LAPORAN PRAKTIKUM 11

Untuk memenuhi tugas praktikum mata kuliah Biomedik

Dosen Pembimbing : Dr. Hj. Tri Hapsari, Skep.MKes

Disusun oleh : Kelompok 3 Biomedik Kelas 1B

P17320121066 RACHEL ANNE   P17320121086 SHIFA SHABILA HAKIM

ABIGELITA LIMBONG P17320121088 SINTA NUR AIDA
P17320121068 RAHMI AZZAHRA P17320121090 SITI MAESAROH
NOVANDI
P17320121092 SITI NURIYAH IRYATI
P17320121070 RAYA NOVALINA
NAIBAHO P17320121094 SITI SYARAH
RAHMAWATI
P17320121072 RIANTI PUTRI HARONI
P17320121096 SUZAN FITRINA
P17320121074 RIMA PUTRI YUZMILAR
NURHANIFAH
P17320121098 TSANIA NURLAELI
P17320121076 RISYDA AMALIA
FITRIANI P17320121100 WINDA ISNAENI

P17320121078 SALSA NABILLA P17320121102 ZAHARA SABILA

P17320121080 SALWA SALSABILA P17320121104 ZAKIYAH ARIFAH

SUMANTRI DHIYAUL MILLAH 

P17320121084 SHAZKIA MELVABELLA

APRILIA

JURUSAN KEPERAWATAN BANDUNG

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN BANDUNG

TAHUN AJARAN 2021-2022

1
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI.............................................................................................................................................2
PENDAHULUAN.....................................................................................................................................3
PEMBAHASAN.......................................................................................................................................4
1. Tata nama................................................................................................................................5
2. Klasifikasi.................................................................................................................................6
3. DNA ligase................................................................................................................................6
4. Jenis-Jenis DNA Ligase...........................................................................................................7
5. Ligasi DNA...............................................................................................................................8
6. Ligases mamalia.......................................................................................................................9
7. Aplikasi dalam penelitian biologi molekuler.......................................................................10
8. Aplikasi...................................................................................................................................11
PENUTUP.............................................................................................................................................15
Kesimpulan....................................................................................................................................15
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................................................16

2
 PENDAHULUAN
Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa
yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia
organic.Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul
lain yang disebut produk..
Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama adalah substrat, suhu,
keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH (tingkat keasaman)
optimum yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat mengalami perubahan
bentuk jika suhu dan keasaman berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat
bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini akan
menyebabkan enzim kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh
molekul lain. Inhibitor adalah molekul yang menurunkan aktivitas enzim, sedangkan
aktivator adalah yang meningkatkan aktivitas enzim. Banyak obat dan racun adalah inihibitor
enzim.
Tiap-tiap enzim memiliki empat digit nomor urut sesuai dengan ketentuan klasifikasi
yang berlaku. Nomor pertama untuk klasifikasi teratas enzim didasarkan pada ketentuan
berikut:
1. EC 1 Oksidoreduktase : mengatalisis reaksi oksidasi/reduksi
2. EC 2 Transferase            : mentransfer gugus fungsi
3. EC 3 Hidrolase               : mengatalisis hidrolisis berbagai ikatan
4. EC 4 Liase                        : memutuskan berbagai ikatan kimia selain melalui hidrolisis
dan oksidasi
5. EC 5 Isomerase               : mengatalisis isomerisasi sebuah molekul tunggal
6. EC 6 Ligase                   : menggabungkan dua molekul dengan ikatan kovalen

3
 PEMBAHASAN
Ligase merupakan proses memasukan sekuens DNA yang mengandung gen yang
diinginkan ke dalam DNA genom (Sunatmo  2009). Ligase menghasilkan produk yang
disebut dengan DNA rekombinan (Voet D & Voet JG 1994). DNA ligase merupakan enzim
yang dapat mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-
hidroksil yang digunakan saat proses ligasi pada DNA yang mengalami pemotongan dengan
enzim restriksi sebelumnya (Gul S et al. 2004). DNA ligase diperlukan untuk
menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan
DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA, Oleh karena
pentingnya DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang
menginhibisi DNA ligase (Miesel L et al. 2002).
DNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaitu
 NAD+
DNA ligase NAD+-dependent ditemukan hanya di bakteri
 ATP
 DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria, archaea, dan virus.
Ligase merupakan proses memasukkan sekuens DNA yang mengandung gen yang
diinginkan ke dalam DNA genom. Proses ligasi ini dapat dilihat ketika proses transformasi.
Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan
penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan. Hasil ini sesuai
dengan literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel bakteri
mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil (Brown 1995).
Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil ditandai dengan warna
koloni berwarna biru, sehingga dapat dikatakan percobaan meligasikan fragmen DNA
berhasil dilakukan karena terdapat koloni putih.
Proses ligasi yang tidak dapat terlihat itu dilakukan dalam tabung epedorf. Setelah
campuran berbagai larutan dengan DNA vektor dan insertnya akan disuspensikan agar
merata. Proses selanjutnya adalah inkubasi campuran larutan itu pada suhu 4 ºC selama satu
malam. Namun, Suhu optimum aktivitas DNA ligase adalah pada suhu 37ºC, tetapi pada suhu
tersebut ikatan hidrogen yang terbentuk di antara ujung lancip menjadi tidak stabil dan
kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut dan mengakibatkan

