Journal Reading Kepada yth:

VALIDITAS KEUNGGULAN p40 DIBANDINGKAN p63 DALAM

MEMBEDAKAN SQUAMOUS CELL CARCINOMA DAN
ADENOCARCINOMA PARU

Bahasa Asli
VALIDATION OF SUPERIORITY OF p40 OVER p63 IN DIFFERENTIATING
SQUAMOUS CELL CARCINOMA AND ADENOCARCINOMA LUNG
Oleh: V. Thamtam S. Uppin, Monalisa Hui, N. Kumar, K. Bhaskar, S. Bala, G.
Sadashivudu, G. Paramjyothi

Presentan : Dr. ARMIZA

Hari/ Tanggal : 17 Januari 2021
Waktu : 08.00-selesai
Tempat : Presentasi Online Aplikasi Zoom
Pembimbing : Dr. Yenita, M. Biomed, Sp.PA
: Dr. Sabrina Ermayanti, Sp.P(K)Onk

BAGIAN PULMONOLOGI DAN KEDOKTERAN RESPIRASI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ANDALAS /
RSUP Dr. M. DJAMIL
PADANG
2022
 DAFTAR ISI
Halaman
Daftar isi ............................................................................................................. i
Daftar Gambar.................................................................................................... ii
Daftar Tabel ....................................................................................................... iii
Abstrak ............................................................................................................... 1
Pendahuluan ...................................................................................................... 2
Bahan dan Metode.............................................................................................. 3
Morfologi dan analitik ................................................................................... 3
Imunohistokimia ............................................................................................ 3
Hasil .................................................................................................................. 4
Pemeriksaan histologi.................................................................................... 5
Imunohistoki mia........................................................................................... 7
Marka Squamous cell carcinoma .................................................................. 9
Marka adenocarcinoma................................................................................. 10
Diskusi................................................................................................................ 13
Kesimpulan ........................................................................................................ 17
 DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1 ........................................................................................................... 6
Gambar 2 ........................................................................................................... 8
Gambar 3 ........................................................................................................... 8
Gambar 4 ........................................................................................................... 11
Gambar 5 ........................................................................................................... 11
Gambar 6 ........................................................................................................... 12

ii
 DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1.............................................................................................................. 6
Tabel 2.............................................................................................................. 7
Tabel 3.............................................................................................................. 7
Tabel 4.............................................................................................................. 12
Tabel 5.............................................................................................................. 13
Tabel 6.............................................................................................................. 15

iii
 VALIDITAS KEUNGGULAN p40 DIBANDINGKAN p63 DALAM
MEMBEDAKAN SQUAMOUS CELL CARCINOMA DAN
ADENOCARCINOMA PARU

Abstrak : Kontek: Di era terapi target, membedakan berbagai subtipe Non Small cell
lung carcinoma (NSCC) sangat penting untuk pilihan pengobatan. Diagnosis
berdasarkan morfologi saja menjadi tantangan pada karsinoma yang berdiferensiasi
buruk dan core biopsy. Imunohistokimia (IHK) membantu dalam menentukan subtipe
dari NSCC. Sampai saat ini, p63 adalah marka yang paling sering digunakan dan
sensitif untuk Squamous cell carcinoma (SQCC). Namun, tidak spesifik dan dapat
positif pada adenocarcinoma (ADC). Dengan demikian, marka yang lebih andal dan
spesifik diperlukan untuk diagnosis SQCC. Objek :Tujuan dari penelitian ini adalah
untuk memvalidasi utilitas diagnostik p40 dibandingkan p63 dalam membedakan
SQCC paru dari ADC dan NSCC-non otherwise specified (NOS). Bahan dan metode
: Sebanyak 123 kasus NSCC awalnya ditinjau dan disamarkan dengan hasil IHK. Ini
diikuti oleh tinjauan slide IHK yang mencakup p63, p40, TTF-1, Napsin-A, cytokeratin
(CK) 5/6, dan CK7. Hasil : Terdapat 64 ADC, 19 SQCC, dan 40 NSCC-
NOS. Imunohistokimia membantu mengkonfirmasi diagnosis morfologi pada 62/64
ADC dan 19/19 SQCC. Imunohistokimia mengklasifikasikan kasus NSCC-NOS
menjadi NSCC yang cenderung pada ADC – 12 kasus, NSCC yang cederung pada
SQCC – 10 kasus, dan NSCC yang cenderung pada AD-SQCC – 4 kasus. Baik p63
dan p40 menunjukkan sensitivitas yang hampir sama untuk SQCC (100% dan 97%,
masing-masing), sedangkan p63 menunjukkan spesifisitas yang jauh lebih rendah bila
dibandingkan dengan p40 (51,3% vs 100%). Kesimpulan: Penelitian ini
mengkonfirmasi dan memvalidasi bahwa p40 sama sensitifnya tetapi sangat spesifik
daripada p63 dalam mendeteksi SQCC. Oleh karena itu, kami merekomendasikan
penggunaan rutin p40 daripada p63 untuk kategorisasi pasti NSCC paru.
Kata kunci : Immunohistochemistry - Lung - non small cell carcinoma - p40 - p63
Pendahuluan

