FIKSASI, DEHIDRASI, DAN CLEARING Eko Prasetya, M.Sc.

FIKSASI
FIKSASI
Sebagian besar jaringan hewan maupun tumbuhan akan rusak
jika dipisahkan dari indukan multiselulernya dikarenakan ketidak
mampuan sel untuk mempertahankan bentuk alaminya. Maka,
untuk mempertahankan bentuk alaminya, dibutuhkan suatu
proses yang disebut dengan fiksasi (to fix) yang artinya
menetapkan pada bentuk alamiahnya, dikeraskan dan
distabilkan untuk dapat mempertahankan bentuknya selama
proses pembuatan preparat.
KERUSAKAN JARINGAN PASCA KEMATIAN
Aktifnya enzim-enzim autolysis yang menyebabkan kerusakan
jaringan dengan cara memecah protein menjadi asam amino.
Asam amino kemudian keluar dari sel dan tidak dapat digunakan
kembali. Hal ini menyebabkan protein structural yang terdapat
pada hampir seluruh jaringan akan rusak.
TUJUAN FIKSASI
 Menghentikan proses metabolic secara cepat
 Mencegah terjadinya perubahan yang bersifat regresif
 Mengawetkan bahan histologis dan sitologis
 Mempertahankan bentuk actual bahan biologis
 Mengeraskan dan menstabilkan bahan-bahan biologis karena
terjadi koagulasi protoplasma
 Memberi kemungkinan adanya perbedaan optic pada proses
pengamatan jaringan.
Untuk dapat melakukan fungsi fiksasi, maka proses
fiksasi membutuhkan reagen yang disebut dengan
larutan fiksatif. Larutan fiksatif merupakan larutan
yang menjalankan tugas dengan tujuan fiksasi.
SIFAT LARUTAN FIKSATIF
 Memiliki daya penetrasi yang baik ke dalam jaringan
 Dapat menembus jaringan dengan cepat tanpa menyebabkan
kerusakan
 Mencegah perubahan jaringan secara cepat
 Memiliki kemampuan koagulasi protoplasma dengan baik
 Tidak merusak jaringan dan isi sel
 Melindungi jaringan selama proses pengerjaan preparat
 Membuat bagian jaringan lebih jelas
Proses fiksasi harus dilakukan sesegera mungkin setelah
proses pengambilan jaringan untuk mencegah kerusakan
jaringan atau sel sebelum dilakukannya fiksasi.

Ingat:
Fiksasi memiliki fungsi menetapkan jaringan, bukan
mengembalikan jaringan ke bentuk semula sehingga kerusakan
yang diakibatkan sebelum terjadinya fiksasi tidak dapat
diperbaiki.
Larutan fiksatif idealnya mampu menjalankan fungsi seperti
tujuan fiksasi. Namun, fiksasi ideal sangat sulit untuk ditemukan.
Setiap larutan fiksatif memiliki kelebihan dan kekurangannya
masing-masing.
KESULITAN PENGGUNAAN LARUTAN FIKSATIF
 Fiksatif ideal sangat sulit ditemukan karena jaringan memiliki
karakter yang berbeda-beda.
 Dapat mengawetkan sel tertentu tetapi melarutkan bahan sel
yang lainnya.
 Bersifat mordant pada jaringan tertentu, tetapi mengganggu
proses pewarnaan pada jaringan lain.
 Tidak ada larutan fiksatif tunggal yang ideal, biasanya yang
baik, larutan bersifat majemuk.
 Mampu memfiksasi inti sel dengan baik, namun cenderung
menggembungkan jaringan (asam asetat).
 Penetrabilitas jaringan yang buruk, daya pengerasan jaringan
kurang, daya awet nucleus rendah, tetapi merupakan bahan
pengawet dan mordant sitoplasma yang sangat baik (Kalium
Dikromat).
 Formalin dan glutaraldehidal merupakan fiksatif yang umum
digunakan dalam bentuk larutan tunggal.
FIKSATIF YANG BAIK
Fiksatif yang baik biasanya terdiri dari larutan majemuk dengan
kemampuan koagulan dan kemampuan nonkoagulan sekaligus.
Contohnya larutan campuran antara asam asetat dan kalium
dikromat.
Koagunan akan mengubah protein menjadi serat halus
(menautkan antar protein agar tidak rusak) sehingga paraffin
dapat dengan mudah diinfiltrasi sehingga jaringan menjadi lebih
stabil pada saat disayat.
Nonkoagulan menimbulkan sedikit artifak, tetapi jika digunakan
tunggal dapat menimbulkan inkonsistensi pada jaringan
sehingga mengganggun proses infiltrasi dan embedding.
MEMILIH LARUTAN FIKSATIF
 Jenis dan tujuan pengamatan yang akan dilakukan
 Jenis sel atau jaringan yang akan difiksasi
 Memahami efek negative dan positif dari setiap larutan fiksatif
 Memahami jenis larutan fiksatif yang digunakan untuk
keperluan umum dan khusus.