4
denaturasi. Maka, alternatif yag baik dilakukan dalam proses ini adalah inkubasi pada suhu
yang diturunkan misalnya antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi yang diperpanjang.
Proses ligasi yang dilakukan dengan bantuan enzim T4 DNA ligase. Fungsi dari T4 DNA
ligase adalah untuk menyambungkan fragmen-fragmen DNA pendek menjadi DNA utuh
yang disebut dengan DNA rekombinan. Enzim ini berasal dari T4 bakteriofage dan dapat
meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul.
Proses meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim
yang lebih besar (Bowen 2002).
Setiap kelas enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan kovalen menggunakan
energi yang dilepaskan oleh pembelahan ATP. Ligases penting dalam sintesis dan perbaikan
berbagai molekul biologis, termasuk DNA, dan digunakan dalam rekayasa genetik untuk
memasukkan DNA asing ke vektor kloning.
Dalam biokimia , ligase (dari bahasa Latin kata kerja ligāre - "untuk mengikat" atau
"untuk lem bersama-sama") adalah sebuah enzim yang dapat mengkatalisis bergabung
dengan dua molekul besar dengan membentuk baru ikatan kimia , biasanya dengan disertai
hidrolisis kelompok kimia kecil tergantung pada salah satu molekul yang lebih besar. Secara
umum, ligase yang mengkatalisis reaksi berikut:
    Ab + C → A-C + b
atau kadang-kadang
    Ab + cd → A-D + b + c
dimana huruf kecil menandakan, kelompok-kelompok kecil tergantung.
1. Tata nama
Nama-nama umum dari enzim ligase sering termasuk kata "ligase," seperti DNA
ligase , enzim yang biasa digunakan dalam biologi molekuler laboratorium untuk bergabung
bersama DNA fragmen. Nama umum lain untuk ligases termasuk sintetase, karena mereka
digunakan untuk mensintesis molekul baru.
Perhatikan bahwa, awalnya, biokimia nomenklatur sintetase dibedakan dan
synthases . Berdasarkan definisi asli, synthases tidak menggunakan energi dari nukleosida
trifosfat (seperti ATP, GTP, CTP, TTP, dan UTP), sedangkan sintetase memang
menggunakan trifosfat nukleosida. Hal ini juga mengatakan sintase yang merupakan liase
(liase adalah enzim yang mengkatalisis pemecahan berbagai ikatan kimia dengan cara selain
hidrolisis dan oksidasi, sering membentuk ikatan ganda baru atau struktur cincin baru) dan
tidak membutuhkan energi apapun, sedangkan sintetase adalah ligase (ligase adalah suatu

5
enzim yang mengikat dua bahan kimia atau senyawa) dan dengan demikian membutuhkan
energi. Namun, Komisi Bersama Nomenklatur Biokimia (JCBN) menyatakan bahwa 'sintase'
dapat digunakan dengan enzim yang mengkatalisis sintesis (apakah atau tidak menggunakan
trifosfat nukleosida), sedangkan 'sintetase' yang akan digunakan secara sinonim.
2. Klasifikasi
Ligases diklasifikasikan sebagai EC 6 dalam jumlah EC klasifikasi enzim. Ligases dapat
diklasifikasikan lebih lanjut ke dalam enam subclass:
1. EC 6,1 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan karbon-oksigen
2. EC 6,2 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan karbon-belerang
3. EC 6,3 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan karbon-nitrogen (termasuk
sintetase argininosuccinate )
4. EC 6,4 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan karbon-karbon
5. EC 6,5 termasuk ligases digunakan untuk membentuk fosfat ester obligasi
6. EC 6,6 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan logam nitrogen