Di masa lalu, satu-satunya perbedaan penting yang diperlukan adalah

membedakan antara small cell lung cancer (SCLC) dan non-SCLC (NSCC). Karena
terapi target telah berkembang untuk berbagai subtipe NSCC, ada kebutuhan yang
semakin meningkat untuk membedakan subtipe ini. Penting untuk membedakan
adenocarcinoma (ADC) dan Squamous cell carcinoma (SQCC) karena protokol
pengobatannya berbeda.
Untuk sebagian besar sampel yang diwarnai hematoxylin dan eosin (H dan E)
sudah cukup untuk menegakkan diagnosis pasti berdasarkan morfologi. Namun, pada
karsinoma yang berdiferensiasi buruk, serta terutama untuk biopsi kecil/core, timbul
kesulitan dalam membedakan subtipe NSCC secara akurat. Ada suatu keharusan untuk
biopsi kecil/core dipersiapkan untuk mendeteksi suatu mutasi agar jaringan tersebut
dapat digunakan untuk berbagai tes tambahan yang diperlukan, terutama
imunohistokimia (IHK).
Ada berbagai marka IHK yang tersedia untuk subtipe NSCC. Untuk ADC
marka yang terpenting adalah marka inti TTF-1 dan marka sitoplasma Napsin-
A. Squamous cell carcinoma memiliki marka antibodi sensitif seperti marka inti p63,
dan antibodi cytokeratin 5/6 (CK 5/6) pewarnaan sitoplasma dan membran. Antibodi
terbaru selalu membawa deteksi antibodi ke tingkat baru dengan menjadi lebih spesifik
dan/atau sensitif.
Sampai saat ini, antibodi anti-p63 adalah marka inti yang paling sering
digunakan untuk SQCC. Meskipun memiliki sensitivitas yang baik, antibodi anti-p63
tidak terlalu spesifik karena juga mewarnai NSCC lainnya. Hal ini tidak baik
digunakan, terutama dalam kasus-kasus poorly diffentiated NSCC-non otherwise
specified (NOS) karena dapat mewarnai 15% -65% dari ADC.1 Oleh karena itu,
dibutuhkan marka yang dapat diandalkan, mudah untuk menilai, dan lebih spesifik
dalam mendiagnosis SQCC.

2
 Antibodi anti-p40 sangat spesifik untuk sel skuamosa/basal. Penelitian telah
menunjukkan marka ini memiliki sensitivitas yang sama dengan p63 dan spesifisitas
yang sangat tinggi untuk SQCC, karena lebih sedikit mewarnai ADC. Sebagian besar
potensi kesalahan dalam mendiagnosis SQCC dengan p63 sebagai ADC dapat
dihindari jika menggunakan p40. Dalam penelitian ini, kami telah memvalidasi
kegunaan p40 dibandingkan dengan p63 dalam membedakan SQCC paru dari ADC
dan NSCC-NOS dalam kohort besar spesimen biopsi dan yang direseksi (RS).

Bahan dan Metode

Sebanyak 123 kasus NSCC yang didiagnosis dari sediaan core-needle biopsy
(CNB), endobronchial biopsy (EBB), dan RS paru yang dikirim untuk evaluasi
histopatologi ke departemen patologi antara Desember 2014 sampai Mei 2016
dianalisis secara prospektif. Penelitian ini telah disetujui oleh Komite Etika
Institusional. Data demografi, detail klinis, gambaran radiologis, dan pemeriksaan
laboratorium didapatkan dari rekam medis. Small cell lung cancer, karsinoid, limfoma,
neoplasma mesenkim, karsinoma metastatik, dan mesothelioma dikeluarkan dari
penelitian.
Morfologi dan analitik
Awalnya, semua kasus NSCC dikategorikan secara morfologis berdasarkan
pemeriksaan slide H dan E tanpa memperhatikan hasil pewarnaan khusus dan hasil
IHK. Selanjutnya, pewarnaan khusus dengan Alcian-periodic acid-Schiff untuk musin
ditinjau di mana pun dilakukan.

Imunohistokimia

Dalam semua kasus dimana IHK dilakukan, slide ditinjau untuk subtipe
NSCC. Dalam kasus-kasus dimana IHK tidak dilakukan, diagnosis morfologi awal
dianggap sebagai diagnosis akhir. Panel utama marka SQCC dan ADC antara lain p40,

3
p63, CK5/6, TTF-1, Napsin-A, dan CK7. Semua IHK dilakukan pada immunostainer
otomatis penuh (Xmatrx Elite; BioGenex) dengan teknik Poly horse raddish peroxide
(Poly HRP). Dari antibodi primer yang digunakan, Napsin-A dipasok oleh Biocare,
p40 oleh Pathinsitu, dan sisanya oleh BioGenex. Semuanya adalah antibodi
monoklonal kecuali p40.
Semua kasus NSCC dikategorikan berdasarkan International Association for
the Study of Lung Cancer American Thoracic Society European Respiratory Society
untuk klasifikasi biopsi kecil.2,3 Pada semua marka, intensitas pewarnaan
dipertimbangkan dan dibandingkan dengan kontrol. Untuk marka SQCC, p40 dan p63,
pewarnaan inti diterima, dan pewarnaan sitoplasma diabaikan. Untuk antibodi p40 dan
p63, intensitas pewarnaan dinilai secara semi-kuantitatif menggunakan sistem 3-
tingkat: positif lemah (Tingkat 1), positif sedang (Tingkat 2), dan positif kuat (Tingkat
3). Pola proporsi pewarnaan diberi skor pada sistem 4 tingkat: <5%; 6%–25%; 26%–
50%; dan >50%. Kasus yang menunjukkan positif 5% atau kurang dianggap
negatif. Namun, H-score tidak ditentukan.
Sensitivitas, spesifisitas, positive predictive value (PPV), dan negative
predictive value (NPV) dari kedua marka ADC dan SQCC dianalisis.

Hasil

Dari 123 pasien, hampir tiga perempat, 92/123 (74,8%) adalah laki-laki dengan
rasio laki-laki-perempuan 3:1. Usia pasien berkisar antara 18 tahun sampai 84 tahun,
dengan usia rata-rata 57,8 tahun pada laki-laki dan 51,8 tahun pada perempuan. Hampir
94,3% dari sampel yang diterima adalah biopsi kecil, dengan hanya sebagian kecil dari
kasus yang didapat dari spesimen reseksi bedah 7 (5,6%). Dari biopsi, sebagian besar
adalah CNB yang dipandu CT scan [95/123 (77,2%)], diikuti oleh EBB [20/123
(16,2%)]. Hanya ada satu biopsi yang dilakukan dengan dipandu ultrasound.

