ISOFLAVON

1. Struktur umum isoflavon :

Isoflavon terdiri atas struktur dasar C6-C3-C6, secara alami disintesa oleh
tumbuh-tumbuhan dan senyawa asam amino aromatik fenilalanin atau tirosin.
Biosintesa tersebut berlangsung secara bertahap dan melalui sederetan senyawa antara
yaitu asam sinnamat, asam kumarat, calkon, flavon dan isoflavon. Berdasarkan
biosintesa tersebut maka isoflavon digolongkan sebagai senyawa metabolit sekunder.
Isoflavon termasuk dalam kelompok flavonoid (1,2-diarilpropan) dan merupakan
kelompok yang terbesar dalam kelompok tersebut. Meskipun isoflavon merupakan
salah satu metabolit sekunder, tetapi ternyata pada mikroba seperti bakteri, algae, jamur
dan lumut tidak mengandung isoflavon, karena mikroba tersebut tidak mempunyai
kemampuan untuk mensintesanya. Senyawa isoflavon merupakan salah satu komponen
yang mengalami proses metabolisme.
Isoflavon termasuk dalam golongan flavonoid yang merupakan senyawa
polifenolik. Stuktur kimia dasar dari isoflavon hampir sama seperti flavon, yaitu
terdiri dari 2 cincin benzen (A dan B) dan terikat pada cincin C piran heterosiklik,
tetapi orientasi cincin B nya berbeda. Pada flavon, cincin B diikat oleh karbon
nomor 2 cincin tengah C, sedangkan isoflavon diikat oleh karbon nomor 3. Pada
umumnya, senyawa isoflavon banyak ditemukan pada tanaman kacang-kacangan atau
leguminosa. Isoflavon pada kedelai terdapat dalam empat bentuk, yaitu :
1. Bentuk aglikon (non gula) : genistein, daidzein, dan glycitein;
2. Bentuk glikosida: daidzin, genistin dan glisitin;
3. Bentuk asetilglikosida : 6-O-asetil daidzin, 6-O-asetil genistin, 6”-O-asetil glisitin;
dan
4. Bentuk malonilglikosida : 6-O-malonil daidzin, 6-O-malonil genistin, 6-O-malonil
glisitin.

Gambar Struktur Isoflavon

2. Ciri khas isoflavon
- Merupakan kelompok terbesar dari kelompok flavonoid
- Banyak ditemukan pada tanaman kacang-kacangan atau leguminosa
- Merupakan senyawa polifenolik
- Senyawa penting sebagai fitoaleksin

3. Sifat fisika kimia isoflavon

Isoflavon termasuk dalam golongan flavonoid yang merupakan senyawa polifenol
sehingga bersifat kimia senyawa fenol yaitu agak asam dan dapat larut dalam basa dan
karena merupakan senyawa polihidroksi (gugus hidroksi) maka juga bersifat polar
sehingga dapat larut dalam pelarut polar seperti metanol, etanol, aseton, air, butanol,
dimetil sulfoksida dan dimetil formamida. Disamping itu dengan adanya gugus
glikosida yang terikat pada gugus flavonoid sehingga cenderung menyebabkan
flavonoid mudah larut dalam air. Pemisahan senyawa golongan flavonoid berdasarkan
sifat kelarutan dalam berbagai macam pelarut dengan polaritas yang meningkat adalah
sebagai berikut :
1. Flavonoid bebas dan aglikon, dalam eter.
2. O-Glikosida, dalam etil asetat.
3. C-Glikosida dan leukoantosianin dalam butanol dan amil alkohol. Oleh karena itu
banyak keuntungan ekstraksi dengan polaritas yang meningkat.