3. DNA ligase
DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester
antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick. Nick pada DNA
dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan. Secara biologis, DNA
ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi,
menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses
reparasi DNA. Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase, sekarang ini telah
dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase. Dengan diinhibisinya DNA
ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akan mati. DNA ligase merupakan
enzim yang sangat berguna baik di dalam sel, maupun di luar sel. Untuk penggunaan di luar
sel, penggabungan dengan enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi
DNA rekombinan. Enzim restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita
untuk memotong DNA di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem
yang menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional.
Ligasi DNA adalah proses bergabung bersama dua ujung molekul DNA (baik dari
molekul yang sama atau berbeda). Secara khusus, melibatkan menciptakan ikatan fosfodiester
ikatan antara 3 'hidroksil dari satu nukleotida dan 5' fosfat dari yang lain. Reaksi ini biasanya
dikatalisis oleh enzim DNA ligase . Enzim ini akan Ligate fragmen DNA memiliki tumpul

6
 atau menggantung, melengkapi, berakhir 'lengket'. Biasanya, lebih mudah untuk Ligate
molekul dengan ujung lengket pelengkap dari ujung-ujung tumpul. DNA ligase T4 adalah
yang paling umum digunakan DNA ligase untuk teknik biologi molekuler dan dapat Ligate
berakhir 'lengket' atau tumpul.
Kedua komponen DNA dalam reaksi ligasi harus molar yang sama dan di sekitar
100μg/ml. Paling sering, seseorang ingin Ligate suatu molekul DNA masukkan ke dalam
plasmid, siap untuk transformasi bakteri . Biasanya, vektor plasmid DNA dan secara individu
dipotong untuk menghasilkan ujung komplementer, kemudian keduanya ditambahkan ke
reaksi ligasi yang akan circularised oleh DNA ligase. Jika tulang punggung plasmid untuk
menyisipkan DNA rasio terlalu tinggi maka kelebihan 'kosong' mono dan plasmid polimer
akan dihasilkan. Jika rasio yang terlalu rendah maka hasilnya mungkin kelebihan homo dan
linear dan melingkar heteropolymers.
4. Jenis-Jenis DNA Ligase
1. T4 DNA Ligase
T4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang
menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul. Untuk meligasi fragmen DNA
yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar. Proses ligasi
DNA T4 memerlukan larutan penyangga yang mengandung ATP dengan konsentrasi 0.25-1
mM. Proses ini dapat berlangsung pada kisaran suhu yang luas, namun untuk beberapa kasus,
proses ligasi dilakukan pada suhu tertentu. Seperti pada saat menginginkan efisiensi yang
tinggi dalam ligasi (contohnya membuat pustaka genom) suhu yang disarankan adalah 16 °C.
[5] Sementara itu, jika ligasi bertujuan untuk subcloning, ligasi dapat dilakukan pada suhu 4
°C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam.
2. T7 DNA Ligase
T7 DNA ligase merupakan DNA ligase dengan ukuran terkecil, yaitu sebesar 41 kDa.
DNA ligase ini berasal dari bakteriofage T7, mempunyai struktur yang terdiri dari dua
domain dengan sisi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain yang lebih besar.
Mekanisme DNA Ligase
Mekanisme DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP.
Peristiwa ini menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan
grup α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika
kofaktor berupa ATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor berupa
NAD+.[1] Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5’-

7
fosfat yang berada pada nick utas DNA. Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan terbentuk
antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan
enzim adenylate.
5. Ligasi DNA
DNA rekombinan jangka merangkum konsep penggabungan fragmen DNA dari
sumber yang berbeda ke dalam molekul DNA baru, dan semoga bermanfaat Bergabung
fragmen DNA linier bersama-sama dengan ikatan kovalen disebut ligasi.. Lebih khusus,
ligasi DNA melibatkan menciptakan ikatan fosfodiester antara 3 'hidroksil dari satu
nukleotida dan 5' fosfat dari yang lain.
Enzim yang digunakan untuk Ligate fragmen DNA DNA ligase T4, yang berasal dari
bakteriofag T4. Enzim ini akan Ligate fragmen DNA memiliki menggantung, ujung-ujung
kohesif yang anil bersama-sama, seperti contoh EcoRI bawah - ini setara dengan
memperbaiki "nick" dalam DNA dupleks. DNA ligase T4 juga akan Ligate fragmen dengan
ujung tumpul, meskipun konsentrasi yang lebih tinggi dari enzim yang biasanya
direkomendasikan untuk tujuan ini.
Reaksi ligasi membutuhkan tiga bahan selain air:
1. Dua atau lebih fragmen DNA yang telah baik tumpul atau kompatibel kohesif ("lengket")
berakhir.
2. Sebuah buffer yang mengandung ATP. Buffer biasanya diberikan atau disiapkan sebagai
konsentrat 10X yang, setelah pengenceran, konsentrasi ATP menghasilkan sekitar 0,25-1
mM. Sebagian besar enzim restriksi buffer akan bekerja jika dilengkapi dengan ATP.
3. T4 DNA ligase. Reaksi khas untuk memasukkan fragmen menjadi vektor plasmid
(subcloning) akan memanfaatkan sekitar 0,01 (ujung lengket) untuk 1 (tumpul ujungnya)
unit dari ligase.
Suhu inkubasi optimal untuk DNA ligase T4 16C dan ketika ligasi efisiensi yang
sangat tinggi yang diinginkan (misalnya membuat perpustakaan) suhu ini dianjurkan. Namun,
ligase aktif pada berbagai suhu, dan untuk tujuan rutin seperti subcloning, kenyamanan sering
menentukan waktu inkubasi dan suhu - ligations dilakukan di 4C semalam atau pada suhu
kamar selama 30 menit sampai beberapa jam biasanya bekerja dengan baik.

