LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

PERCOBAAN 4

ISOLASI DNA PLASMID

(Virtual Experiment)

Disusun oleh

Nama : Itsna Sofia Rahma

NIM : K100180206

Kelas :I

Kelompok : 2

Korektor : Aisyah Mohadeti

Laboratorium Biologi Molekuler

Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Surakarta
Semester Genap 2019/2020
 ISOLASI DNA PLASMID

1. Instruksi: silakan menonton Video 1 mengenai Isolasi DNA plasmid menggunakan

metode alkali lisis dan jawab pertanyaan di bawah ini secara berkelompok!
a. Sebutkan alat dan bahan yang digunakan pada metode alkali lisis pada video
tersebut!
Jawab:
 Alat :
1. Mikropipet tips
2. Mikropipet
3. Vial (botol) untuk menyimpan eppeendrof
4. Vortex mixture
5. Centrifuges
6. Gelas Bekker

 Bahan :
1. Buffer TE dengan RNAase A
2. Kultur bakteri
3. Etanol 70%
4. Larutan lisis I,II dan III

b. Buatlah cara kerja skematis dari isolasi plasmid dengan metode alkali lisis pada
video tersebut!
Jawab:

Diatur volume mikropipet menjadi 1500 mikroliter kemudian diambil tip yang sesuai

Diambil kultur bakteri pada tabung reaksi dan diambil kultur bakteri sebanyak
1500mikroliter

Dituangkan kedalam tabung sentrifugal mikro atau eppendrof

Dimasukkan atau disimpan kedalam alat sentrifugasi dan diseimbangkan berat dalam
dengan diambil air sebanyak 1500 mikroliter dan dituangkan kedalam tabung
sentrifugal atau eppendrof, dimasukkan atau disimpan kedalam alat sentrifugasi

Ditutup lead dan diatur dengan 5000rpm selama 5 menit dan suhu 4℃

Dibuka centrifuge dan dikeluarkan vial

 Diambil supernatant dengan menggunakan mikropipet dengan hati hati tanpa
mengganggu peletnya dan diletakkan kedalam bekker glass

Diambil mikropipet dan diatur menjadi volume 100 mikroliter digunakan tip yang
sesuai

Diambil larutan lisis I dari kotak es dan di tuangkan ke dalam tabung sentrifuge yang
berisi pellet (endapan dari kultur bakteri)

Diletakkan ke dalam vortex mixture dan diatur volumenya

Diambil mikropipet dan diatur menjadi volume 2000mikroliter dan digunakan tip yang
sesuai.

Diambil larutan lisis II menggunakan mikropipet ditambahkan kedalam vial yang

mengandung pellet dan larutan lisis I

Ditutup penutup vial dan dicampur dengan membolak balikkan vial menggunakan
tangan selama 5-6kali

Diletakkan vial tersebut kedalam kotak es selama 1 menit.

Diatur mikropipet dengan volume 150 mikroliter dan digunakan tip yang sesuai

Diambil larutan lisis III dari kotak es, diambil larutan sebanyak 150 mikroliter

Ditambahakn larutan lisis ke III kedalam vial yang ada di kotak es

Ditutup penutup vial dan dicampur dengan membolak balikkan vial menggunakan
tangan selama 5-6kali, disimpan vial kedalam kotak es selama 5 menit.
Setelah 5 menit diambil vial dan disentrifugasi pada 5000rpm selam 5menit dengan suhu
4℃

Diambil vial dari dalam sentrifuges, diambil supernatant dengan hati hati tanpa
mengganggu pellet

Diletakkan kedalam rak, ditambahkan larutan supernatant dalam vial.

Diatur volume mikropipet menjadi 200 mikroliter digunakan tip yang sesuai
Diat urv olu me mikr opi pe tmen jad i20 0mik rol ite rdi gu nak an tip ya ng se ua i

Diambil etanol 70% dengan menggunakan mikropipet

Diat urv olu me mikr opi pe tmen jad i20 0mik rol ite rdi gu nak an tip ya ng se ua i

Ditambahkan kedalam vial yang mengandung transfer suppernatan

Dia tu rvo lum emik rop ip et me nja di2 0 mikr olit er dig una ka nti py an gs esu ai

Dimasukkan kedalam vortex mixture, didiamkan selama 2 menit.

