KLT Densitometer
KLT Densitometer
DENSITOMETER
IKA BUANA J, M.Sc., Apt.
PRODI FARMASI
UNISSULA
SASARAN BELAJAR
Memahami prinsip kerja dan jenis-jenis
kromatografi
Memahami faktor-faktor yang mempengaruhi
pemisahan yang baik dalam kromatografi
Memahami penggunaan kromatografi untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif
Memahami prinsip, jenis fase diam dan fase
gerak yang digunakan dalam KLT
Memahami prinsip kerja serta kelebihan dan
kekurangan KLT densitometri
Memahami penggunaan KLT-Densitometri
untuk analisis
TL
C-
201
3 2
TLC
TLC
merupakan teknik kromatografi
paling kuno
tetap populer
dengan prinsip:
TLC
merupakan teknik kromatografi
paling kuno
tetap populer
Plate TLC
TL
C-
201
11 2
Proses Scanning
Scan Kuantitatif
Scan Kualitatif
TL
C-
201
12 2
Bagaimana menotolkan sampel
secara manual ?
Sampel ditotolkan dalam jumlah sekecil
mungkin, paling kecil 0,5 µL (masih bisa
reprodusibel) dari larutan yang pekat
TL
C-
201
16 2
Prewashing Old layer
TL
C-
201
17 2
TL
C-
201
18 2
Mana yg lebih baik ?
TL
C-
201
19 2
TL
C-
201
20 2
Pita atau Spot
TL
C-
201
21 2
Keuntungan penggunaan pita
TL
C-
201
22 2
Tailing
Apa penyebabnya
Bagaimana mengatasinya
???
TL
C-
201
23 2
Tips pengatasan
TL
C-
201
24 2
TL
C-
201
25 2
Thin-Layer
Chromatography
Apa yang dimaksud :
TL
C-
201
29 2
Organics Fluorescence Indicators
( F366 ; UV366 )
Natrium 3 – hidroksipiren – 5,8,10 – trisulfonat
Natrium 3,5 – dihidroksipiren – 8,10 – disulfonat
Natrium fluorescein ; fluorescein atau 2’,7’ –
diklorofluorescein
Rhodamin, Rhodamin 6 G
Morin
Zat warna Cyanin
Derivat stilben (misal: diaminostilbentriazin)
Pencegah optik (ultraphor WT BASF)
Calcofluor R – white, Leukophor
TL
C-
201
30
(Jork dkk., 1990)
2
Inorganic Phosphorescence Indicators [
Kode : UV254] ]
TL
C-
201
33 2
Lipophilic Silica gel
TL
C-
201
34 2
TL
C-
201
35 2
Sistem TLC
Bagaimana
Mekanisme Pemisahan
???
Mekanisme pemisahan
TL
C-
201
41 2
Pemisahan
1. Distribusi:
dihubungkan dengan adanya fase diam
cair yg di amobilkan (immobilized).
2. Adsorpsi:
didasarkan pada interaksi analit langsung
dengan permukaan fase diam TL
C-
201
42 2
TL
C-
201
43 2
KLT DENSITOMETER
Metoda analisis instrumental berdasarkan
interaksi radiasi elektro magnetik dengan
analit yang merupakan noda pada KLT
Alat dilengkapi dengan spektrofotometer
yang mempunyai pancaran sinar dengan
panjang gelombang diatur dari 200 - 700 nm.
Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem
absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)
Teknik penggunaannya :
- Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan
(hanya untuk TLC dengan pendukung gelas),
- Sinar yang diserap dan dipantulkan
- Atau sinar yang dipendarkan.
47
47
lnteraksi radiasi elektromagnetik dengan
noda pada KLT secara :
Absorpsi
Transmisi
Pantulan (refleksi) pendar fluor
Pemadaman pendar fluor
48
48
SUMBER RADIASI
Densitometer Densitometer
Double beam Single beam
54
54
S S
Mk Mk
PM
PS
PM PM
I
I Lempeng
I
I
PM T Lempeng
(a) (b)
Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)
• Photomultiflier tersebut dapat memperbesar tenaga
beda potensial listrik sehingga mampu menggerakan
integrator.
57
Cara Kerja Pelacakan Bercak Densitometer
• Gambar
7
2 3 0,245 5b
5a 145
4
6
Gambar Densitometer Model CS-930 Shimadzu
1= pendukung Lempeng
2=Sistem optik (sinar)
3=Sumber sinar (UV/Visibel)
4= Tombol penggerak lempeng
5a= Angka kedudukan lempeng (mm)
5b= angka serapan
6= Key Board 58
7= kromatogram
CARA KERJA DENSITOMETER
B. Sistem zig-zag
Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu
Y tetapi berbelok -belok sampai garis tepi bercak
pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan
X1-X2. 60
60
• Pelacakan bercak,
a b
62
62
• Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah
dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas
area (mikro volt) yang tertera merupakan
besaran puncak. Kadang-kadang prosentase
yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari
puncak yang muncul (tergambar).
• Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak
simetris akan kurang teliti sebab konsentrasi
terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak
bercak.
• Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan
molekul senyawa untuk mengumpul ditengah
lebih banyak.
63
ANALISIS KUALITATIF
kromatis
Propil spektrogram
`
Bercak
Chamber
lempeng
67
*Chamber harus dijenuhkan dulu
selama lebih kurang 30 menit
dengan bantuan kertas saring.
68
Lempeng
69
ALAT HPTLC= HIGH PERFORMANCE
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
JALANNYA SINAR (OPTIK)
72
HASIL SCANNING SATU BERCAK
Scanning senyawa yang berbeda
Digunakan metode:
Satu persatu dgn lambda serapan maksimumnya.
Cara serentak, dgn menggunakan lambda yang
dapat dimiliki oleh semua senyawa.
Hasil Rekaman
Hasil
Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda
78
Scanning serentak beberapa puncak/bercak
79
MENGHITUNG WAKTU RETENSI
Rf = a/c (cm)
b/c (cm)
Contoh 1
Analisis golongan tetrasiklin
Fase diam = selulose F, Fase gerak = larutan MgCl2
0,25 M. (Nornendy, 1993).
85
85
• Contoh 2.
Analisis zat warna lipstik, fase diam : silika gel,
fase gerak : campuran n-isopropil etilasetat dan
amoniak 10% (65:75:60) ( Wulan dkk, 1991)
serapan maksimumnya:
ANALISIS KUANTITATIF
53
Kurva regresi linier normal
Y= 2.396 X + 1.097
89
89
Aplikasi Garis regresi
Contoh menghitung:
Misal luas puncak pada sampel 24,487 mV,
Maka harga X :
= (24,487-1,487): 0,513 = (23) 70,513 = 44,834 mcg/ ml
90
Untuk analisis kuantitatif zat warna tidak discanner
tetapi bercak disari kemudian diencerkan etanol,
sampai 5,0 ml.
91
Yang perlu Diperhatikan Dalam uji Kuantitatif
Hasil penelitian Rhodamin
a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol)
No Nama Sampel Warna Benang Wol Hasil
Uji
1 Kerupuk bunga Merah muda +
(tersanjung)
2 Kerupuk bawang Tidak merah muda -
c. Kerupuk unyil
A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela:
1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml) Luas Area (milivolt)
0,005 0,7092
0,015 0,8493
0,030 0,8582
0,060 2,8790
0,090 3,2248
0,120 4,5278