Efek dari DNA ligase T4. Fragmen DNA yang dihasilkan oleh pencernaan plasmid
dengan dua enzim restriksi diinkubasi dengan jumlah yang berbeda dari ligase untuk berbagai
periode waktu, kemudian dielektroforesis dalam agarosa 1%. Perhatikan bahwa bahkan

8
setelah 5 menit dengan ligase, pada dasarnya semua fragmen telah diikat satu sama lain, dan
bergeser ke berat molekul yang lebih tinggi Klik pada gambar untuk rincian.. Ini tes
sederhana kadang-kadang berguna untuk memeriksa tabung ligase dicurigai sebagai "mati".
Dalam biologi molekuler , DNA ligase adalah jenis enzim yang spesifik, sebuah
ligase , (gambar di bawah) yang beruntai tunggal perbaikan diskontinuitas dalam double
stranded DNA molekul, dalam untaian kata sederhana yang memiliki untai ganda istirahat
(istirahat di kedua pelengkap untai DNA). Dimurnikan DNA ligase yang digunakan dalam
kloning gen untuk bergabung molekul DNA bersama-sama. Alternatif, istirahat tunggal-untai,
ditetapkan oleh berbagai jenis ligase DNA menggunakan untai komplementer sebagai
template, tapi masih membutuhkan DNA ligase untuk membuat final ikatan fosfodiester
untuk sepenuhnya memperbaiki DNA.
DNA ligase memiliki aplikasi di kedua perbaikan DNA dan replikasi DNA (lihat ligases
mamalia ). Selain itu, DNA ligase telah digunakan luas dalam laboratorium biologi molekuler
untuk rekombinasi genetik percobaan (lihat Aplikasi dalam penelitian biologi molekuler ).
DNA ligase memperbaiki kerusakan kromosom
Mekanisme ligase
Mekanisme DNA ligase adalah untuk membentuk dua kovalen ikatan fosfodiester
antara 3 'ujung hidroksil dari satu nukleotida , ("akseptor") dengan 5 'akhir fosfat lain
("donor"). ATP dibutuhkan untuk reaksi ligase, yang hasil dalam tiga langkah:
(1) adenylation (penambahan AMP) dari residu di pusat aktif enzim, pirofosfat
dilepaskan;
(2) transfer AMP untuk fosfat 5 ' dari apa yang disebut donor, pembentukan ikatan
pirofosfat; pembentukan
3) dari ikatan fosfodiester antara 'fosfat dari donor dan 3' hidroksil 5 akseptor.
Sebuah contoh tentang bagaimana ligase bergambar bekerja (dengan ujung lengket)
Ligase juga akan bekerja dengan ujung tumpul , meskipun konsentrasi enzim yang lebih
tinggi dan kondisi reaksi yang berbeda diperlukan.
6. Ligases mamalia
Pada mamalia, ada empat tipe tertentu dari ligase. ligase , DNA, ATP-dependent
1. DNA ligase I : ligates DNA baru lahir dari untai lagging setelah H ribonuklease telah
dihapus primer RNA dari fragmen Okazaki .
2. DNA ligase II: alternatif disambung bentuk DNA ligase III ditemukan di non-membagi
sel.