4
Pemeriksaan Histopatologi

Adenocarcinoma adalah subtipe histologis yang paling umum, terhitung lebih

dari 60% (74/123) kasus NSCC. Dari jumlah tersebut, lebih dari 80% (62/74)
didiagnosis pada slide H dan E saja dan 12 kasus (16,2%) yang membutuhkan IHK
untuk subkategorisasi. Dari total 64 kasus ADC yang didiagnosis dengan morfologi H
dan E, mayoritas (46 [71,9%]), adalah tipe asinar, diikuti oleh tipe lepidik (10 [15,6%]),
mucinous (4 [6,3%]), papiler (3 [4.7%]), dan subtipe fetal 1 (1,5%). Sebagian besar
ADC tipe asinar menunjukkan morfologi asinar murni (38 kasus) dengan sisanya
menunjukkan morfologi asinar yang dominan dalam kombinasi dengan morfologi lain
seperti pola solid (4 kasus) dan masing-masing 1 kasus pola papiler, cribriform, dan
mikropapiler fokal. Ada satu kasus yang memiliki kombinasi tambahan pola lepidik
dan mikropapiler. Dua dari empat kasus yang menunjukkan morfologi asinar dominan
dalam kombinasi dengan area solid dikategorikan sebagai adenosquamous carcinoma
(AD-SQCC) setelah IHK. Kedua kasus ini menunjukkan ekspresi marka SQCC di area
solid dan marka ADC di area asinar. Dari 10 kasus subtipe lepidik, 8 kasus memiliki
pola lepidik murni dan 2 kasus memiliki tambahan pola mikropapiler dan asinar.
Meskipun NSCC-NOS membentuk subtipe utama kedua, 40/123 (32,5%) pada
morfologi H dan E, 24 (60%) di antaranya disubtipekan lebih lanjut pada IHK. Ini
termasuk 12 kasus sebagai NSCC cenderung pada ADC, 10 kasus cenderung pada
SQCC, dan 2 kasus lainnya cenderung pada AD-SQCC. Namun, 16/123 (13%) kasus
tidak dapat disubkategorikan lebih lanjut dan dipertahankan sebagai NSCC-NOS. Dari
16 kasus ini, slide IHK tidak tersedia dalam 6 kasus dan 10 sisanya tetap tidak dapat
dikategorikan bahkan setelah panel IHK yang sesuai.
Squamous cell carcinoma menyumbang 23,6% (29/123) dari kasus NSCC
dalam penelitian ini. Dari jumlah tersebut, 19 (65,5%) didiagnosis dengan morfologi
H dan E saja, sedangkan sisanya (10 [34,5%]) memerlukan IHK untuk mendukung
diagnosis SQCC. Distribusi kasus berdasarkan subtipe histologis sebelum dan sesudah
IHK disajikan pada (Tabel 1).

5
Tabel 1: Distribusi kasus nonsmall cell lung carcinoma berdasarkan sub tipe
histologis sebelum dan sesudah imunohistokimia
Diagnosis HE sebelum IHK n Diagnosis akhir setelah IHK n
ADC 64 ADC 62
NCC cenderung pada AD-SQCC 2
SQCC 19 SQCC 19
NSCC-NOS 40 NSCC-NOS 16
NSCC cenderung pada ADC 12
NSCC cenderung pada SQCC 10
NSCC cenderung pada AD-SQCC 2
Total 123 Total 123

Imunohistokimia

Imunohistokimia dilakukan pada 110/123 (89,4%) kasus, di mana p40 dan p63
dilakukan pada 107 (86,9%) kasus. Marka IHK yang paling umum dilakukan untuk
marka ADC paru, TTF-1 dan Napsin A, dan untuk marka SQCC, p63 dan p40. Marka
ADC lainnya, CK7 dan marka SQCC, CK5/6, dilakukan pada sejumlah kecil
kasus. Hasil marka ADC dan SQCC yang dilakukan pada kasus NSCC
disajikan masing-masing pada (Tabel 2) dan (Tabel 3). Gambaran morfologi dan
imunohistokimia SQCC dan ADC digambarkan pada (Gambar 1-3).

Tabel 2: Hasil marka adenocarcinoma

Diagnosis akhir setelah IHK n TTF-1(%) Napsin A (%) CK 7(%)
ADC 62 46/50 45/49 14/14
NSCC mendukung ADC 12 11/12 9/12 2/2
Total 74 57/62 54/61(88,5%) 16/16 (100)
(91,9)
SQCC 19 0/14 0/12 0/1
NSCC mendukung SQCC 10 0/12 0/10 0/1
Total 29 0/26(0) 0/22(0) 0/2 (100)
NSCC mendukung AD-SQCC 4 4/4(100) 4/4 (100) -
NSCC-NOS 16 0/14 0/15 (0) 1/1 (100)

6
Gambar 1: (a dan b) SQCC (H dan E; a x40; b x100), (c) p63 dan (d) p40 menunjukkan pewarnaan inti
yang difus pada sel tumor (c dan d,x100), (e) TTF-1, negatif pada sel tumor. Beberapa sel yang
menunjukkan pewarnaan inti pada bagian perifer sarang-sarang tumor merupakan sel epitel alveolar
normal yang bertinfak sebagai kontrol positif internal (e,x100). (f) Napsin A negatif pada sel tumor
beberapa sel memperlihatkan pewarnaan sitoplasmik granuler pada bagian perifer sarang-sarang
merupakan sel epitel alveolar normal yang bertindak sebagai kontrol positif internal (f,x100).