4. Analisis isoflavon
1. Kromatografi
Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah
basa atau atau amonia; jadi mereka mudah dideteksi pada kromatogram atau
larutan. Deteksi paling sederhana jika senyawa menunjukkan penyerapan di
daerah UV gelombang pendek (254nm) atau jika senyawa tersebut dapat dieksitasi
ke fluoresensi radiasi UV gelombang panjang (365 nm). Kebanyakan flavonoid
tidak terlihat pada aras yang dijumpai pada kromatografi kertas, karena alasan itu
untuk mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV 366 nm bukan
254 nm, dengan atau tanpa diuapi amonia. Pada tabel dapat dilihat warna bercak
dari segi struktur flavonoid.

WARNA BERCAK DENGAN Jenis flavonoid yang mungkin

 SINAR UV
SINAR UV SINAR UV
TANPA NH3 DENGAN NH3
Lembayung gelap Kuning, hijau- 1. Biasanya 5-OH flavon atau
kuning, atau hijau flavonol (tersulih pada 3-O dan
mempunyai 4’-OH)
2. Kadang – kadang 5-OH
Perubahan warna flavanon dan 4’-OH khalkon tanpa
sedikit atau tanpa OH pada cincin B
perubahan warna 1. Biasanya Flavon atau flavonol
tersulih pada 3-O mempunyai 5-OH
tetapi tanpa 4’-OH bebas
2. Beberapa 6- atau 8-OH flavon
dan flavonol tersulih pada 3-O serta
mengandung 5-OH
3. Isoflavon, dihidroflavonol,
Biru muda biflavonil dan beberapa flavonon
Merah atau jingga yang mengandung 5-OH
4. Khalkon yang mengandung 2’
Fluoresensi Biru Fluoresensi hijau- atau 6’-OH tetapi tidak mengandung
Muda kuning atau hijau 2-atau 4-OH bebas.
biru
Beberapa 5-OH flavanon
Khalkon yang mengandung 2- dan /
Perubahan warna atau 4’-OH bebas
sedikit atau tanpa 1. Flavon dan flavanon yang tak
perubahan mengandung 5-OH
Fluoresensi 2. Flavanol tanpa 5-OH bebas tetapi
Tak nampak murup biru muda tersulih pada 3-OH
Kuning redup dan Fluoresensi biru Isoflavon yang tak mengandung 5-OH
kuning atau muda bebas
fluoresensi jingga Perubahan warna
sedikit atau tanpa Isoflavon yang tak mengandung 5-OH
Fluoresensi perubahan bebas
 kuning
Jingga atau merah Isoflavon tanpa 5-OH bebas
Hijau kuning, Flavonol yang mengandung 3-OH
hijau biru atau Perubahan warna bebas dan ada atau tidak ada 5-OH
hijau sedikit atau tanpa bebas (kadang – kadang berasal dari
perubahan dihidroflavonol)
Auron yang mengandung 4’-OH bebas
Merah jingga dan beberapa 2- atau 4-OH khalkon
redup atau merah Biru 1. Auron yang tak mengandung 4’-OH
senduduk bebas dan flavanon tanpa 5-OH bebas
Merah jambu atau Biru 2. Flavonol yang mengandung 3-OH
fluoresensi bebas dan disertai atau tanpa 5-OH
kuning bebas.
Antosianin 3-glikosida