9
3. DNA ligase III: kompleks dengan perbaikan DNA protein XRCC1 untuk membantu
dalam DNA penyegelan selama proses perbaikan eksisi nukleotida dan fragmen
rekombinan.
4. DNA ligase IV : kompleks dengan XRCC4 . Ini mengkatalisis langkah akhir dalam non-
homolog akhir bergabung jalur DNA untai ganda istirahat perbaikan. Hal ini juga
diperlukan untuk V (D) rekombinasi J , proses yang menghasilkan keragaman dalam
imunoglobulin dan sel T reseptor lokus selama sistem kekebalan pembangunan.

Beberapa bentuk DNA ligase hadir dalam bakteri (biasanya lebih besar) mungkin
memerlukan NAD untuk bertindak sebagai co-faktor, sedangkan bentuk lain ligases DNA
(biasanya hadir dalam E.coli, dan biasanya lebih kecil) mungkin memerlukan ATP untuk
bereaksi. Juga, sejumlah struktur lain yang hadir dalam DNA ligase adalah AMP dan lisin,
yang keduanya penting dalam proses ligasi karena mereka menciptakan enzim menengah.

7. Aplikasi dalam penelitian biologi molekuler

Ligases DNA telah menjadi alat yang sangat diperlukan dalam penelitian biologi
modern molekuler untuk menghasilkan rekombinan urutan DNA. Sebagai contoh, ligases
DNA digunakan dengan enzim restriksi untuk memasukkan fragmen DNA, sering gen , ke
plasmid .          
Salah satu aspek penting untuk melakukan eksperimen yang melibatkan rekombinasi
efisien ligasi fragmen kohesif-berakhir adalah mengontrol suhu yang optimal. Percobaan
Kebanyakan menggunakan DNA ligase T4 (terisolasi dari bakteriofag T4 ), yang paling aktif
pada 25 ° C. Namun, untuk efisiensi optimal dengan ligasi kohesif-berakhir fragmen
("berakhir lengket"), suhu yang optimal enzim perlu diimbangi dengan suhu leleh T m (juga
suhu anil ) lengket ujung yang diligasi. Jika suhu lingkungan melebihi T m, pasangan
homolog dari ujung lengket tidak akan stabil karena suhu yang tinggi mengganggu ikatan
hidrogen .Ligasi reaksi yang paling efisien ketika ujung lengket sudah stabil anil, gangguan
berakhir anil karena itu akan hasil dalam efisiensi ligasi rendah. Semakin pendek overhang ,
semakin rendah m T, biasanya overhang 4-dasar memiliki m T 12-16 ° C.
Sejak berujung tumpul fragmen DNA tidak memiliki ujung-ujung kohesif untuk anil,
suhu leleh bukan merupakan faktor untuk mempertimbangkan dalam kisaran suhu normal
dari reaksi ligasi. Namun, semakin tinggi suhu, semakin sedikit kesempatan bahwa akhir
yang akan bergabung akan disesuaikan untuk memungkinkan ligasi (molekul bergerak di

10
sekitar solusi yang lebih pada suhu tinggi). Faktor pembatas dalam ligasi ujung tumpul
bukanlah aktivitas ligase melainkan jumlah keberpihakan antara tujuan fragmen DNA yang
terjadi. Suhu ligasi paling efisien untuk DNA berujung tumpul karena itu akan menjadi suhu
di mana jumlah terbesar dari keberpihakan dapat terjadi. Oleh karena itu, mayoritas berujung
tumpul ligations dilakukan pada 14-16 ° C semalam. Tidak adanya berakhir anil stabil juga
berarti bahwa efisiensi ligasi diturunkan, membutuhkan konsentrasi yang lebih tinggi ligase
untuk digunakan (DNA ligase T4 adalah komersial tersedia hanya DNA ligase untuk anil
ujung-ujung tumpul).
DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester
antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick.Nick pada DNA
dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan. Secara biologis, DNA
ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi,
menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses
reparasi DNA.Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan
obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase.Dengan diinhibisinya DNA ligase,
diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akan mati. DNA ligase merupakan enzim
yang sangat berguna baik di dalam sel, maupun di luar sel.Untuk penggunaan di luar sel,
penggabungan dengan enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi
DNA rekombinan.Enzim restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita untuk
memotong DNA di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang
menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional.
E3 ligase
Modifikasi protein ubiquitin substrat dicapai oleh aktivitas mengaktifkan E1, E2 dan
enzim ligase konjugasi E3. Protein substrat dapat dimodifikasi dengan satu (mono-
ubiquitination) atau banyak (poli-ubiquitination) molekul ubiquitin, dan masing-masing jenis
modifikasi memiliki peraturan yang berbeda nasib. Kedua komponen DNA dalam reaksi
ligasi harus molar yang sama dan di sekitar 100μg/ml. Paling sering, seseorang ingin Ligate
suatu molekul DNA masukkan ke dalam plasmid, siap untuk transformasi bakteri . Biasanya,
vektor plasmid DNA dan secara individu dipotong untuk menghasilkan ujung komplementer,
kemudian keduanya ditambahkan ke reaksi ligasi yang akan circularised oleh DNA ligase.
Jika tulang punggung plasmid untuk menyisipkan DNA rasio terlalu tinggi maka kelebihan
'kosong' mono dan plasmid polimer akan dihasilkan. Jika rasio yang terlalu rendah maka
hasilnya mungkin kelebihan homo dan linear dan melingkar heteropolymers.

