Kromatografi Lapis Tipis

a. Pengertian
Kromatografi Lapis Tipis atau KLT adalah jenis kromatografi cair-padat di mana
fase geraknya adalah cairan dan fase diamnya berupa pelat dengan lapisan bahan adsorben.
Kromatografi lapis tipis adalah metode analisis yang digunakan untuk memisahkan suatu
campuran senyawa secara cepat dan sederhana.
b. Prinsip
Prinsip kerja KLT yaitu memisahkan sampel berdasarkan sifar polar antara dengan
pelarut yang digunakan. Pada KLT, secara umum senyawa-senyawa yang memiliki
kepolaran rendah akan terelusi lebih cepat daripada senyawa-senyawa polar karena senyawa
polar tersebut yang terikat lebih kuat pada fase diam yang pada dasarnya memiliki afinitas
yang kuat terhadap senyawa polar (Santiago & Strobel, 2013). Zat yang tertarik kuat pada
sorben akan bergerak lebih lambat karena mereka menghabiskan lebih banyak waktu di
sorben atau fase diam, dan mereka yang bergerak lebih cepat kurang tertarik pada fase diam,
lebih larut dalam fase gerak, dan menghabiskan lebih banyak waktu di sana (Kovar, K. A.,
& Morlock, 1996).
c. Penggunaan
Penggunaan KLT digunakan untuk tujuan sebagai berikut.
1) Untuk memeriksa komposisi campuran secara cepat.
2) Untuk menentukan kondisi percobaan kromatografi kolom.
3) Untuk mengetahui kesempurnaan suatu reaksi.
4) Untuk mengidentifikasi obat, ekstrak tanaman, preparat biokimia.
5) Untuk mendeteksi kontaminan, pemalsuan, dan lain-lain (Harmita, 2019).
d. Klasifikasi
KLT dapat diklasifikasikan berdasarkan mekanisme pemisahannya diantaranya yaitu
kromatografi adsorpsi (penyerapan fisik zat terlarut ke partikel sorben), kromatografi partisi
(pelarutan zat terlarut menjadi cairan stasioner pada sorben), kromatografi penukar ion (tarik
ion ke kelompok muatan yang berlawanan pada sorben), dan kromatografi afinitas/filtrasi
gel (retensi atau penolakan berdasarkan ukuran atau bentuk). Paling sering, KLT melibatkan
adsorpsi dan partisi karena keduanya melibatkan jenis gaya yang sama, induksi dipol-dipol
dan ikatan hidrogen. Selain itu, pemisahan yang sebenarnya dapat melibatkan semua
mekanisme ini. Namun, KLT adsorpsi paling sensitif terhadap perbedaan konfigurasi yang
mempengaruhi energi bebas penyerapan sehingga sangat berguna untuk memisahkan
 senyawa berdasarkan perbedaan polaritas. Sebaliknya, pemisahan berbasis partisi dapat
membedakan senyawa berdasarkan kelarutannya (Fried dan Sherma, 1999).
e. Jenis
1) KLT Fase Normal
Dalam KLT fase normal, sorben bersifat polar, sehingga zat terlarut yang lebih polar
bergerak lebih lambat, sedangkan zat terlarut nonpolar akan bergerak lebih cepat. Dengan
meningkatkan polaritas fase gerak, zat terlarut polar dapat ditarik lebih jauh dari titik asal
untuk meningkatkan pemisahan.
2) KLT fase terbalik (RP-TLC)
Sebuah sorben nonpolar akan mengikat zat terlarut nonpolar lebih baik dan mereka akan
bermigrasi ke piring perlahan, dan komponen polar akan bergerak cepat di dekat bagian
depan pelarut. Untuk meningkatkan jarak yang ditempuh oleh zona nonpolar, polaritas
pelarut yang berkembang harus dikurangi (Santiago & Strobel, 2013).
f. Peralatan
Peralatan yang digunakan untuk kromatografi lapis tipis (KLT)cukup sederhana
(Gambar), yaitu:
1) Lempeng kromatografi
Lempeng terbuat dari aluminium atau kaca dengan ukuran umumnya 20 x 20 cm, tebal
lapian 0,10-0.25 mg. Pada uji pendahuluan, lempeng demgan ukuran lebih kecil dapat
digunakan. Untuk tujuan preparatif, lempeng yang digunakan memiliki ketebalan lapisan
hingga 1 mm.
2) Rak penyimpanan
Rak digunakan untuk melerakkan lempeng apabila perlu pemanasan untuk mengaktifkan
fase diam.
3) Bejana kromatografi
Bejana digunakan untuk meletakkan lempeng pada posisi tegak, bagian bawahnya datar,
tempat sejumlah fase pengembang, sedangkan bagian atas dapat dinutup dengan rapat.
Ukuran bejana dapat disesuaikan dengan ukuran lempeng yang digunakan. Penjemuhan
bejana dilakukan dengan meletakkan kertas saring pada salah sanu dinding bejana, dan
bagian kerta harus selalu tercelup dalam fase gerak. Penjenuhan bejana diperlukan untuk
mempenoleh pemisahan yang baik
4) Pipet mikro (micro syringe)
Pipet digunakan untuk menotolkan larutan bahan uji dan/atau larutan pembanding dalam
jumlah yang dikehendaki, cnntohnya 10, 20 ul.
 5) Alat penyemprot pereaksi atau larutan deteksi.
Alai ini umumnya terbuat dari kaca dan digunakan untuk menyemprotkan pereaksi ke
lempeng. Larutan yang keluar dalam bentuk butir-butir halus.
6) Lampu ultraviolet
Lampu digunakan untuk melakukan pengamatan lempeng pada panjang gelombang 254
nm dan 366 nm (Hanani, 2014).