Sebagian besar antosianidin 3,5

diglikosida
Tabel Penafsiran warna bercak dari segi struktur flavonoid

2. Spektroskopi Serapan Ultraviolet-Tampak (UV-Vis)

Spektroskopi UV – Vis digunakan untuk membantu mengidentifikasi jenis
flavonoid dan menentukan pola oksigenasinya. Disamping itu, kedudukan gugus
hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan dengan menambah
”pereaksi geser ” ke dalam larutan cuplikan dan mengamati pergeseran puncak
serapan yang terjadi. Spektrum flavonoid biasanya ditentukan dengan pelarut
metanol atau etanol. Spektrum khas terdiri atas 2 maksima pada rentang
240– 280 nm (pita II) dan 300 – 550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan
kekuatan nisbi maksima tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai
sifat flavonoid dan pola oksigensainya. Ciri khas dalam spektrum tersebut adalah
memberikan puncak relatif rendah pada pita I untuk flavonoid golongan
hidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon. Untuk khalkon, auron, dan antosianin
memberikan puncak relatif tinggi. Ciri ini tidak berubah walaupun pola
oksigenasinya berubah. Petunjuk mengenai rentang maksima utama yang
diperkirakan untuk setiap jenis flavonoid dapat dilihat pada tabel.
 PITA II
PITA I (NM) JENIS FLAVONOID
(NM)
250-280 310-350 Flavon
250-280 330-360 Flavonol (3-OH
250-280 350-385 tersubtitusi)
245-275 310-330 bahu Flavonol (3-OH bebas)
Kira – kira 320 puncak Isoflavon
275-295 300-330 Isoflavon (5-deoksi, 6,7
230-270 340-390 dioksigenasi)
(kekuatan 380-430 Flavanon dan
rendah) 465-560 dihidroflavonol
230-270 Khalkon
(kekuatan Auron
rendah) Antosianin
270-280
Tabel Rentangan Serapan Spektrum UV-Vis Flavonoid

Gambar Spektrum serapan UV-Vis jenis flavonoid yang berbeda

tetapi pola hidroksilasinya sama

Informasi tambahan untuk mengidentifikasikan flavonoid dapat diperoleh

dengan menggunakan pereaksi dianostik. Adapun pereaksi diagnostik yang
digunakan adalah NaOH, AlCl3, HCl, Natrium Asetat anhidrat, dan asam borat
anhidrat. Spektrum ”NaOMe” merupakan spektrum flavonoid yang gugus
hidroksil fenolnya sampai batas tertentu terionisasi. Karena itu spektrum ini
biasanya merupakan petunjuk ”sidik jari” pola hidroksilasi dan juga bermanfaat
untuk menentukan gugus hidroksil yang lebih asam dan tidak tersubtitusi.
Degradasi atau pengurangan kekuatan spektrum setelah waktu tertentu merupakan
petunjuk baik akan adanya gugus yang peka terhadap basa. Spektrum ’AlCl3’ dan
’AlCl3 / HCl’ menunjukkan terbentuknya kompleks tahan asam antara gugus
hidroksil dan keton yang bertetangga dan membentuk kompleks yang tak tahan
asam dengan gugus orto-dihidroksil. Pereaksi ini dapat digunakan untuk
mendeteksi kedua gugus tersebut.

Gambar Reaksi Pembentukan Kompleks antara flavonoid dengan AlCl3

Spektrum ’NaOAc’ hanya menyebabkan pengionan yang berarti pada pada

gugus hidroksil yang paling asam yaitu untuk mendeteksi ada atau tidaknya gugus
7-OH bebas. Spektrum ’NaOAc/H3BO3’ menjembatani kedua gugus -OH pada
gugus ortodihidroksi dan digunakan untuk mendeteksinya 6.
 Gambar Kompleks Flavonoid dengan Natrium Asetat dan Asam Borat