11
 8. Aplikasi
                 DNA ligase T4 terutama digunakan untuk bergabung dengan molekul DNA
dengan Termini kohesif yang kompatibel, atau tumpul berakhir ganda DNA beruntai satu
sama lain atau untuk linker sintetis. Meskipun reaksi yang melibatkan DNA berakhir tumpul
jauh lebih lambat, laju ligasi dapat dipercepat oleh samping akan dari 150-200 mM NaCl
konsentrasi dan rendah PEG. Sejak 5 '- fosfat adalah penting untuk reaksi ligase, DNA yang
tidak memiliki 5' fosfat Termini harus terfosforilasi sebelum ligasi. Fosforilasi dicapai
dengan menggunakan kinase polinukleotida T4 dan ATP. Yang bergabung dengan fragmen
DNA dengan menonjol 5 'Termini yang tidak kompatibel (misalnya, pembatasan pencernaan
DNA dengan Xba I dan III Hind) dapat dicapai dengan mengisi parsial dari 3 tersembunyi'
Termini dalam reaksi dikontrol dengan menggunakan fragmen Klenow E . coli DNA
polimerase I.

Suatu contoh percobaan Ligasi (Menggunakan T4 DNA ligase)

Tujuan: Untuk melakukan reksi ligasi DNA ligase T4
Pendahuluan:
                 Strategi dasar dalam kloning molekuler adalah untuk menyisipkan fragmen DNA
yang diinginkan (segmen DNA) ke dalam molekul DNA (disebut vektor) yang mampu
replikasi independen dalam sel inang. Hasilnya adalah molekul rekombinan yang terdiri dari
memasukkan DNA terkait dengan urutan DNA vektor. Konstruksi molekul-molekul DNA
rekombinan tergantung pada kemampuan untuk kovalen segel nick beruntai tunggal dalam
DNA. Proses ini dilakukan baik secara in vivo dan in vitro oleh enzim DNA ligase.
                 Fragmen DNA yang digunakan untuk membuat molekul rekombinan biasanya
dihasilkan oleh pencernaan dengan enzim restriksi endonuklease. Banyak dari pengakuan
mereka membelah enzim urutan di situs terhuyung-huyung, meninggalkan menggantung atau
kohesif beruntai tunggal ekor yang dapat berhubungan satu sama lain dengan pasangan basa
komplementer. Hubungan antara ujung pelengkap seperti pasangan dapat dibentuk secara
permanen dengan pengobatan dengan DNA ligase. Jadi, dua fragmen DNA yang berbeda
(misalnya, memasukkan DNA manusia dan DNA vektor λ) disiapkan oleh pencernaan
dengan endonuklease restriksi yang sama dapat segera bergabung untuk menciptakan sebuah
molekul DNA rekombinan.

Prinsip:

