion pasang dan waktu
(28) Huang, HC; Wang, HR; Hsieh, LM Eur. J. Pharmacol. 1994,
retensi terhadap orang-orang dari standar yang disediakan 251, 91-93.

2244 Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004

Gambar 4. LC lanjut / identifikasi MS / MS dari glucuronides ditemukan oleh EGNLS pada tanaman Scutellaria: (A)-(D) XIC dari m / z 429 f
253, XIC dari m / z 44 f 269, XIC dari m / z 459 f 283, and XIC m/z 475 f 299 of plant 1; (E) XIC of m/z 475 f 299 of plant 2; (F) XIC of m/z 475
f 299 of plant 3.
bebas hormon selama 7 minggu setelah inokulasi P. ginseng CA
dengan Agrobacterium rhizogenes. Untuk perbandingan,

not differ greatly in plants 2 and 3 (Figure 4E and F).

This implies that the differences in relative abundances
of those isomeric glucuronides might be significant
enough to distinguish plant 1 against plants 2 and 3.
The findings from this experiment are valuable for the
study of the constituents and biological activities of
those plants.
Analysis of Ginsenosides in the Extract of P.
ginseng
Transformed Hairy Roots. Ginsenosides are the major
effective compounds of ginseng products, which are among
the most popularly used herbal medicines worldwide for their
stimulating and tonic properties.15-16 Dalam beberapa tahun
terakhir, teknik baru, yang berbulu budaya akar setelah infeksi
beberapa spesies Panax, telah dipelajari secara ekstensif
untuk memungkinkan produksi yang cepat dan murah
ginsenosides.29Teknik ini menunjukkan potensi untuk produksi
massal ginsenosides tanpa budidaya pertanian budaya
memakan waktu; Namun, produktivitas ginsenosides sangat
dipengaruhi oleh efisiensi teknis dari proses budaya. 30Dalam
laporan ini, kami menerapkan metode EGNLS untuk akuisisi
cepat dari profil ginsenosida di akar rambut dan produk
lainnya Panax. akar berubah berbulu (tanaman 4) yang
digunakan dalam penelitian ini dikultur dalam media yang
 LC / MS / MS ). Beberapa ion kecil dari glikosida aromatik
dengan OCE 25-33 eV, juga ditemukan (Gambar 5A), karena

dua ginseng yang umum digunakan, P. quinquefolius L. glikosida ini tidak ginsenosides (yang alifatik), kami tidak

(Amerika ginseng, tanaman 5) dan P. ginseng CA Meyer menyelidiki mereka dalam penelitian ini. Ditemukan

(ginseng Korea, tanaman 6) juga diselidiki dengan kelimpahan relatif dari ion ginsenosida bervariasi secara

metode ini. signifikan di antara tiga pabrik (ditunjukkan dalam Gambar 5D-
Karena semua ginsenosides utama memiliki glucoses F, diekstrak netral hilangnya spektra pada 63 eV): spektrum
terminal, senyawa tersebut dapat disaring dengan tanaman 4 ditandai dengan kelimpahan relatif tinggi dari ion
menerapkan EGNLS untuk hilangnya bagian glukosa pada m / z 945 (Re+Rd) dan 799 (Rg1+Rf); Tanaman 5 ditandai
(hilangnya 162 amu). EGNLS spektrum perwakilan untuk
(29) Washida, D .; Shimomura, K .; Nakajima, Y .; Takido, M .;
tanaman 4-6 ditunjukkan pada Gambar 5. Beberapa ion Kitanaka, S. Fitokimia 1998, 49, 2331-2335.
dengan OCE berkisar 58-67 eV diamati, dan sebagian besar (30) Mallol, A .; Cusido, RM; Palazon, J .; Bonfill, M .; Morales, C
dari ion-ion ini dapat dikaitkan dengan ion ginsenosides .; Pinol, MT Fitokimia 2001, 57, 365-371.

(Gambar 5, ginsenosides berlabel kemudian dikonfirmasi oleh

Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004 2245
Gambar 5. EGNLS yang dipilih (hilangnya 162 amu) spektrum untuk analisis ginsenosides pada tanaman Panax: (A) TIC tanaman 4; (B) XIC
dari m / z 945 tanaman 4; (C) XIC dari m / z 799 tanaman 4; hilangnya spektrum netral diekstraksi pada 66 eV, masing-masing, dari (D)
tanaman 4, (E) tanaman 5, dan (F) tanaman 6.
cultivated transformed hairy roots reported else-where. 30 This
oleh kelimpahan relatif tinggi m / z 1107 (Rb1) dan rendah suggests that the transformed hairy roots studied
kelimpahan relatif m / z 799 (Rg1); Tanaman 6 ditandai
dengan kelimpahan relatif tinggi m / z 1107 (Rb1), 945
(Re+Rd+Glc-Rc), dan 799 (Rg1+Rf). Ini berarti bahwa ketiga
tanaman dapat dengan cepat dibedakan dari satu sama
lain menggunakan profil ginsenosida diperoleh EGNLS.
Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa metode EGNLS
bisa memberikan estimasi yang cepat dari isi relatif
ginsenosides' pada tanaman Panax dengan jumlah relatif
antara ion ginsenosida. Kelimpahan absolut paling ion
ginsenosida di pabrik 4 yang luar biasa rendah daripada
yang di kedua tanaman 5 dan 6 (Gambar 5), menunjukkan
bahwa kandungan ginsenosida di pabrik 4 mungkin jauh
lebih rendah daripada di dua pabrik lainnya. Hal ini perlu
konfirmasi dengan data kuantitatif.
Empat belas ginsenosides utama, masing-masing, Rb1,
Rb2, RB3, Rc, glc-Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Ro, RA1,
dan Ra2, yang dikonfirmasi lebih lanjut di pabrik-pabrik
oleh LC / MS / MS. Ditemukan bahwa jumlah relatif antara
beberapa ginsenosides isomer bervariasi secara signifikan
di tiga pabrik: misalnya, Rf terdeteksi dengan jumlah yang
luar biasa di kedua tanaman 4 dan 6, tetapi tidak
terdeteksi di pabrik 5 (Gambar 6A-C); dan jumlah relatif
antara tiga isomer dari Rc, Rb2, dan RB3 sangat berbeda
dari satu tanaman ke yang lain (Gambar 6D dan E). Hasil
yang diperoleh oleh EGNLS dan LC / MS / MS untuk
tanaman 5 dan 6 setuju dengan baik dengan hasil
sebelumnya diterbitkan.16,31
Data kuantitatif Empat Mayor Ginsenosides
di
Panax Tanaman. Kami dipekerjakan metode ditetapkan
sebelumnya oleh Wang et al. untuk kuantisasi empat
ginsenosides besar di tiga pabrik Panax. 16 The quantitative
data for the three plants are shown in Table 2. The
concentrations of all four ginsenosides in the transformed
hairy roots are much lower than those in the other two plants
and also significantly lower than those in the successfully

