PERCOBAAN 1

WHOLE MOUNT

A. Capaian Pembelajaran

1. Praktikan dapat mengetahui prosedur pembuatan sedian preparat whole

mount
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum whole mount adalah :
1. Mengetahui bagian-bagian dari embrio ayam pada pewarnaan eosin.
2. Mengetahui bagian-bagian dari embrio ayam pada pewarnaan hematoxylin.
3. Mengetahui bagian-bagian dari embrio ayam pada pewarnaan hematoxylin eosin.

C. Tinjauan Pustaka
a. Whole mount
Metode Whole Mount merupakan metode dimana objek yang akan dibuat
sebagai preparat berada dalam keadaan utuh, yaitu tanpa sectioning. Sehingga dengan
kondisi tersebut dapat diamati struktur utuh dari suatu organisme dan tentu saja objek
akan terlihat dengan jelas ketika diamati menggunakan mikroskop. Struktur yang
dapat diamati menggunakan metode Whole Mount ini adalah struktur reproduksi
maipun struktur vegetatif pada suatu organisme (Biochem, 2008).
Metode wholemount mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-
masing. Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tubuh hewan
dengan jelas tiap bagian -bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode ini
hanya bisa dilakukan pada hewan dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa hewan
yang besar (Biochem, 2008).
b. Perkembangan Embrio pada Unggas
Perkembangan embrio ayam dimulai dari fertilisasi, blastulasi, gastrulasi,
neurolasi dan organogenesis. fertilisasi merupakan penggabungan sel kelamin jantan
dan sel kelamin betina membentuk zigot. Tahap selanjutnya adalah pembelahan
secara mitosis pada zigot. Blastula merupakan lanjutan dari stadium pembelahan
 berupa massa blastomere membentuk dasar calon tubuh ayam, pada tahap ini
terbentuk blastoselom. Gastrula adalah proses kelanjutan stadium blastula, tahap
akhir proses gastrulasi ditandai dengan terbentuknya gastroselum dan sumbu embrio
sehingga embrio mulai tumbuh memanjang Tubulasi merupakan kelanjutan dari
proses stadium gastrula. Embrio pada stadium ini disebut neurula karena pada tahap
ini terjadi neurulasi yaitu pembentukan bumbung neural. Organogensis merupakan
tahap selanjutnya yaitu perkembangan dari bentuk primitif embrio menjadi bentuk
definitif yang memiliki bentuk dan rupa yang spesifik dalam satu spesies (Murphy,
2013).
Perkembangan embrio ayam terjadi di luar tubuh induknya. Selama
berkembang, embrio memperoleh makanan dan perlindungan yang dari telur berupa
kuning telur, albumen, dan kerabang telur. Dalam perkembangannya, embrio dibantu
oleh kantung kuning telur, amnion, dan alantois. Kantung kuning 6 telur yang
dindingnya dapat menghasilkan enzim. Enzim ini mengubah isi kuning telur sehingga
mudah diserap embrio. Amnion berfungsi sebagai bantal, sedangkan alantois
berfungsi pembawa sebagai ke oksigen embrio, menyerap zat asam dari embrio,
mengambil yang sisa-sisa pencernaan yang terdapat dalam ginjal dan menyimpannya
dalam alantois, serta membantu alantois, serta membantu mencerna albumen
(Surjono, 2001).
Preparat praktikum wholemount ini menggunakan telur ayam kampung
yang sudah diinkubasi selama 48 jam. Namun, apabila waktu inkubasi kurang, maka
embrio tidak dapat terlihat dengan jelas. Wholemount digunakan untuk mengamati
perkembangan embrio ayam umur 48 jam hari. Alasan digunakannya telur berumur
48 jam hari yaitu, karena pada umur ini masih dapat dibedakan dengan jelas antara
albumen, membrane cangkang, yolk putih, yolk kuning, rongga udara, blastoderma,
dan membran viteline. Selain itu, pada umur 48 jam hari merupakan titik awal
perkembangan embrio ayam sebelum terbentuknya pembeda yang jelas antara kepala,
leher, badan dan kaki (Suryana, 2008).
c. Hematoxylin dan Eosin
Hematoksilin dan Eosin adalah metode pewarnaan yang banyak digunakan
dalam pewarnaan jaringan sehingga ia di perlukan dalam diagnosa medis dan
 penelitian. Hematoksilin adalah bahan pewarna yang sering digunakan pada
pewarnaan histoteknik, ia merupakan ekstrak dari pohon yang diberi nama logwood
tree. Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai unsur
basofilik jaringan. Hematoksilin memulas inti dan strukutur asam lainnya dari sel
(seperti bagian sitoplasma yang kaya-RNA dan matriks tulang rawan) menjadi
biru.Eosin bersifat asam. Ia akan memulas komponen asidofilik jaringan seperti
mitokondria, granula sekretoris dan kolagen. Tidak seperti hematoksilin, eosin
mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi warna merah muda (Junquera, 2007).