12
                 Ligasi DNA adalah tindakan bergabung bersama untai DNA dengan ikatan
kovalen dengan tujuan membuat DNA plasmid baru atau layak. Saat ini ada tiga metode
untuk bergabung dengan fragmen DNA in vitro. Yang pertama adalah DNA ligase bahwa
kovalen bergabung dengan ujung-ujung kohesif anil diproduksi oleh enzim restriksi tertentu.
Yang kedua tergantung pada kemampuan DNA ligase T4 dari fag terinfeksi E. coli untuk
mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara fragmen lengket atau berujung tumpul.
Ketiga memanfaatkan terminal untuk mensintesis enzim deoxynucleotidyltransferase
homopolymeric beruntai tunggal 3 'ekor pada ujung fragmen. Yang paling umum digunakan
adalah metode DNA ligase T4.
E. coli dan fag T4 mengkodekan enzim, DNA ligase, yang beruntai tunggal segel torehan
antara nukleotida yang berdekatan dalam rantai DNA dupleks. Meskipun reaksi dikatalisis
oleh enzim E. coli dan T4 yang terinfeksi E. coli sangat mirip, mereka berbeda dalam
persyaratan kofaktor mereka. Enzim T4 membutuhkan ATP, sedangkan enzim E. coli
memerlukan NAD +. Dalam setiap kasus kofaktor dibagi dan membentuk kompleks enzim-
AMP. Kompleks ini mengikat ke nick, yang harus mengekspos 'fosfat dan 3' suatu 5 gugus
OH, dan membuat ikatan kovalen dalam rantai fosfodiester.
                 Fragmen DNA dengan baik ujung lengket atau berakhir tumpul dapat disisipkan ke
dalam DNA vektor dengan bantuan ligases DNA. Selama replikasi DNA normal, DNA ligase
mengkatalisis end-to-akhir bergabung (ligasi) dari fragmen pendek DNA, yang disebut
fragmen Okazaki. Untuk tujuan kloning DNA, DNA ligase dimurnikan digunakan untuk
kovalen bergabung dengan ujung fragmen DNA restriksi dan vektor yang telah berakhir
saling melengkapi. DNA vektor dan fragmen restriksi kovalen diikat bersama melalui ikatan
fosfodiester 3 standar '→ 5' DNA. Ketika Termini diciptakan oleh endonuklease restriksi
yang menciptakan asosiasi kohesif berakhir, sendi memiliki sebuah torehan beberapa
pasangan basa terpisah dalam untaian berlawanan. DNA ligase kemudian dapat memperbaiki
torehan tersebut untuk membentuk dupleks utuh.
                 DNA ligase T4 bakteriofag adalah polipeptida tunggal dengan 68.000 MW dari
Dalton membutuhkan ATP sebagai sumber energi. Kisaran pH aktivitas maksimal 7,5-8,0.
Enzim pameran 40% dari aktivitasnya pada pH 6,9 dan 65% pada pH 8,3. Kehadiran Mg + +
ion diperlukan dan konsentrasi optimal adalah 10mm. DNA ligase T4 memiliki kemampuan
unik untuk bergabung fragmen berakhir lengket dan tumpul. Ligasi ujung kohesif dilakukan
pada 12 ° C sampai 16 ° C untuk menjaga keseimbangan yang baik antara anil berakhir dan
aktivitas enzim. Jika reaksi diatur pada suhu tinggi anil berakhir menjadi sulit, sementara
suhu yang lebih rendah mengurangi aktivitas ligase. Semua T4 DNA ligase dilemahkan

13
dengan pemanasan pada 65 ° C selama 10 menit. Selain ligating ujung lengket pelengkap,
ligase T4 dapat Ligate setiap dua ujung tumpul DNA. Kurangnya Termini kohesif membuat
ligasi ujung tumpul lebih kompleks dan secara signifikan lebih lambat. Sejak anil berakhir
bukanlah faktor, reaksi dilakukan pada 24 ˚ C. Namun, 10 - 100 kali lebih enzim yang
dibutuhkan untuk mencapai efisiensi ligasi sama seperti yang dari ligasi ujung kohesif. Enzim
juga telah ditunjukkan untuk mengkatalisis RNA bergabung ke salah satu untai DNA atau
RNA dalam sebuah molekul duplex tetapi tidak akan bergabung dengan asam nukleat
beruntai tunggal.

Aplikasi:
1. Ligasi fragmen DNA kohesif atau berujung tumpul untuk kloning
2. Sealing torehan dalam DNA beruntai ganda
3. Ligasi linker sintetis untuk DNA berujung tumpul

Tiga komponen utama dari reaksi ligasi adalah:

1) Dua atau lebih fragmen DNA yang telah berakhir kompatibel
2) Sebuah buffer yang memiliki 0,25-1mm ATP untuk memberikan energi yang diperlukan
untuk reaksi
3) Para ligase T4 DNA
                 Kedua komponen DNA dalam reaksi ligasi (vektor dan masukkan) harus molar
yang sama dan di sekitar 100μg/ml. Paling sering, seseorang ingin Ligate suatu molekul
DNA masukkan ke dalam plasmid, siap untuk transformasi bakteri. Biasanya, vektor plasmid
DNA dan secara individu dipotong untuk menghasilkan ujung komplementer, kemudian
keduanya ditambahkan ke reaksi ligasi yang akan circularised oleh DNA ligase. Jika tulang
punggung plasmid untuk menyisipkan DNA rasio terlalu tinggi maka kelebihan 'kosong'
mono dan plasmid polimer akan dihasilkan. Jika rasio yang terlalu rendah maka hasilnya
mungkin kelebihan rasio homo dan heteropolymers.The linier dan melingkar ideal untuk
memasukkan ligating ke vektor untuk rentang akhir ligations lengket 1:01-3:01, di mana
seperti untuk ligations berakhir tumpul , memasukkan rasio vektor harus setidaknya 10:1.