Larutan fiksatif umum antara lain, formadelhida, glutaraldehida,

etanol, asam asetat, asam pikrat, kalium dikromat, mercuri
klorida, asam kromat, dan osmium tetroksida.
KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN
LARUTAN FIKSATIF (STUDI KASUS LARUTAN BOUIN)
Larutan fiksatif Keuntungan Kerugian
Larutan Bouin
Formaldehida Mampu memfiksasi sitoplasma Menghambat penetrasi paraffin
dengan baik dalam jaringan; Fiksasi kromatin
yang buruk
Asam Pikrat Koagulasi sitoplasma yang baik Mengerutkan jaringan dan
dan asidofilik, memudahkan membuat kromatin menjadi
paraffin untuk penetrasi, jaringan asidofilik
tetap lembut dan stabil, mampu
memfiksasi kromatin
Asam Asetat Mengurangi pengerutan Melarutkan sel
jaringan, inti, dan sitoplasma
LARUTAN FIKSATIF UMUM DAN TUJUANNYA
Tujuan Penggunaan Larutan Fiksatif Jenis Larutan Fiksatif
Tujuan pengamatan masih belum jelas Formalin
Anatomi komponen sel secara Formalin, Comori, Zenker, Helly, atau Bouin
sederhana

Pengamatan inklusi sel secara khusus Carnoy, Flemming, Champy, Helly,

Schaudinn atau Regaud

Pengamatanhistokimia Aldehida, Aseton, atau Etanol

FIKSATIF TUNGGAL
1. Asam asetat 7. Osmium tetroksida
2. Aseton 8. Asam pikrat
3. Kromium Trioksida 9. Kalium dikromat
4. Alkohol 10. Asam trikloroasetat
5. Aldehida/Formalin 11. Natrium sulfat
6. Merkuri Klorida
FIKSATIF MAJEMUK
Fiksatif Campuran Komponen Fiksatif Campuran Komponen
Larutan Mueller Kalium dikromat 2,5 atau 3 gram Larutan Heidenhain Kalium dikromat 1,8 gram
Natrium sulfat 1 gram Merkuri klorida 4.5 gram
Aquades 100 ml Asam asetat glasial 4,5 ml
Larutan Orth Kalium dikromat 2,5 gram Formalin komersial 10 ml
Natrium sulfat 1 gram Aquades 90 ml
Aquades 90 ml Larutan Lavdowsky Kalium dikromat 5 gram
Formalin 10 ml Merkuri klorida 0,15 gram
Larutan zenker Kalium dikromat 2,5 gram Asam asetat glasial 2 ml
Merkuri klorida 5 gram Akuades 100 ml
Natrium sulfat 1 gram Larutan Mann H2O panas 100 ml
Aquadest 100 ml Merkuri Klorida 2,5 gram
Larutan Helly Larutan Zenker 10 ml Asam pikrat 1 gram
Formalin komersial 1 ml
FIKSATIF MAJEMUK
Fiksatif Campuran Komponen
Larutan bouin Asam pikrat jenuh 75 ml
Formalin komersial 20 ml
Asam asetat glasial 5 ml
Larutan allen B Kristal asam kromat 1,5 gram
Kristal urea 2 gram
Larutan Gilson Merkuri klorida 20 bagian
Asam kromat 1% 20 bagian
Asam nitrat 2 bagian
Asam asetat glasial 2 bagian
Larutan Bensey Asam osmat 2% 2 ml