Gambar 1. Lempeng lapis tipis dalam bejana KLT jenuh dengan partikel uap fase gerak.
(A) lempeng lapis tipis; (B) kertas saring: (C) fase gerak.

g. Metode
Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisikokimia yang didasarkan
atas penyerapan, partisi (pembagian), atau gabungannya. Lapisan pemisah tipis yang terdiri
atas butir penyerap atau penyangga dilapiskan pada lempeng kaca, logam, dan lain-lain.
Untuk mendapatkan kondisi jenuh dalam bejana kromatografi, dinding bejana dilapisi
dengan lembaran kertas saring, fase gerak dituang ke dalam bejana schingga kertas saring
basah dan dalam bejana terdapat fase gerak setinggi 5-10 mm. Bejana ditutup dan dibiarkan
selama satu jam pada 20°-25°.
Sebelum digunakan, lapisan tipis pada tepi vertikal lempeng selebar kira-kira 5 mm
dihilangkan. Larutan yang diperiksa ditotolkan dalam bentuk bercak bundar dengan garis
tengah 2-6 mm atau dalam bentuk pita 20 mm x 2-6 mm (kecuali disebutkan lain). Larutan
ditotolkan pada garis sejajar dengan tepi bawah, yaitu 20 mm dari tepi bawah, tidak kurang
dari 20 mm dari tepi samping, jarak antarbercak tidak kurang dari 1,5 cm. Jarak rambat dari
garis awal adalah 15 cm atau jarak lain yang disebutkan dalam monografi, dan pada jarak
tersebut diberi tanda.
Lempeng dimasukkan ke dalam bejana kromatografi dengan posisi setegak mungkin
dan bercak terletak di atas permukaan fase gerak. Bejana ditutup dan dibiarkan pada suhu
20°-25°, kecuali disebutkan lain dalam monografi, sampai fase gerak naik mencapai tanda
batas atas. Lempeng diangkat, dikeringkan, dan ditampakkan seperti yang disebutkan dalam
monografi.
 Hal penting yang harus diperhatikan pada teknik penyemprotan adalah larutan
penampak bercak harus tersebar dalam bentuk kabut yang halus dan merata (Harmita, 2019).
h. Kelebihan
Dibandingkan dengan kromatografi kertas, keunggulan khusus Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) yaitu:
1) Keserbagunaan,
2) Cepat dan
3) Sensitif (Ingle et al., 2017).
Kromatografi Kertas.
a. Pengertian
Kromatografi kertas adalah metode pemisahan dengan kerja dua fase yaitu fase diam
dan fase gerak yang hasil kerja kedua fase ini berupa rambatan warna yang dapat terlihat
pada kertas kromatografi dan bercak yang ada untuk membandingkan antara totolan dari
sampel dan totolan dari baku. Fasa diam kromatografi berupa air yang terikat pada selulosa
kertas sedangkan fasa geraknya berupa pelarut organik non polar. Kromatografi kertas
merupakan contoh kromatografi partisi dalam bentuk planar yang sudah sangat