here were not successful in the production of
ginsenosides, and the culture conditions needed
further optimization to improve productivity.
CONCLUSIONS
In this report, upon the demonstration of the
reproducibility and specificity of OCE, an EGNLS approach
for rapid and selective screening of glycosides has been
established. This approach employs a collision energy
gradient while performing neutral loss scans with a MS/MS
and has been successfully demonstrated with the rapid
screening of glycosides of interest in two crude plant
extracts. Compared with the conventional fixed-energy
neutral loss scan, the EGNLS has several advantages: first,
the former is liable to such problems as low sensitivity or
omission of some interesting compounds; this is due to the
usual mismatch between the preset collision energy and
some target compounds’ OCE; however, the EGNLS
method overcomes this problem by scanning continuously
2246 Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004
over a collision energy range; second, EGNLS
simultaneously measures the OCE of the screened
compounds and therefore provides extra structural
information on the screened compounds and helps to
locate the compounds of interest, as demonstrated with
the two applications in this report. In addition, the
measured OCE of screened compounds are also essential
parameters for further LC/MS/MS analysis of those
compounds.
Telah terbukti bahwa pendekatan ini menawarkan
skrining cepat dan selektif dari glikosida dalam ekstrak
biologis mentah: glikosida dalam ekstrak kasar disaring
dengan EGNLS selama rentang energi tabrakan dari 0
sampai 100 eV, dan di antara mereka glikosida tertarik
diurutkan keluar berdasarkan OCE mereka; kemudian
dengan menggunakan beberapa parameter yang diperoleh
sebelumnya oleh EGNLS (yaitu,
(31) Chan, TWD; Tapi, PPH; Cheng, SW; Kwok, IMY; Lau, FW;
Xu, HX Anal. Chem. 2000, 72, 1281-1287.
Gambar 6. LC lanjut / analisis MS / MS ginsenosides isometrik pada tanaman Panax: XIC dari m / z 799 f 637, masing-masing, dari (A)
tanaman 4, (B) tanaman 5, dan (C) tanaman 6; XIC m / z 1077f 915, masing-masing, dari (D) tanaman 4, (E) tanaman 5, dan (F) tanaman 6.

Tabel 2. Isi Empat Mayor Ginsenosides di Tiga Tanaman

dimodifikasi sesuai dengan kemungkinan kerugian dari
Panax
berbagai jenis dan jumlah gula. Pendekatan ini mungkin
tidak berlaku untuk C-glikosida, yang kerugian gula yang
minim (data tidak ditampilkan).
Strategi ini juga memiliki potensi untuk skrining
ditransformasikan P.
dan identi-fikasi jenis lain dari senyawa dalam
ginseng akar matriks kompleks, disediakan kerugian netral
P. ginseng CA Meyer konstan dan intensif ditemukan untuk jenis senyawa
P. quinquefolius L. sasaran.

PENGAKUAN
nilai-nilai OCE dan m / z dari induk dan produk ion dari
Karya ini secara finansial didukung oleh Chinese
National Key Yayasan Sains (Grant 1999054404) dan
glikosida disaring), LC metode / MS / MS dapat dengan
pendanaan internal dari SDA.
mudah dibentuk untuk analisis lebih lanjut dari glikosida
disaring. Dua aplikasi dalam laporan ini telah menunjukkan
CATATAN SETELAH secepatnya POSTING
bahwa strategi ini dengan cepat dapat memberikan
Makalah ini telah diposting di Web pada 3/13/04.
informasi jelas tentang glikosida di ekstrak tanaman Selanjutnya, daftar dan urutan kontribusi penulis
mentah, tanpa menggunakan konvensional memakan berubah. Makalah ini diumumkan pada 3/24/04.
waktu dan prosedur pemisahan melelahkan (seperti
metode pemisahan phy-tochemical).
Diterima untuk meninjau 16 Desember 2003. 6 Februari
Dalam kasus di mana glikosida dengan lebih link gula
2004.
kompleks yang menarik, massa hilangnya netral untuk
EGNLS dapat dengan mudah
AC030413T
Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 8, April 15, 2004 2247