AOB Kalium dikromat 2,5% 8 ml
Asam asetat glasial 1 tetes
Fiksatif Campuran Komponen
Larutan regaud Kalium dikromat 3% 80 ml
Formalin komersial 20 ml
Larutan Bianco Asam kromat 1 gram
Asam asetat glasial 5 ml
Aquadest 100 ml
Larutan Gate Asam kromat 0,7 gram
Asam asetat glasial 0,5 ml
Aquadest 100 ml
Larutan Navashin Asam kromat 0,8 gram
Asam asetat glasial 20 ml
Formalin komersial 5 ml
Aquadest 100 ml
FIKSATIF MAJEMUK
Fiksatif Campuran Komponen Fiksatif Campuran Komponen
Larutan carnoy Alkohol Absolut 60 ml Larutan Asam nitrat 12 ml
Kloroform 30 ml Petrunkewitsch A Nitrat dari cuprum 8 gram
Asam asetat glasial 10 ml Aquadest 100 ml
Larutan AFA Etanol 70% 90 ml Larutan Phenol 4 gram
(Alkohol Formalin Formalin komersial 10 ml Petrunkewitsch B Etil eter 6 gram
Asetat) Asam asetat glasial 2 ml Etanol 80%
Larutan kormer Kalium dikromat 1,8 gram
Uranil asetat 0,75 gram
Formalin komersial 3,6 ml
Asam asetat glasial 9 ml
Asam trikloroasetat 4,8 ml
Aquadest 87 ml
PERTIMBANGAN PENGGUNAAN
LARUTAN FIKSATIF
 Memperhatikan tujuan pengamatan dalam pembuatan
preparat histologi
 Efek pengerasan jaringan yang ditimbulkan oleh larutan fiksatif
 Volume larutan fiksatif yang digunakan
 Waktu perendaman jaringan menggunakan larutan fiksatif
PERLAKUAN SEBELUM FIKSASI
Maserasi
Jika jaringan terlalu padat seperti jaringan otot atau lainnya,
maka perlu diberikan perlakuan sebelumnya untuk proses
disosiasi selama fiksasi. Larutan maserasi bukanlah larutan
fiksatif, sehingga setelah proses maserasi, larutan harus segera
dimasukkan ke dalam larutan fiksasi kembali.
FIKSASI SELAIN MENGGUNAKAN
PERENDAMAN
Fiksasi dengan cara perfusi
Memaksa larutan fiksatif masuk ke dalam jaringan menggunakan
alat. Biasanya digunakan untuk pengawetan hewan yang baru mati
atau hewan yang masih hidup tetapi dibawah pengaruh anestesi.
Fiksasi ini untuk jaringan yang harus segera difiksasi tetapi tidak
dapat diambil dengan cepat.
Contoh jaringan: Sistem saraf
Contoh alat: Canulla glass
Tikus dengan sel saraf pusat pada otak yang akan
dikoleksi dan dibuat menjadi preparat histologi
 Hewan difiksasi segera dengan cara perfusi
sebelum organnya dikoleksi untuk menghindari
kerusakan organ tersebut.
DEHIDRASI
DEHIDRASI
Molekul air yang digunakan pada tahapan fiksasi dapat
mengganggu tahapan selanjutnya dari proses pembuatan
preparat (kecuali metode beku). Tahapan pembuangan air
tersebut, disebut dengan tahapan dehidrasi.