D. Metode Percobaan
a. Alat dan Fungsinya
1. Senter : Sebagai alat penerangan dan melihat letak embrio
2. Kompor : Sebagai alat yang bisa menghasilkan panas tinggi
3. Gunting : Sebagai alat memotong sisi kulit telur ayam
4. Baskom : Sebagai wadah untuk menyimpan atau menampung telur ayam
5. Pensil : Sebagai alat untuk memberi tanda letak embrio telur ayam
6. Mikroskop : Alat untuk mengamati embrio ayam yang sudah diwarnai
7. Optilab : Mencuplik gambar/ video secara langsung di monitor
komputer
8. Gelas Arloji : Sebagai wadah untuk menyimpan atau meletakkan benda
9. Gelas benda : Tempat wadah untuk melarutkan suatu zat atau bahan kimia
10. Cover Slip : Menjaga spesimen padat ditekan datar dan sampel cair dibentuk
menjadi lapisan datar bahkan ketebalan
11. Pipet tetes : Memindahkan cairan dengan volume kecil dan merupakan alat
ukur untuk memindahkan cairan dari wadah aslinya ke
wadah lain dalam jarak tertentu.
12. Petridish : Sebagai wadah untuk menyimpan zat dalam jumlah kecil
13. Jarum : Sebagai alat untuk menusuk telur ayam
14. Stopwatch : Alat yang digunakan untuk mengukur waktu
15. Inkubator : Untuk menginkubasi dan menjaga kestabilan suhu pada embrio
telur ayam
b. Bahan dan Fungsinya
1. Telur (usia 48 jam) : Sebagai bahan untuk media praktikum
2. Kertas Saring : Untuk memisahkan zat padat dari cairan
3. Aquadest : Sebagai pelarut saat melarutkan senyawa kimia
4. Bouin : larutan yang dapat menembus sediaan jaringan dan mampu
memfiksasi dengan baik untuk sediaan sitologi
5. Label : Sebagai penanda agar tidak tertukar atau keliru
6. NaCl 0.9 % : Sebagai larutan isotonis untuk menjaga tekanan osmotic didalam
telur agar tidak terjadinya kondisi hipertonis ataupun
hipotonis
7. Tissue : Sebagai membersihkan benda dan mengelap benda hingga kering
8. Hematoxylin : Sebagai pewarna basa dipakai ntuk mewarnai inti sel
9. Eosin : Sebagai pewarna asam dipakai untuk mewarnai sitoplasma
10. Alkohol bertingkat : Untuk memastikan air didalam sel tersebut keluar semua
sehingga dilakukan alkohol bertingkat