Diat urv olu me mikr opi pe tmen jad i20 0mik rol ite rdi gu nak an tip ya ng se ua i

Disentrifugasi selama 5menit dengan 5000rpm dengan suhu 4℃

Dia tu rvo lum emik rop ip et me nja di2 0 mikr olit er dig una ka nti py an gs esu ai

Dikeluarkan vial dari sentrifuge, diambil supernatant tanpa mengganggu pellet diletakan
kedalam beker glass
Diat urv olu me mikr opi pe tmen jad i20 0mik rol ite rdi gu nak an tip ya ng se ua i

Didiamkan vial dengan posisi berdiri selama 2 menit dengan suhu ruang
Diat urv olu me mikr opi pe tmen jad i20 0mik rol ite rdi gu nak an tip ya ng se ua i

Diatur mikropipet dengan volume 1000 mikroliter diambil etanol 70%

Dia tu rvo lum emik rop ip et me nja di2 0 mikr olit er dig una ka nti py an gs esu ai

Ditambahkan kedalam vial yang telah dikeringkan pada suhu ruang tersebut.
Dia tu rvo lum emik rop ip et me nja di2 0 mikr olit er dig una ka nti py an gs esu ai

Disentrifugasi selama 5menit dengan 5000rpm dengan suhu 4℃, Dikeluarkan vial dari
sentrifuge, diambil supernatant tanpa mengganggu pellet diletakan kedalam beker glass
Diat urv olu me mikr opi pe tmen jad i20 0mik rol ite rdi gu nak an tip ya ng se ua i

Diletakkan vial kedalam rak dengan dibuka tutupnya selama 10 menit agar etanol
menguap
Dia tu rvo lum emik rop ip et me nja di2 0 mikr olit er dig una ka nti py an gs esu ai

Diatur mikropipet dengan volume 50 mikroliter diambil tip yang sesuai diambil TE
buffer dengan RNAaseA ditambahakn kevial dan dikeringkan
2. Instruksi: Silakan menonton Video 2 mengenai isolasi DNA plasmid menggunakan Plasmid
Miniprep Kit dan jawab pertanyaan di bawah ini secara berkelompok!
a. Sebutkan alat dan bahan yang digunakan untuk isolasi DNA plasmid menggunakan
Plasmid Miniprep Kit pada video tersebut!
Jawab:
 ALAT :
1. Pipet
2. Tabung microfuge 1,5ml
3. Pipet volume 5ml
4. Micropipet 100 – 1000 µL
5. Centrifuge
6. Kolom spin
7. Silica matriks
8. Tip box
 BAHAN :
1. Media LB/amp
2. Buffer lisis
(basa natrrium hidroksida dan deterjen deodenil sulfat
3. Kultur cair bakteri transformasi
4. Buffer cuci (70% etanol)
5. buffer neutralisasi
(kalium asetat dan asam asetat)
6. Buffer elution
b. Buatlah cara kerja skematis dari isolasi plasmid alkali lisis menggunakan Plasmid
Miniprep Kit pada video tersebut!
Jawab:

Dilabeli tabung microfuge

Dipipet 1,5 ml kultur cair dan dimasukkan kedalam tabung

microfuge
Dimasukkan tabung microfuge yang berisi kultur cair kedalam centrifuge,
diseimbangkan centrifuge dengan meletakkanya berhadapan takkan tabung secara
bersebrangan tabung microfuge

Dijalankan centrifuge dengan kecepatan penuh selama 1 menitbung microfuge

 Diambil tabung dari centrifuge, dalam tabung akan terdapat dua lapisan lapisan bawah
adalah pelet dan lapisan atas supranatan cair adalah media LB/amp

Dipisahkan sel bakteri dari media cair, dengan membuang atau memipet supranatan
(supranatan berupa media cair) hingga hanya tersisa pelet.Ditambahkan 250µL buffer
resuspensi lalu diresuspensikan, Kemudian mix sampai tidak gumpalan yang terlihat

Ditambahkan 250µL bufer lisis untuk memecahkan sel dan melepaskan

plasmid,Ditambahkan buffer netralisasi untuk mengendapkan sel Ditutup tabung dan
dimasukkan ke centrifuge dijalankan selama 10 menit

Didiamkan plasmid DNA hingga terjadi endapan, Setelah 10 menit pelet putih akan
muncul dibagian bawah tabung

Dilewatkan atau disaring supranatan cair yang mengandung DNA plasmid dengan spin
kolom yang berisikan matriks silika

Kemudian DNA plasmid akan berikatan dengan silika, sedangkan supranatan

ditempatkan dikolom lain

Dimasukkan kedalam centrifuge dijalankan selama 1 menit, Dicuci kolom yang berisi
matriks silika dengan bufer cuci untuk menghilangkan kontaminan yang tersisa,
sentrifugasi selama 1 menit