14
 PENUTUP

Kesimpulan
Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa
yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia
organic.Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul
lain yang disebut produk..
Tiap-tiap enzim memiliki empat digit nomor urut sesuai dengan ketentuan klasifikasi
yang berlaku. Nomor pertama untuk klasifikasi teratas enzim didasarkan pada ketentuan
berikut:
1.   EC 1 Oksidoreduktase : mengatalisis reaksi oksidasi/reduksi
2.   EC 2 Transferase                  : mentransfer gugus fungsi
3.   EC 3 Hidrolase          : mengatalisis hidrolisis berbagai ikatan
4.   EC 4 Liase                        : memutuskan berbagai ikatan kimia selain melalui
hidrolisis dan oksidasi
5.   EC 5 Isomerase                    : mengatalisis isomerisasi sebuah molekul tunggal
6.   EC 6 Ligase                        : menggabungkan dua molekul dengan ikatan kovalen

Ligase merupakan proses memasukkan sekuens DNA yang mengandung gen yang
diinginkan ke dalam DNA genom. Proses ligasi ini dapat dilihat ketika proses transformasi.
Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan
penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan.

DNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaitu
 NAD+
DNA ligase NAD+-dependent ditemukan hanya di bakteri
 ATP
 DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria, archaea, dan virus.

15
 DAFTAR PUSTAKA

Ligase, diakses pada 25 Oktober 2021, http://translate.google.co.id/translate?

hl=id&sl=en&u=http://openwetware.org/wiki/DNA_Ligation&ei=sXHbTpmzL8LtrQe2w
e3UDQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=10&ved=0CHcQ7gEwCQ&prev=/searc
h%3Fq%3Dligase%26hl%3Did%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd%3Dimvns
Wikipedia, ligase, diakses pada 25 Oktober 2021, http://id.wikipedia.org/wiki/Ligase
books, genetic bio, diakses pada 25 Oktober 2021, http://translate.google.co.id/translate?
hl=id&sl=en&u=http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/bio
ligase, diakses pada 25 Oktober 2021, http://translate.google.co.id/translate?
hl=id&sl=en&u=http://www.answers.com/topic/ligase&ei=sXHbTpmzL8LtrQe2we3UD
Q&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=6&ved=0CFAQ7gEwBQ&prev=/search
%3Fq%3Dligase%26hl%3Did%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd%3Dimvns
Wikipedia, Ligase, diakses pada 25 Oktober 2021, http://translate.google.co.id/translate?
hl=id&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_ligase&ei=aXjbTsrXHoezrAeC3JVn
&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=3&ved=0CC0Q7gEwAjgK&prev=/search
%3Fq%3Dligase%26start%3D10%26hl%3Did%26sa%3DN%26biw%3D1024%26bih
%3D364%26prmd%3Dimvns
unl.edu, biochemical, diakses pada 25 Oktober 2021,
http://translate.google.co.id/translate?
hl=id&sl=en&u=http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869N/CHEM869NLinks/www.worthi
ngton-
biochem.com/manual/D/DNAT4L.html&ei=donbTqOQJYa3rAempaHwAQ&sa=X&oi=t
ranslate&ct=result&resnum=3&ved=0CC4Q7gEwAjge&prev=/search%3Fq%3DLigase
%26start%3D30%26hl%3Did%26sa%3DN%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd
%3Dimvns
vlab, substrat diakses pada 25 Oktober 2021, http://translate.google.co.id/translate?
hl=id&sl=en&u=http://amrita.vlab.co.in/%3Fsub%3D3%26brch%3D186%26sim

16
 %3D781%26cnt
%3D1&ei=donbTqOQJYa3rAempaHwAQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=6&v
ed=0CEwQ7gEwBTge&prev=/search%3Fq%3DLigase%26start%3D30%26hl%3Did
%26sa%3DN%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd%3Dimvns
wordpress, ligase, diakses pada 25 Oktober 2021,
http://puspalarasati.wordpress.com/2011/06/09/ligasi/
wikipedia, DNA ligase, diakses pada 25 Oktober 2021,
dikhttp://id.wikipedia.7val.com/wiki/DNA_ligase

17