c. Cara Kerja
Cara kerja pada praktikum pewarnaan whole mount ini adalah :
1. Telur ayam di inkubasi dengan suhu 4°C selama 48 jam di dalam inkubator
2. Telur di teropong dengan senter untuk melihat letak embrio
3. Telur ditandai dengan pensil dan dimasukkan kedalam baskom berisi NaCl
fisiologis hangat
4. Telur ditusuk dengan jarum tepat dibagian yang telah diberi pensil sampai udara
yang ada di dalam telur keluar
5. Bagian telur yang ditandai dengan pensil ditusuk secara perlahan dan kulit telur
digunting menggunakan gunting bengkok kearah samping
6. Kulit telur diangkat menggunakan pinset dan tempat embrio berada akan terlihat
tampak jelas
7. Blastodarm ditarik secara hati-hati lalu diletakkan pada gelas arloji, cairan NaCl
fisiologi yang tersisa dibagian blastoderm dibuang menggunakan pipet tetes
8. Blastodarm dan daerah sekitar embryonal jangan sampai terlipat
9. Kertas saring diletakkan diatas blastoderm yang sudah dilubangi bagian
tengahnya
10. Embrio diusahakan berada di dalam lubang kertas saring dan jangan sampai ada
gelembung udara
11. Blastoderm difiksasi dengan larutan bouin menggunakan pipet tetes secara hati-
hati agar blastoderm tidak melekat pada gelas arjoli
12. Fiksasi dilakukan selama 60 menit
13. Embrio dicuci menggunakan alkohol 70% hingga warna kuning berkurang
Cara kerja pada praktikum pewarnaa hematoksilin ini adalah :
1. Proses dehidrasi dilakukan setelah proses pencucian dengan merendam embrio
pada larutan alkohol 60%, 50%, 40%, 30% dan larutan aquadest selama 5 menit
2. Embrio direndam dalam erlich hematoksilin selama 10 detik
3. Embrio diletakkan dalam cawan petri dan dibungkus menggunakan kasa yang
diikat menggunakan karet gelang
4. Cawan petri dicuci dengan air mengalir selama 10 menit
5. Proses dehidrasi dilakukan dengan memasukkan embrio kedalam larutan
aquadest, larutan alkohol 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, 90%, 96% dan larutan
alkohol absolut selama 5 menit
6. Proses clearing dilakukan dengan merendam embrio kedalam larutan toluol
selama 10 menit dan direndam dalam larutan xylol selama 30 menit
7. Permukaan gelas benda diolesi dengan albumin
8. Kertas saring dilepaskan dari embrio dengan hati-hati menggunakan pinset dan
jarum
9. Embrio di mounting menggunakan entelan dan ditutup menggunakan coverslip
Cara kerja pada praktikum pewarnaa eosin ini adalah :
1. Embrio diwarnai dengan eosin setelah proses pencucian selama 2 menit
2. Embrio direndam dalam larutan alkohol 70%, 80%, 90%, 96% dan larutan
alkohol absolut selama 5 menit
3. Proses clearing dilakukan dengan merendam embrio didalam larutan toluol
selama 10 menit dan direndam dalam larutan xylol selama 30 menit
4. Permukaan gelas benda diolesi dengan albumin
 5. Kertas saring dilepaskan dari embrio dengan hati-hati menggunakan pinset dan
jarum
6. Embrio di mounting menggunakan entelan dan ditutup menggunakan coverslip
Cara kerja pada praktikum pewarnaa hematoksilin & eosin ini adalah :
1. Proses dehidrasi dilakukan dengan cara merendam embrio di dalam larutan
alkohol 60%, 50%, 40%, 30% dan larutan aquadest selama 5 menit
2. Embrio direndam dalam elrich hematoksilin selama 10 detik
3. Embrio diletakkan dalam cawan petri dan dibungkus menggunakan kasa yang
diikat menggunakan karet gelang
4. Cawan petri dicuci dengan air mengalir selama 10 menit
5. Proses dehidrasi dilakukan dengan memasukkan embrio kedalam larutan
aquadest, larutan alkohol 30%, 40%, 50%, 60% 70% selama 5 menit
6. Embrio diwarnai dengan menggunakan eosin selama 2 menit
7. Embrio direndam kembali dengan alkohol secara bertingkat yaitu dari 70%, 80%,
90% dan larutan alkohol absolut selama 5 menit
8. Proses clearing dilakukan dengan merendam embrio kedalam larutan toluol
selama 10 menit dan direndam dalam larutan xylol selama 30 menit
9. Permukaan gelas benda diolesi dengan albumin
10. Kertas saring dilepaskan dari embrio dengan hati-hati menggunakan pinset dan
jarum
11. Embrio di mounting menggunakan entelan dan ditutup menggunakan coverslip