konvensional.
b. Prinsip
Prinsip pemisahan pada kromatografi kertas adalah distribusi atau partisi senyawa-
senyawa diantara dua cairan yang tidak saling campur. Partisi suatu senyawa terjadi antara
kompleks selulosa-air (pada kertas) dan fasa gerak yang melewatinya.
c. Penggunaan
Kromatografi kertas dapat digunakan dalam pemisahan senyawa organik (misalnya,
untuk uji kemurnian obat, makanan, dan kosmetik; deteksi kontaminan makanan dan
minuman; dan deteksi obat dan metabolit obat pada manusia) dan analisis biokimia apabila
jumlah sampel sangat terbatas (Harmita, 2019).
d. Alat
Peralatan yang digunakan pada kromatografi kertas:
1) Kertas kromatografi
Kertas saring yang memiliki ketebalan dengan ukuran tertentu.
2) Bejana kromatografi
Bejana kromatografi terbuat dari kaca, tertutup rapat, kedap uap, memiliki lubang yang
dimaksudkan untuk memasukkan cairan pelarut atau fase gerak atau mengurangi tekanan
dalam bejana. Bejana dapat berbentuk silender atau kotak.
 3) Bak pelarut
Bejana ini terbuat dari kaca dengan ukuran sedikit lebih pendek daripada ukuran bejana
dan lebih panjang daripada ukuran kertas yang digunakan. Bak pelarut dapat diisi
dengan sejumlah volume fase gerak. Posisi bak pelarut di bawah apabila merupakan
kromatografi kertas menaik (ascending chromatography) atau berada di atas untuk
kromatografi menurun (descending chromatography).
4) Rak kaca
Rak ini memiliki tinggi sedikit lebih pendek (lebih kurang 5 cm) daripada tinggi bejana.
Rak kaca digunakan sebagai penyangga bak pelarut dan terdapat batang kaca antisifon
untuk menahan kertas kromatografi pada kromatografi menurun.
5) Batang kaca antisifon
Alat ini disangga oleh rak kaca, terletak sedikit lebih tinggi dan berada di luar sejajar
dengan tepi bak fase gerak.
6) Rak pengering
Rak ini digunakan untuk meletakkan kertas kromatografi setelah dielusi, agar tidak
terkontaminasi dan kotor (Hanani, 2014).
e. Metode Pemisahan
1) Kromatografi Kertas Menurun

Gambar 2. Kromatografi kertas menurun

Pada kromatografi kertas menurun (descending chromatography), bejana dilengkapi

dengan lubang untuk memasukkan pelarut, bak pelarut, dan batang penahan kertas.
Meskipun desain bejana lebih rumit dari metode lain, cara ini lebih cepat karena pelarut
mengalir dari atas ke bawah. Selain itu, bila harga Rf tidak diperlukan dan tujuan penetapan
adalah pemisahan komponen-komponen yang sukar terpisah, pelarut dapat dibiarkan
mengalir hingga menetes dari ujung kertas sampai diperoleh pemisahan yang dikehendaki.