Gambar 2: (a dan b) Adenocarcinoma menunjukkan pola lepidik yang dominan dengan pola asinar
fokal (H dan E; a, ×40; b, ×100). Baik (c) p63 dan (d) p40 negatif pada sel tumor. Harap perhatikan
pewarnaan sitoplasma nonspesifik dengan p40 (c dan d, ×100). ( e ) TTF-1 menunjukkan pewarnaan inti
kuat difus dalam sel tumor (e, × 40). ( f ) Napsin A menunjukkan pewarnaan sitoplasma granular kuat
difus pada sel tumor (f, × 40)

7
Gambar 3: (a dan b) Adenocarcinoma menunjukkan pola lepidik, asinar, dan fokal mikropapilari (H
dan E; a, ×40; B, ×100). (c dan d) p63 menunjukkan kepositifan inti pada sel tumor. Pewarnaan inti sel
basal epitel bronkiolus berfungsi sebagai kontrol positif internal (c, × 40; d, ×100). (e dan f) p40 negatif
pada sel tumor. Pewarnaan inti sel basal epitel bronkiolus berfungsi sebagai kontrol positif internal (e, ×
40; f, ×100)

Tabel 3: Hasil marka squamous cell carcinoma

Diagnosis akhir setelah IHK n P40 (%) P63 (%) CK 5/6 (%)
ADC 62 0/56 30/56 3/7
NSCC mendukung ADC 12 0/12 4/12 3/12
Total 74 0/68 (0) 34/68 (50) 8/19 (42,1)
SQCC 19 19/19 19/19 6/6
NSCC mendukung SQCC 10 9/10 10/10 1/4
Total 29 28/29 (96,5) 29/29 (100) 7/10 (70)
NSCC mendukung AD-SQCC 4 4/4 (100) 4/4 (100) 1/1 (100)
NSCC-NOS 16 0/12 (0) 5/12 (41,6) 1/4 (25)

Marka Squamous Cell Carcinoma

Seperti yang dinyatakan sebelumnya, marka SQCC, p63 dan p40, yang
merupakan subjek utama dari penelitian ini, dilakukan pada 107/123 (86,9%) kasus
NSCC, yang mencakup kasus-kasus differentiated dan undifferentiated NSCC secara
morfologi. Baik p63 dan p40 menunjukkan sensitivitas yang hampir sama untuk SQCC
(100% dan 97%, masing-masing), sedangkan p63 menunjukkan spesifisitas yang jauh

8
lebih rendah bila dibandingkan dengan p40 (51,3% vs 100%). Hanya satu kasus
dimana p40 negatif tetapi p63 positif yaitu kasus NSCC-NOS pada morfologi awal
yang kemudian dikategorikan sebagai NSCC yang cenderung pada SQCC setelah
IHK. Kasus ini menunjukkan positif tambahan untuk CK5/6 dan negatif untuk TTF-1
dan Napsin-A. Tak satupun dari kasus ADC positif untuk p40, sedangkan p63 positif
pada setengah dari kasus ADC termasuk sebagian besar yang berdiferensiasi baik
secara morfologi. Mayoritas ADC menunjukkan positifitas tingkat 1 hingga tingkat 2
pada 5% -50% sel. Namun, ada juga kasus yang menunjukkan pewarnaan tingkat 3,
serta pewarnaan di lebih dari 50% sel. Ada lima kasus dimana p63 menunjukkan
pewarnaan yang lemah pada 5% -25% yang tidak dikategorikan sebagai NSCC yang
cenderung pada SQCC dan dipertahankan sebagai NSCC-NOS. Lima kasus ini negatif
untuk p40 dan dua di antaranya di mana CK5/6 juga dilakukan menunjukkan hasil
pewarnaan negatif. Dalam salah satu kasus ini, marka ADC negatif, sementara pada
satu kasus, marka ADC tidak dilakukan.
Dari total 4 kasus yang akhirnya dikategorikan sebagai NSCC cenderung pada
AD-SQCC, dua secara morfologis ADC (terutama asinar dengan area fokal solid) dan
dua sisanya secara morfologi tidak berdiferensiasi (NSCC-NOS). Dalam semua kasus
ini, ada area pewarnaan yang berbeda untuk marka ADC (TTF-1 dan Napsin-A) dan
marka SQCC p40 dan CK5/6 (dilakukan dalam 1 kasus), tetapi marka p63
menunjukkan kepositifan yang tumpang tindih baik pada area skuamosa dan grandular.

Marka Adenocarcinoma

Studi ini juga mendokumentasikan sensitivitas tinggi dari marka TTF-1 dan
Napsin-A untuk ADC. Sensitivitas TTF-1 dan Napsin-A masing-masing adalah
92,42% dan 89,23%. Meskipun TTF-1 menunjukkan sensitivitas yang sedikit lebih
tinggi dibandingkan dengan Napsin-A, keduanya 100% spesifik. Satu kasus invasive
mucinous ADC menunjukkan hasil negatif untuk TTF-1 dan Napsin-A, sedangkan
untuk kasus negatif ganda lainnya, tidak ada primer yang ditemukan di bagian tubuh

9
lain bahkan setelah penyelidikan ekstensif; karenanya, itu dikategorikan sebagai ADC
paru primer. Kasus ini secara morfologi merupakan well-differentiated ADC tipe asinar
dan positif untuk CK7.

Gambar 4: (a dan b) Nonsmall cell lung carcinoma-not otherwise specified pada morfologi yang
menunjukkan nests dan cords sel tumor yang menginfiltrasi stroma fibrosa (HE; a, ×40; b, ×100). (c)
p63 menunjukkan positifitas pada sel tumor (×100). (d) p40 negatif pada sel tumor. (e) TTF-1
menunjukkan pewarnaan inti kuat difus pada sel tumor (e × 100). ( f ) Napsin-A menunjukkan
pewarnaan sitoplasma granular sedang pada sel tumor. Kasus ini kemudian dikategorikan sebagai
nonsmall cell lung carcinoma cenderung pada adenocarcinoma setelah imunohistokimia.