Untuk kebanyakan jaringan, tahapan dehidrasi diikuti dengan

tahapan penjernihan (Clearing) sehingga jaringan menjadi
jernih (transparan) sebelum diinfiltrasi.
TUJUAN DEHIDRASI
 Menarik air dari dalam jaringan setelah difiksasi
 Mencuci dan memperkokoh jaringan yang keras dan rapuh
PROSES DEHIDRASI
Melewatkan jaringan melalui satu seri larutan yang dapat
menarik air dengan konsentrasi larutan semakin naik dan
konsentrasi air semakin menurun. Larutan akan menarik air
dan kemudian menempati ruangan yang ditinggalkan oleh air
tersebut.
SYARAT LARUTAN PENDEHIDRASI
 Dapat menarik air dari dalam jaringan
 Dapat bercampur dengan clearing agent (larutan penjernih)
 Tidak membatalkan fungsi fiksasi
 Dapat mempertahankan bentuk jaringan seperti setelah
difiksasi
 Mampu mengisi ruangan pada jaringan yang ditinggalkan
oleh air.
 Sebaiknya digunakan dalam keadaan segar
LARUTAN PENDEHIDRASI
Alkohol
 Merupakan larutan pendehidrasi yang umum digunakan
 Dapat bercampur dengan xylol (clearing agent)
 Dimulai dari konsentrasi terendah hingga konsentrasi tertinggi
(absolut)
 Pada konsentrasi dibawah 70% atau 80%, tidak boleh ditahan
lebih dari 30-45 menit (kontiniu) pada masing-masing
konsentrasi
LARUTAN PENDEHIDRASI (ALCOHOL)
Pada jaringan yang difiksasi dengan larutan Zenker dan Helly,
pada konsentrasi alcohol 70%, tambahkan iodium tincture
yang berfungsi untuk melarutkan merkuri klorida dari dalam
jaringan.
Pelepasan merkuri klorida ditandai dengan warna pada larutan
pendehidrasi. Jika masih berwarna, ulangi penambahan iodium
tincture hingga warna menjadi bening.
Penggunaan alcohol absolut memiliki biaya produksi yang
sangat tinggi. Maka dianjurkan untuk memproduksi alcohol 95%.
Untuk membuat larutan alcohol 80% dari alcohol 95%, cukup
campurkan 80% bagian alcohol 95% dengan 15 bagian
aquades.
DIOKSAN (KOMBINASI DEHIDRASI DAN
INFILTRASI) (KEUNTUNGAN)
 Lebih praktis dan lebih cepat dibandingkan dengan alcohol
 Kualitas sayatan sebanding dengan dehidrasi alcohol
 Dapat bercampur dengan baik menggunakan air, alcohol, dan
xylol
 Menghemat alcohol dan xylol
 Dapat bercampur dengan Canada balsam
 Harga lebih murah dibanding dengan xilol
 Pengerutan jaringan tidak terlalu signifikan dan dapat melarutkan
merkuri
DIOKSAN (KOMBINASI DEHIDRASI DAN
INFILTRASI) (KERUGIAN)
 Bersifat toksik (beracun)
 Sangat mudah menguap, sehingga harus disimpan dalam botol
tertutup rapat
 Sering mengandung air dan bahan lain sehingga kemurniannya
berkurang
 Adanya air dan bahan lain menyebabkan pengerutan jaringan
hingga 50%
 Berwarna keruh jika sudah mengandung air.
n-BUTYL ALCOHOL (KOMBINASI DEHIDRASI
DAN INFILTRASI)
 Baik digunakan untuk jaringan yang keras
 Sangat baik untuk membuat sayatan embrio
n-BUTYL ALCOHOL (KOMBINASI DEHIDRASI
DAN INFILTRASI) (METODE)
Metode pertama
Jaringan langsung dipindah ke paraffin lembut → medium →
keras sebelum diembedding ke paraffin. Jaringan dibiarkan lama
pada setiap paraffin agar alcohol keluar dari paraffin.
Metode kedua
Jaringan dipindahkan ke n-Butyl Alcohol : Parafin keras (1:1) di
dalam oven. Campuran dibiarkan beberapa hari hingga alcohol
menguap dari paraffin.
CLEARING (PENJERNIHAN)
 Merupakan tahapan transisi dari alcohol ke paraffin
 Menghilangkan opasitas (tidak tembus cahaya) atau
menjadikan jaringan bening/jernih
 Menggunakan larutan yang dapat bercampur dengan paraffin
karena alcohol tidak dapat melarutkan paraffin
 Pada metode menggunakan celloidin, tidak perlu melakukan
penjernihan karena celloidin larut dalam alcohol absolut dan
eter.
LARUTAN PENJERNIH (CLEARING)
Larutan penjernih yang umum digunakan adalah Xylol (xylene),
Toluol (toluene), kloroform, dan minyak Cedar atau Metil
Salisilat. Xylol merupakan larutan penjernih yang paling sering
digunakan karena memiliki kecenderungan mengeraskan
jaringan sehingga perlu perhatian dalam penggunaannya
terutama untuk jaringan ikat, otot, dan tulang rawan.
XYLOL DAN TOLUOL
 Mengeraskan jaringan
 Dapat menguap keluar dari jaringan, sehingga butuh pengerjaan
yang cepat
 Setelah didehidrasi, jaringan dimasukkan pada campuran
alcohol:xylol (1:1) selama 30 menit dan 2x xylol selama 30-60
menit
 Jaringan dipindahkan pada paraffin lembut yang telah dicairkan
dalam oven
 Toluol tidak terlalu cepat menguap dan tidak mengeraskan
jaringan secara berlebih.
KLOROFORM
 Perendaman dengan campuran alcohol : Kloroform (1:1)
hingga jaringan tenggelam ke dasar wadah.
 Semakin banyak menyerap kloroform, semakin berat
jaringan.
 Bersifat mengeringkan sehingga tidak direkomendasikan.
MINYAK CEDAR ATAU METIL SALISILAT
 Dapat digunakan langsung dari alcohol 95%, karena bersifat
mengeluarkan air
 Harus direndam semalam penuh untuk mengeluarkan alcohol
dari jaringan dan digantikan dengan minyak cedar
 Minyak harus dikeluarkan terlebih dahulu sebelum infiltrasi
dengan penambahan toluol
TERIMA KASIH