3. Spektroskopi Resonansi Magnet Inti (RMI)

Untuk penentuan struktur flavonoid digunakan RMI – 1H dan 13 C.
a. RMI – 1H
Spektrum RMI – 1H terlihat terutama di daerah 0 – 10 ppm medan
bawah dari sinyal acuan tetrametilsilan (yang berdasarkan perjanjian
ditetapkan pada 0 ppm). Hanya proton yang menghasilkan sinyal
(beresonansi) di daerah ini dan proton yang secara kimia sama memberikan
sinyal yang sama. Ukuran sinyal (integrasi) berbanding lurus dengan jumlah
proton yang menghasilkan sinyal. Pada identifikasi flavanoid Spektroskopi
Resonansi Magnet Inti (RMI – 1H) digunakan khas untuk :
b. Penentuan pola oksigenasi (pada ketiga lingkar)
c. Penentuan jumlah gugus metoksi (dan kedudukannya)
d. Pembedaan isoflavon, flavonon, dan dihidroflavonol
e. Penentuan jumlah gula yang ada (dan penentuan apakah ikatannya α – atau β )
f. Pendeteksian rantai samping hidrokarbon seperti –CH3 yang terikat pada C
dan prenil yang terikat pada C (atau O).
GESER KIMIA JENIS PROTON
(PPM)
0 Tetrametisilan (pembanding)
0 - 0,5 Gugus eter trimetilsilil
k. 1,0 C-CH3 ramnosa (doblet lebar)
k. 1,7 Gugus metil pada prenil (-CH2-
CH=C(CH3)2)
k. 2,0 (Proton lain 3,5 dan 5,2 ppm)
2–3 Asetat (-OCOCH3 dan C-CH3 aromatik)
3,5 – 4,0 H-3 flavonon (multiplet – dua proton)
4,2 – 6,0 Kebanyakan C-H gula
H-1 gula (juga H-2 dihidroflavonol), 5,0
k. 6,0 ppm
 6,0 – 8,0 Dan H-2 flavanon 5 - 5,5 ppm
7,5 – 8,0 Metilendikoksi (O-CH2-O), singlet
12 – 14 Proton pada cincin A dan B
H-2 isoflavon (singlet)
5 – OH (hanya terlibat bila pelarutnya
DMSO-d6)
*angka yang dikutip adalah turunan eter – TMS flavonoid
k. – kira – kira

RMI – 13C
Kelimpahan alam 13C hanya 1, 1% dan yang 1,1 % pada setiap flavonoid ini yang
menghasilkan spektrum RMI – 13C. Resonansi terjadi pada daerah 0 – 200 ppm medan
bawah dari tetrametilsilan (TMS); setiap karbon yang berlainan akan menghasilkan
satu sinyal. Berbeda dengan sinyal resonansi proton, kekuatan sinyal resonansi karbon
13
– 13 tidak menunjukkan jumlah karbon dan dengan demikian integrasi RMI – C
jarang ada gunanya. Spektroskopi Resonansi Magnet Inti (RMI – 13 C) digunakan khas
untuk :
a. Identifikasi gula yang terikat pada C- (dan O-)
b. Penentuan titik ikatan antar glikosida
c. Identifikasi penyulih asil dan titik asilasi
d. Penentuan titik ikatan –C (misalnya pada C-glikosida, biflavonoid)
JENIS KARBON RENTANGAN GESER KIMIA YANG
LAZIM
(PPM DARI TMS)
Karbonil (4-keto, asil) 210 – 170
Aromatik dan olefina :
a. teroksigenasi 165 – 155 (tanpa oksigenasi o dan p)
150 – 130 (ada oksigenasi o dan p)
b. tak teroksigenasi 135 -125 (tanpa oksigenasi o dan p)
125 – 90 ( ada oksigenasi o dan p)
Alifatik:
a. teroksigenasi (gula) 83 – 69 (C-1 pada O-glikosida, sekitar 100
b. tak teroksigenasi ppm)
(C-2,3 flavanon) 80 – 40 (C-4 epikatekin, 28 ppm)
 Metilenadioksi
O-CH3 Sekitar 100
C-CH3, CO CH3 55 – 63 (60 – 63 = o-dwisubstitusi)
Isopropenil Sekitar 17 – 20
(-CH2CH=C(CH3)2 21 (CH2), 122 (CH), 131 (C), 18 (CH3)
Tabel Rentangan Geser Kimia Karbon-13 Dari Berbagai Jenis Karbon Flavonoid

Seperti terlihat pada tabel di atas kedudukan ini (geser kimia) dipengaruhi oleh
penyulih yang berdekatan. Data pergeseran yang penting (untuk flavonoid) bila ada
penyulih pada kedudukan ’C-1’, orto, meta, dan para adalah sebagai berikut :

C-1 Orto Meta Para

Hidroksil +26.9 -12.7 +1.4 -7.3
Metoksil +31.4 -14.4 +1.0 -7.7
Metil +8.9 +0.7 -0.1 -2.9
Asetoksil +23.0 -6.4 +1.6 -2.3