Ada empat kasus ADC yang menunjukkan pewarnaan bertentangan untuk

Napsin-A dan TTF-1. Dua kasus positif Napsin-A dan TTF-1 negatif, dengan dua
lainnya menunjukkan pola pewarnaan yang terbalik. Tak satu pun dari marka ADC
positif pada SQCC. Seperti yang dinyatakan sebelumnya, baik TTF-1 dan Napsin-A
dengan jelas menyoroti area ADC, sedangkan sisanya negatif di area SQCC dari
keempat kasus NSCC cenderung pada AD-SQCC. Gambar 4 dan Gambar 5 masing-
masing menunjukkan kasus yang dikategorikan sebagai NSCC cenderung pada ADC
dan SQCC setelah IHK. Gambar 6 menggambarkan adenosquamous carcinoma yang
awalnya dikategorikan sebagai ADC dengan pola morfologi solid dan asinar.

10
Gambar 5: (a dan b) Nonsmall cell lung carcinoma-not otherwise specified pada morfologi yang
menunjukkan nests dan cords sel tumor yang menginfiltrasi stroma fibrosa (H dan E; a, ×40; b,
×100). (c) p63 dan (d) p40 menunjukkan positifitas pada sel tumor (c, ×100; d, ×100). (d) TTF-1 dan (e)
Napsin-A negatif pada sel tumor (e, ×100; f, ×100). Kasus ini kemudian dikategorikan sebagai nonsmall
cell lung carcinoma SQCC setelah imunohistokimia.

Gambar 6: (a dan b) Adenosquamous cell carcinoma yang awalnya dikategorikan sebagai

adenocarcinoma dengan pola solid dan asinar pada morfologi (H dan E; a, ×40; b, ×100). (c) p63
Menampilkan pewarnaan inti difus di area solid. Beberapa inti di daerah glandular juga menunjukkan
pewarnaan positif. (c, ×100). ( d ) p40 juga menunjukkan pewarnaan inti difus di area solid tetapi negatif
di area glandular ( d, × 100). ( e ) TTF-1 menunjukkan pewarnaan inti positif di area glandular tetapi
negatif di (f) area solid (e, ×100; f, ×100). (g) Napsin-A menunjukkan pewarnaan sitoplasma granular
sedang pada sel tumor tetapi negatif pada (h) area solid (g, ×100; h, ×100)

11
 Sensitivitas, spesifisitas, PPV, dan NPV dari marka ADC dan SQCC disajikan
dalam (Tabel 4) dan (Tabel 5).

Tabel 4: Sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif, dan nilai prediksi negatif marka
Adenocarcinoma

Marka IHK Sensitivitas (%) Spesifisitas(%) PPV(%) NVP (%)

Nilai 95% Nilai (5% CI Nilai 95% Nilai 95%
CI CI CI
TTF-1 92,42 83,20- 100 91,19- 100 94,13- 88,89 75,95-
97,56 100 100 96,29
Napsin A 89,23 79,06- 100 90,51- 100 93,84- 84,09 69,93-
95,56 100 100 93,36
CK7 100 79,41- 66,67 9,43- 94,12 71,31- 100 15,81-
100 99,16 99,85 100

Tabel 5: Sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif, dan nilai prediksi negatif marka
Squamous cell carcinoma
Marka IHK Sensitivitas (%) Spesifisitas (%) PPV (%) NPV (%)
Nilai 95% CI Nilai (5% CI Nilai 95% CI Nilai 95%
CI
P63 100 89,42- 51,25 39,81- 45,83 34,02- 100 91,4-
100 62,59 58,00 100
P40 96,97 84,24- 100 94,72- 100 89,11- 98,55 92,19-
96,97 100 100 99,96
CK 5/6 72,73 39,03- 60,87 47,06 47,06 22,98- 82,35 56,57-
93,98 72,19 96,2

Diskusi

Sekitar 85%-90% dari semua karsinoma paru adalah NSCC.4 Adenocarcinoma

adalah kelompok terbesar diantara NSCC, diikuti oleh SQCC, NSCC-NOS, large cell
carcinoma, AD-SQCC, dan sarcomatoid carcinoma. Sebelum tahun 2004, subtipe
NSCC yang tepat tidak diperlukan. Pilihan pengobatan untuk NSCC adalah operasi,
radiasi, dan kemoterapi platinum base.5 Kemajuan besar terapi telah memiliki dampak
yang mendalam pada diagnosis patologik dan pengujian molekuler, sehingga sekarang
sangat penting untuk menentukan subtipe NSCC.6 Mutasi Epidermal growth factor