Disentrifugasi selama 1 menit, setelah selesai akan terlihat cairan tidak berwarna
dibawah tabung mikrocentrifuge yang mengandung DNA plasmid murni

3. Instruksi 3: Silakan jawab pertanyaan di bawah ini secara individu

a. Apakah tujuan dari isolasi DNA plasmid?
Jawab:
untuk memisahkan DNA dengan dari bahan lain seperti protein, lemak dan kabohidrat.
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran ( lisis) , ektrasi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulose protein, serta pemurnian DNA
b. Apakah prinsip dari metode alkali lisis dalam isolasi plasmid?
Jawab: Larutan analisis alkali digunakan pada metode alkali lisis dengan persamaan
larutan lisis 1, 2 dan 3. Sedangkan buffer digunakan pada miniprep kit. Dalam hal ini,
larutan lisis 1 yang digunakan pada metode alkali lisis sama dengan buffer resuspensi pada
miniprep kit yaitu larutan berisikan Tris-EDTA dan glukosa . Larutan lisis 2 pada metode
 alkali lisis sama dengan buffer lisis pada miniprep kit yaitu larutan berisikan NaOH dan
SDS. Sedangkan larutan lisis 3 pada metode alkali lisis sama dengan buffer netralisasi pada
metode miniprep kit.
c. Apakah fungsi dari buffer resuspensi, buffer lisis, dan buffer netralisasi? Apa persamaan
dengan larutan alkali lisis?
Jawab:
 Buffer resuspensi
Buffer resuspensi untuk meressuspensi sel yang sebelumnya telah dipisahkan dari
media cairnya atau menggabungkan kembali pellet yang telah terbentuk.
 Buffer lisis
Buffer lisis berisi campuran natrium hidroksida dan deterjen sodium dedosil sulfat atau
SDS. SDS memisahkan komponen lipid dari sel. Selaput sel yang terdiri dari lipid
pecah terbuka atau lisis. Isi Sel termasuk kromosom sel dan DNA plasmid tumpah ke
dalam larutan. SDS dan pH larutan yang tinggi kemudian mendenaturasi kromosom
dan DNA plasmid. Serta untuk memberi warna biru ketika terjadi kontaminasi DNA
plasmid
 Buffer netralisasi
Buffer netralisasi mengandung kalium asetat (CH3CO2K) dan asam asetat (CH3CO2H).
Potassium acetate berfungsi untuk mengembalikan pH ke netral sehingga untaian DNA
dapat berubah bentuk. Untaian tunggal panjang kromosom DNA tersangkut dengan
puing seluler lainnya seperti protein dan lipid untuk membentuk endapan yang tidak
larut. Sementara itu, untaian DNA plasmid yang lebih kecil dan masih terjalin dengan
cepat mengalami rehidrasi dan tetap dalam larutan. Sehingga penambahan buffer
netralisasi dapat menyebabkan sebuah pelet putih muncul di bagian bawah dan samping
tabung
d. Apakah fungsi membran silica pada spin column?
Jawab: Kolom spin mengandung membran silika yang berfungsi mengikat DNA plasma
dengan erat yang merupakan supernatan buffered asin. Setiap protein RNA yang tersisa
atau makromolekul lain melewati membran dan ditemukan dalam aliran-setelah
sentrifugasi. pada titik ini DNA terikat pada matriks silika dalam kolom untuk
menghilangkan sisa garam dari buffer.

4. Instruksi 4: Silkan menonton video 4 mengenai Nanodrop, dan jelaskan kegunaan dari
Nanodrop (BioDrop)! (berkelompok)
Jawab:
Nanodrop merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengukur absorbansi DNA dengan
spektrofotometer. Hal ini didasarkan pada pronsip bahwa DNA dapat menyerap sinar UV pada
panjang gelombang 260 nm pada sampel yang murni. Penetapan kadar menggunakan nanodrop
digunakan blanko untuk mempersiapkan alat supaya dapat bekerja dengan baik. Jarak
pengukuran serapan DNA ditentukan pada panjang gelombang 230 – 280 nm. Pada range
panjang gelombang tersebut grafik serapan DNA terlihat. Pada sampel yang tidak murni data
panjang gelombang tidak valid.
Simulasi hasil:
DNA Plasmid yang dihasilkan BSKS-ARE-LacZ
Jumlah 2 tube
Volume sampel 20 µL
Blanko Buffer TE
Instrument BioDrop

Sampel
Sampel 1 Sampel 2
A260/280 1,133 A260/280 1,135
Kadar 140,7 µg/mL Kadar 142,0 µg/mL