E. Hasil Pengamatan
Berilah keterangan pada gambar berikut ini!
 A

Gambar 1. Embrio ayam pewarna eosin

Keterangan :
A: lekukan kepala (chepalix flexure)
B: Lipatan lateral badan (lateral body fold)

I
A
H

B C
D E
F

Gambar 2. Embrio ayam pewarnaan Hematoxylin Eosin

Keterangan:
A. Somite G. Optic cup
B. Spinal Cord/sumsum tulang belakang H. Mesencephalon
C. Tail bud/tulang ekor I. Isthmus/kelenjar tiroid
D. Bulbus cordis/bakal jantung
E. Foregut/usus depan
F. Notocord/tulang rawan

E
A
B

C F

Gambar 3. Embrio ayam pewarnaan Hematoxylin

Keterangan:

A. Optic cup
B. Lipatan batas amninon
C. Somites
D. Primitive streak
E. Tail bud/tulang ekor

F. Pembahasan
Berdasarkan percobaan praktikum whole mount ini fungsi telur ayam di inkubasi
selama 48 adalah karena hasilnya akan menunjukkan bagian-bagian embrio yang dapat
diamati dengan jelas sehingga akan mudah untuk diamati, seperti pada gambar yang
telah dilakukan tertera diatas. Hal tersebut sesuai dengan penelitian Kusumawati et al.
(2016) yang menunjukkan inkubasi 48 jam bagian-bagian organ yang terbentuk pada
adalah embrio memperlihatkan perbedaan spesifik dibanding umur sebelumnya karna
bagian anterior memutar kearah kanan. Lubang auditorius mulai terbuka, jantuk
membentuk S, lekukan kepala amnion menutupi seluruh region telenchepalon,
denchepalon dan mesenchepalon serta plat oral, batang mata dan tuba neural yang sudah
mulai terbentuk.
 Tahapan pembentukan dan perkembangan organ pada embrio adalah pada tahap
ke-1 perkembangan embrio, stria primitif masih belum terlihat namun pelindung embrio
sudah tampak. Pada tahap ke-2, yaitu pada masa inkubasi 6-7 jam, stria primitif mulai
nampak. Pada tahap ke-3, sekitar 12-13 jam masa inkubasi, terdapat stria primitif
namun lekuk primitifnya belum nampak. Pada tahap ke-4, stria primitif memanjang
sehingga cekungan primitif, lubang primitif, dan nodus Hensen sudah dapat terlihat.
Pada tahap ke-5, sekitar 19-22 jam inkubasi, notochord terlihat di bawah nodus Hensen.
Pada tahap ini kepala embrio mulai terbentuk. Pada tahap ke-6, lipatan kepala sudah
terlihat, namun somite belum terbentuk. Perkembangan tahap ke-1 sampai ke-6.
Pasangan somite yang pertama mulai nampak pada tahap ke-7 bersamaan dengan
lipatan neural dekat dengan kepala. Pada tahap ke-8, terdapat 4 pasang somite dan
pulau-pulau darah yang muncul di bawah blastoderm. Tujuh pasang somite dan vesikula
optika terlihat pada tahap ke-9. Sepuluh pasang somite dan tiga vesikula primer otak
sudah terlihat pada tahap ke-10. Pada tahap ke-11, sekitar 40-45 jam inkubasi, lima
neuromere atau segmen dari otak yang berkembang mulai terlihat di otak belakang.
Pada tahap tersebut, neuropore mulai
menutup sedangkan vesikula optika mengerut. Pada tahap ke-12, yaitu 45-49 jam
inkubasi, enam belas pasang somite sudah terlihat dan neuropore anterior telah
menutup. Pada tahap ini kepala mulai berputar ke kiri dan vesikula optika primer
menjadi menunjukkan perbedaan. Selain itu, jantung berbentuk seperti huruf S
dan otak depan tertutup sempurna oleh lekukan kepala amnion sampai pada tahap