12
receptor atau translokasi anaplastic lymphoma kinase pada ADC memiliki pengobatan
terapi target yang berbeda, sehingga bahan biopsi kecil perlu jaga untuk pengujian
molekuler. Dalam konteks ini, pengujian tambahan, terutama IHK, menjadi sangat
penting dalam diagnosis yang tepat dari bahan-bahan biopsi kecil/sitologi dan poorly
differentiated lung cancer (NSCC-NOS).2
Menurut Travis et al., tidak ada sistem grading yang mapan untuk ADC, tetapi
grading menurut arsitektur histologis yang dominan adalah metode yang sederhana dan
dapat diulang dan memiliki kepentingan prognostik.7 Dalam penelitian ini, kami
mengklasifikasikan ADC berdasarkan pendekatan ini. Mirip dengan Travis et al., kami
juga menemukan pola asinar sebagai pola histologis yang paling umum (48,4% vs.
71,9%).7 Namun, tidak seperti penelitian ini, mereka menemukan pola solid sebagai
pola histologik terpenting kedua (37,7%). Tidak ada pola yang solid dalam penelitian
ini. Area solid dalam penelitian kami terlihat dalam kombinasi dengan pola asinar
dominan pada empat kasus. Kombinasi pola ini mungkin merupakan alasan yang
mungkin mencerminkan insiden pola asinar yang lebih tinggi sebagai pola histologis
yang dominan dalam penelitian ini.
Imunohistokimia dilakukan pada 110 dari total 123 kasus dalam penelitian ini,
sementara 107 kasus telah dilakukan p63 dan p40. Dalam penelitian ini, dimungkinkan
untuk mendiagnosis lebih dari 80% ADC dan lebih dari 65% SQCC berdasarkan
morfologi saja tanpa memerlukan pewarnaan khusus atau IHK. Diantara kasus yang
berdiferensiasi buruk/tidak berdiferensiasi (40/123), IHK mampu mendukung
diagnosis pasti pada 24 kasus.
Antibodi, anti-p63, mengenali dua isoform produk gen p63, isoform TAp63,
yang berisi domain transaktivasi N-terminal dan bertindak sebagai tumor supresor, dan
truncated isoform yang dikenal sebagai p40 (ΔNp63), tidak memiliki N-terminal
domain dan bertindak sebagai onkogen. Antibodi anti-p40 baru hanya mengenali
isoform Np63 dan bukan isoform TAp63.
Banyak penelitian telah menetapkan kurangnya spesifisitas p63 untuk
SQCC.8,9,10 Pencarian antibodi yang lebih spesifik telah menghasilkan antibodi baru,

13
p40, yang sensitif dan spesifik untuk SQCC paru. Dalam penelitian ini, antibodi p40
hampir sama sensitifnya dengan p63 untuk mendeteksi SQCC tetapi jauh lebih spesifik
daripada p63 untuk SQCC. Menurut beberapa penelitian, selain dari pewarnaan sel
skuamosa, p63 juga mewarnai 15%-65% dari ADC.1 Kurangnya spesifisitas ini lebih
penting dalam konteks ketersediaan jaringan yang terbatas untuk kategorisasi serta
untuk pengujian molekuler lebih lanjut untuk mengelola terapi target. Dalam penelitian
kami, p63 mewarnai 50% ADC, sedangkan p40 tidak mewarnai bahkan satu kasus pun
ADC. Perbandingan hasil IHK untuk p40 dan p63 pada NSCC dalam studi yang
berbeda termasuk seri ini disediakan dalam Tabel 6.
Sensitivitas yang dilaporkan untuk p40 berkisar 75% -100% diantara berbagai
penelitian. Penelitian ini menunjukkan sensitivitas yang sangat tinggi yaitu 96,97%
yang sebanding dengan hasil dari Bishop et al., Rigi et al., dan Dvorak et al. Semua
penelitian, termasuk yang sekarang, telah menunjukkan p40 sangat spesifik untuk
SQCC dengan spesifisitas yang dilaporkan mulai dari 90% sampai 100%. Hasil kami
konsisten dengan yang dilaporkan oleh Collins et al. yang juga mendokumentasikan
spesifisitas 100% dengan p40. Dalam penelitian ini, kami menggunakan antibodi
poliklonal p40, yang telah menunjukkan pewarnaan sitoplasma nonspesifik dan juga
pewarnaan makrofag. Namun, sebagai marka inti, pewarnaan sitoplasma bukanlah
halangan untuk kategorisasi pasti NSCC paru. Pewarnaan inti cukup khas untuk
membuat diagnosis yang pasti. Bishop et al. dan Tacha et al. juga menggunakan
antibodi poliklonal untuk p40 yang mirip dengan penelitian ini dan melihat pewarnaan
sitoplasma nonspesifik yang serupa. Tacha et al. membandingkan antibodi monoklonal
dengan antibodi poliklonal untuk p40 dan tidak menemukan perbedaan yang signifikan
secara statistik dalam hal sensitivitas, spesifisitas, dan nilai prediktif antara kedua
antibodi, kecuali untuk pewarnaan sitoplasma nonspesifik yang diamati dengan
antibodi poliklonal. Dvorak et al. membandingkan hasil dua antibodi monoklonal
untuk p40 (BC28 dan VP Eselon 40) dan melihat sensitivitas sedikit lebih tinggi untuk
BC28 dibandingkan dengan klon lainnya.

14
Tabel 6: Perbandingan hasil imunohistokimia untuk p40 dan p63 penelitian ini
dengan penelitian lain

Study p-40 p-63

Jenis Sensi Spesi PP NP Jenis Sensi Spesi PP NP
antibodi tivita fisita V( P( Antibo tivita fisita V( P(
s (%) s (%) %) %) di s (%) s (%) %) %)
Bishop Polyclonal 100 98 92 100 Monoc 100 64 34 100
et al., lonal
2012
(n=470)

Righi et - 100 96 94 100 Monoc 96 80 64 98

al., lonal
2011
(n=103)

Tacha e Monoclona 85 98 - - Monoc 85 90 - -

t al., lonal
2013
(n=90)
Polyclonal 85 98 - -

Collins Monoclona 89,4 100 100 93, Monoc 86,8 96,7 94, 92,
et al., 9 lonal 3 3
2013
(n=100)

Ming- - 80,5 90 - - Monoc 93,5 80 - -

Hui et lonal
al.,
2014
(n=200)

Dvorak Monoclona 92,6 94,8 94, 93, Monoc 92,1 89,2 88, 92,
et al., l(BC28) 1 8 lonal 3 6
2016
Monoclona
(n=538)
l(VP
Echelon
40)
studi Polyclonal 96,97 100 100 98, Monoc 100 51,25 45, 100
saat ini 55 lonal 83