2) Kromatografi Kertas Menaik

Kromatografi kertas menaik (ascending chromatography) menggunakan bejana yang

lebih sederhana, bahkan dapat menggunakan tabung reaksi atau gelas ukur. Metode ini
untuk melakukan penelitian yang cepat untuk menentukan sistem pelarut yang cocok.
Metode ini sederhana dan umum dikerjakan. Kertas yang telah ditotoli sampel dicelupkan ke
dalam pelarut dalam bejana sedemikian rupa schingga totolan sampel tidak terendam.
Pelarut merambat ke atas melalui totolan sampel oleh daya kapiler. Laju perambatan pelan,
namun perambatan yang pelan ini memperbesar kemungkinan mencapai keadaan
keseimbangan dan sering menghasilkan bercak-bercak yang jelas.

Gambar 3. Kromatografi kertas menaik

3) Kromatografi Dua Dimensi

Penyempurnaan pemisahan kromatografi mendatar (plane chromatography) dapat

dilakukan dengan eluasi berturut-turut dalam dua arah yang tegak lurus, yaitu kromatografi
dua dimensi (two-dimensional chromatography). Eluasi dapat dilakukan dengan teknik
menaik atau menurun hingga bercak yang paling cepat bergerak mendekati tepian kertas.
Selanjutnya, kertas diangkat, dikeringkan, diputar 90o, lalu dilakukan eluasi kedua dengan
sistem pelarut yang berbeda. Dengan cara ini, komponen-komponen yang tidak terpisah
dengan sempurna oleh sistem pelarut yang satu dapat menjadi sempurna bila digunakan
kombinasi dari sistem pelarut tersebut, hal ini diperlihatkan pada gambar 4.
 Gambar 4. Kromatografi Dua Dimensi

4) Kromatografi Melingkar

Teknik kromatografi melingkar (circular chromatography) dapat dilakukan untuk

pemisahan campuran dengan cepat. Cawan petri tertutup dapat digunakan untuk wadah
pelarut. Kertas yang digunakan berbentuk lingkaran yang pada pusatnya diberi sumbu untuk
mengalirkan pelarut. Sampel ditotolkan di sekitar pusat kertas, kemudian kertas diletakkan
horizontal sehingga sumbu tercelup dalam pelarut. Karena kerja kapiler, pelarut bergerak ke
arah tepi kertas sambil membawa komponen-komponen campuran. Bercak-bercak yang
terjadi berupa garis lengkung dengan diameter makin panjang bila bercak makin ke tepi
(Harmita, 2019).

Gambar 5. Kromatografi Melingkar

f. Kelebihan dan Kekurangan

Kelebihan kromatografi kertas antara lain sederhana, cepat, murah, tidak perlu terus
menerus ditunggu dan cocok untuk mikrosampel dan pemisahan campuran yang memiliki
struktur yang sama. Akan tetapi, pereaksi penyemprot yang korosif tidak dapat digunakan
sehingga jumlah sampel yang kecil sering kali sukar dideteksi (Harmita, 2019)
Dapus

Hanani, E. (2014). Analisis Fitokimia. Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

Harmita. (2019). Analisis Fisikokimia Kromatografi (Analisis F). Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

Ingle, K. P., Deshmukh, A. G., Padole, D. A., Dudhare, M. S., Moharil, M. P., & Khelurkar, V. C.
(2017). Phytochemicals: Extraction methods, identification and detection of bioactive
compounds from plant extracts. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 6(1), 32–36.

Kovar, K. A., & Morlock, G. E. (1996). Detection, Identification, and Documentation.

Chromatographic Science Series, 71, 205-240.

Santiago, M., & Strobel, S. (2013). Thin layer chromatography. In Methods in Enzymology (1st ed.,
Vol. 533). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-420067-8.00024-6