berikutnya (Hamburger, 1999).
Berdasarkan praktikum whole mount , fungsi peneropongan dengan senter pada
telur adalah untuk mengetahui letak embrio pada telur ayam sehingga nantinya akan
mudah untuk dieksekusi pada saat pembelahan kulit telur. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Saifullah (2017), proses penerangan embrio pada telur ayam menggunakan
senter atau sumber cahaya lainnya disebut candling, yang bertujuan bertujuan untuk
mengecek fertilitas telur ayam, apakah ayam infertile (tidak dibuahi), telur yang fertile,
embrio yang tumbuh dan embrio yang mati.
Fungsi penandaan dengan pensil, adalah apabila menggunakan bolpoin atau
spidol di khawatirkan caira tinta yang ada di dalam bopoin atau spidol tersebut meresap
 cangkang telur tersebut. Hal ini sesuai dengan pernyataan Nurlaili dkk. (2017) yaitu
cangkang telur mengandung 98% CaCO3 (kalsium karbonat) dan memiliki 10.000-
20.000 pori-pori dalam artian bersifat adsoben, sehingga dapat menyerap suatu solute
berupa zat kimia ke dalamnya. Jika yang digunakan dalam praktikum ini adalah pulpen
atau spidol maka tintanya akan terserap ke embrio dan mengganggu pengamatan.
Fungsi penggunakan kertas saring dilubangi adalah agar embrio ayam tersebut
dapat melekat ditengah tengah kertas saring dengan kondisi tidak terlipat satu sama lain
dan nanti nya akan dijadikan bahan uji coba metode whole mount. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Rahayu (2011), menyatakan bahwa bingkai kertas saring (yang sudah
dilubangi) diletakkan di atas blastoderm (embrio), kemudian vitelline membrane
digunting di sisi luar bingkai kertas, kemudian bingkai kertas saring diangkat, sehingga
embrio berada dalam lubang pada bingkai kertas saring tersebut.
Fungsi penggunaan garam fisiologis hangat pada saat pengeluaran embrio adalah
untuk menjaga supaya embrio tersebut masih tetap dalam menyesuaikan suhu tubuh saat
di dalam incubator dan menjaga kestabilan embrio dalam keadaan isotonis. Hal ini sesuai
dengan pernyataan Lestari (2014), garam fisiologis hangat berfungsimenjaga agar sel
tetap hidup dengan mencegah adanya keadaan hipertonis ataupun hipotonis karena NaCl
fisiologis bersifat isotonis yang berfungsi untuk menjaga keseimbangan larutan pada sel.
Sedangkan, suhu hangat dari garam fisiologis tersebut adalah untuk menyamakan suhu
selama embrio diinkubasi
Berdasarkan pengamatan diatas praktikum ini menggunakan metode wholemount
dimana metode ini mempunyai kelebihan dan kelemahan masing- masing. Kelebihan
metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tubuh hewan dengan jelas tiap bagian
-bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode ini hanya bisa dilakukan pada
hewan dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa hewan yang besar (Biochem, 2008).
Berdasarkan praktikum whole mount pewarnaan embrio menggunakan eosin,
hematoxylin eosin, dan hematoxylin. Pewarnaan embrio menggunakan eosin
menghasilkan warna dominan merah muda dan merah, tetapi bagian dari embrio tidak
begitu jelas. Hasil yang ditunjukkan pada gambar 1 merupakan bagian yang teramati jelas