15
 Sebagian besar penelitian yang dipublikasikan telah melaporkan p63 sebagai
antibodi yang sangat sensitif untuk SQCC dengan sensitivitas yang dilaporkan berkisar
antara 85% hingga 100%. Penelitian ini menunjukkan p63 menjadi 100% sensitif untuk
SQCC, mirip dengan yang dilaporkan oleh Bishop et al. Namun, spesifisitas p63 yang
dilaporkan bervariasi dari 64% hingga 97%. Penelitian kami menunjukkan spesifisitas
terendah 51,3% jika dibandingkan penelitian lain. Sehubungan dengan penelitian kami,
hasilnya lebih dekat dengan spesifisitas yang lebih rendah yaitu 64% yang dilaporkan
oleh Bishop et al. Kami tidak dapat menjelaskan spesifisitas variabel seperti yang
dilaporkan dalam penelitian yang berbeda karena sebagian besar penelitian lain
menggunakan batas yang sama seperti yang diterapkan dalam penelitian ini. Dalam
penelitian ini, tumor positif untuk p63 tetapi negatif untuk p40 dan CK5/6 didiagnosis
sebagai SQCC hanya jika mereka secara difus dan sangat positif untuk p63 dan negatif
untuk TTF-1 dan Napsin-A.
Penelitian ini juga menunjukkan TTF-1 dan Napsin-A menjadi marka yang
sangat sensitif dan spesifik untuk ADC paru. Keduanya menunjukkan sensitivitas yang
sebanding masing-masing 92,42% dan 89,23%, dengan spesifisitas 100%. Namun,
Tacha et al. mencatat sensitivitas dan spesifisitas yang sedikit lebih rendah untuk TTF-
1 (69% dan 94,7%) dibandingkan dengan penelitian ini. Namun, sensitivitas dan
spesifisitas Napsin-A adalah serupa pada kedua studi.
Dalam penelitian ini, dimungkinkan untuk secara akurat mendiagnosis subtipe
26/40 kasus NSCC-NOS di IHK. Dua belas kasus cenderung pada ADC, sepuluh kasus
cenderung pada SQCC, dan 4 kasus cenderung pada AD-SQCC setelah
IHK. Berdasarkan hasil kami, kami merekomendasikan panel tiga marka termasuk
TTF-1, Napsin-A dan p40 untuk mensubklasifikasikan sebagian besar poorly
differentiated NSCC.

16
Kesimpulan

Penelitian ini membandingkan dua marka SQCC paru – antibodi monoklonal

yang digunakan secara rutin, p63, dan antibodi poliklonal baru, p40, dan
mengkonfirmasi serta memvalidasi bahwa p40 sama sensitifnya tetapi sangat spesifik
daripada p63 dalam mendeteksi SQCC. Meskipun menjadi marka yang sangat sensitif
untuk SQCC, p63 kurang memiliki spesifisitas yang baik dan mewarnai 50% ADC
seperti yang dilaporkan dalam penelitian lain. Hasil penelitian ini mengkonfirmasi dan
memperluas penelitian sebelumnya bahwa p40 adalah marka yang lebih spesifik untuk
SQCC paru daripada marka yang sudah ada dalam penggunaan rutin, antibodi
p63. Oleh karena itu, kami merekomendasikan penggunaan rutin p40 daripada p63
untuk kategorisasi pasti NSCC paru. Hasil kami juga mengkonfirmasi bahwa TTF-1
dan Napsin-A adalah marka yang sama sensitif dan spesifik untuk ADC paru.

17
Published online: 2021-05-17

Original Article

Validation of Superiority of p40 over p63 in Differentiating Squamous Cell

Carcinoma and Adenocarcinoma Lung

Abstract Vamshi Krishna

Context: In this era of targeted therapy, it is important to distinguish the various subtypes of Thamtam1,
nonsmall cell lung carcinoma (NSCC). Diagnosis based on morphology alone is challenging in Shantveer G Uppin1,
poorly differentiated carcinomas and core biopsies. Immunohistochemistry  (IHC) helps in specifying
the lineage for the subtype of NSCC. Till date, p63 is the most frequently used and sensitive Monalisa Hui1,
marker for squamous cell carcinoma  (SQCC). However, it is not specific and stains a subset of N Narendra Kumar2,
adenocarcinoma  (ADC). Thus, a more reliable and specific marker is required for the diagnosis of K Bhaskar2,
SQCC. Objective: The objective of the study was to validate the diagnostic utility of p40 over p63 in Stalin Chowdary
differentiating pulmonary SQCC from ADC and NSCC‑not otherwise specified (NOS). Materials and Bala3,
Methods: A total of 123 cases of NSCC were initially reviewed and subtyped blinded to the results
of IHC. This was followed by a review of IHC slides which included p63, p40, thyroid transcription G Sadashivudu3,
factor 1, Napsin‑A, cytokeratin (CK) 5/6, and CK7. Results: There were 64 ADC, 19 SQCC, and 40 G K Paramjyothi2
NSCC‑NOS. IHC helped to confirm the morphological diagnosis in 62/64 ADCs and19/19 SQCCs. 1
Department of Pathology,
IHC classified the cases of NSCC‑NOS into NSCC favoring ADC  –  12  cases, NSCC favoring Nizam’s Institute of Medical
SQCC – 10 cases, and NSCC favoring AD‑SQCC – 4 cases. Both p63 and p40 showed near equal Sciences, Hyderabad,
sensitivity for SQCC  (100% and 97%, respectively), whereas p63 showed far lower specificity when Telangana, India, 2Department
of Pulmonology, Nizam’s
compared to p40 (51.3% vs. 100%). Conclusion: The present study confirms and validates that p40 is Institute of Medical Sciences,
equally sensitive but highly specific than p63 in detecting SQCC. Hence, we recommend the routine Hyderabad, Telangana, India,
use of p40 instead of p63 for the definite categorization of NSCC of the lung. 3
Department of Medical
oncology, Nizam’s Institute of
Keywords: Immunohistochemistry, lung, nonsmall cell carcinoma, p40, p63 Medical Sciences, Hyderabad,
Telangana, India