adalah lipatan lateral badan (lateral body fold) dan lekukan kepala. Pada pewarnaan
hematoxylin eosin, seperti yang ditujukkan pada gambar 2. lebih jelas bagian-bagiannya.
 Warna yang dihasilkan adalah perpaduan merah muda dan biru (ungu). Bagian yang
teramati antara lain somite, spinal cord (tulang belakang), tail bud (tulang ekor), bulbus
cordis (bakal jantung), foregut/usus depan, notocord/tulang rawan, optic cup,
mesencephalon, dan isthmus/kelenjar tiroid. Pada gambar 3 menunjukkan hasil
pewarnaan embrio menggunakan hematoxylin saja. Warna yang dihasilkan adalah biru
tua. Bagian-bagian yang teramati cukup jelas dibandingkan dengan pewarnaan eosin saja,
namun kurang jelas jika dibandingkan dengan hematoxylin-eosin (Setiawan, 2016)
Pewarna Eosin bersifat asam berwarna merah muda saat berhasil memulas bagian
yang bersifat basa, seperti sitoplasma. Maka dari itu, inti sel ataupun bagian selain itu
tidak dapat terpulas dengan jelas. Menurut Setiawan (2016), eosin juga mewarnai
kolagen menjadi merah, sehingga didapatkan hasil dominan warna merah muda karena
pada embrio berusia 48 jam terdapat banyak kolagen yang sedang terbentuk.
Pewarna Hematoxylin adalah pewarna yang bersifat basa yang akan memulas bagian
bersifat asam, seperti halnya inti sel atau sitoplasma yang kaya akan RNA dan matriks
tulang rawan. Sehingga pada gambar 2., warna biru tersebut pekat pada inti sel (somitte).
Lebih jelasnya lagi ditunjukkan oleh gambar 3 yaitu preparat embrio dengan perwarnaan
hematoxylin-eosin. Apabila pewarna keduanya dicampur maka gambar yang dihasilkan
juga lebih jelas karena sifat asam dan basa dari masing-masing pewarna tersebut dapat
dengan sempurna memulas bagiannya masing-masing. Dapat dilihat, bagian yang
teramati lebih jelas menghasilkan warna biru pada inti sel dari hematoxylin dan
sitoplasma dari eosinnya. Seperti halnya yang dilaporkan Kusumawati et al. .(2016)
pewarna hematoxylin-eosin adalah metode pewarnaan yang banyak digunakan di
jaringan histologi dan mendapatkan hasil yang lebih jelas. Hal tersebut juga berkaitan
dengan pewarna hematoxylin itu sendiri, menurut Setiawan (2016), hematoxylin akan
bekerja lebih baik dengan warna yang dihasilkan kontras (counterstaining) apabila
bersamaan dengan pewarna lain, salah satunya adalah eosin.

G. Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum whole mount ini adalah sebagai berikut :
1. Bagian-bagian dari embrio ayam pada pewarnaan eosin adalah lekukan kepala
(chepalix flexure) dan lipatan lateral badan (lateral body fold).
 2. Bagian-bagian dari embrio ayam pada pewarnaan hematoxylin antara lain optic cup,
lipatan batas amnion, somites, primitive streak, dan tail bud atau tulang ekor.
3. Bagian-bagian dari embrio ayam pada pewarnaan hematoxylin-eosin antara lain
somite, spinal cord (sumsum tulang belakang), tail bud (tulang ekor), bulbus cordis
(bakal jantung), foregut (usus depan), noto cord (tulang rawan), optic cup,
mesencephalon, dan isthms (kelenjar tiroid).

H. Daftar Pustaka (Minimal 2 buku 3 jurnal )