Introduction any required ancillary tests, especially

In the past, the only important distinction
necessary was between small cell lung
carcinoma (SCLC) and non‑SCLC (NSCC).
As targeted therapies have evolved for
various subtypes of NSCC, there is an
ever‑increasing need for differentiating
these subtypes. Distinguishing
adenocarcinoma (ADC) and squamous
cell carcinoma (SQCC) is important as the
treatment protocols differ.
To a large extent, the hematoxylin and
eosin (H and E)‑stained sections are enough
to study the morphology for a definite
diagnosis. However, in poorly differentiated
carcinomas, and more importantly for
small/core biopsies, difficulty arises
in subtyping NSCC accurately. It is
mandatory for the small/core biopsies
to be preserved for detecting the driver
mutations making the tissue available for
This is an open access journal, and articles are
distributed under the terms of the Creative Commons
Attribution‑NonCommercial‑ShareAlike 4.0 License, which allows
others to remix, tweak, and build upon the work non‑commercially,
as long as appropriate credit is given and the new creations are
licensed under the identical terms.
For reprints contact: WKHLRPMedknow_reprints@wolterskluwer.com
immunohistochemistry (IHC) even less.
There are various IHC markers available
to subtype NSCC. For ADC, the more
important ones are the nuclear marker
TTF‑1 and the cytoplasmic marker,
Napsin‑A. SQCC has sensitive antibody
Submitted: 26‑Feb‑2019
markers like the nuclear marker, p63, and
Revised: 25‑Jun‑2020
the cytoplasmic and membrane staining Accepted: 29‑Jun‑2020
cytokeratin 5/6 (CK 5/6) antibody, among Published: 29-Aug-2020
others. Novel antibodies always take
antibody detection to new levels by being
Address for correspondence:
more specific and/or sensitive. Dr. Shantveer G Uppin,
Department of Pathology,
Till date for SQCC, anti‑p63 antibody is Nizam’s Institute of Medical
the most frequently used nuclear marker. Sciences, Punjagutta,
Although it has good sensitivity, it is Hyderabad ‑ 500 082,
not highly specific as it also stains other Telangana, India.
E‑mail: drsguppin@yahoo.co.in
NSCCs. It is not useful, especially in
cases of poorly differentiated NSCC‑not
otherwise specified  (NOS) as it stains Access this article online
15%–65% of ADC.[1] Hence, there is a need
Website: www.ijmpo.org
for a reliable, easy to assess, and a more
DOI: 10.4103/ijmpo.ijmpo_51_19
specific marker in diagnosing SQCC.
Quick Response Code:
How to cite this article: Thamtam VK, Uppin SG,
Hui M, Kumar NN, Bhaskar K, Bala SC, et al. Validation
of superiority of p40 over p63 in differentiating
squamous cell carcinoma and adenocarcinoma lung.
Indian J Med Paediatr Oncol 2020;41:535-42.

© 2020 Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology | Published by Wolters Kluwer ‑ Medknow 535
 Thamtam, et al.: Superiority of p 40 over p 63 in lung carcinoma

The anti‑p40 antibody is highly specific for squamous/ <5%; 6%–25%; 26%–50%; and >50%. Cases showing
basal cells. Studies have shown this marker to have similar positivity of 5% or less were considered negative. However,
sensitivity as p63 and markedly high specificity for SQCC, H‑score was not determined.
as it stains a lesser number of ADC. The potential pitfall of
The sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV),
diagnosing a p63‑positive ADC as SQCC can be averted
and negative predictive value (NPV) of both the ADC and
to a large extent if p40 is used. In this study, we have
SQCC markers were analyzed.
validated the utility of p40 over p63 in differentiating
pulmonary SQCC from ADC and NSCC‑NOS in a large Results
cohort of biopsies and resected specimens (RSs).
Of the 123 patients, nearly three‑fourth, 92/123 (74.8%)
Materials and Methods were male with a male‑to‑female ratio of 3:1. The age
of the patients ranged from 18 years to 84 years, with a
A total number of 123 consecutive cases of NSCC
mean age of 57.8 years among males and 51.8 among
diagnosed on core‑needle biopsies (CNBs), endobronchial
females. Nearly 94.3% of the samples received were small
biopsies (EBBs), and RSs of the lung sent for
biopsies, with only a small fraction of 7 (5.6%) cases being
histopathological evaluation to the department of pathology
surgical resection specimen. Of the biopsies, majority were
between December 2014 and May 2016 were analyzed
computed tomography‑guided CNB [95/123 (77.2%)],
prospectively. This study was approved by the Institutional
followed by EBB [20/123 (16.2%)]. There was only one
Ethics Committee. The demographic data, clinical details,
biopsy which was done under ultrasound guidance.
radiological features, and laboratory investigations were
retrieved from the medical records. The SCLCs, carcinoids, Histopathologic examination
lymphomas, mesenchymal neoplasms, metastatic ADC was the most common histological subtype
carcinomas, and mesotheliomas were excluded from the accounting for more than 60% (74/123) of NSCC cases. Of
study. these, more than 80% (62/74) were diagnosed on H and E
Morphological analysis slides alone with the remaining 12 cases (16.2%) requiring
IHC for subcategorization. Of the total 64 ADC cases
Initially, all the cases of NSCC were morphologically
diagnosed on H and E morphology, majority (46 [71.9%]),
categorized based on the review of H and E slides
were acinar type, followed by lepidic type (10 [15.6%]),
blinded to the results of special stains and IHC results.
mucinous (4 [6.3%]), papillary (3 [4.7%]), and fetal
Subsequently, special stains with Alcian–periodic acid–
subtype 1 (1.5%). Most of the acinar‑type ADCs showed
Schiff for mucin were reviewed wherever performed.
pure acinar morphology (38 cases) with remaining showing
Immunohistochemistry predominantly acinar morphology in combination with other
morphologies like solid pattern (4 cases) and 1 case each
In all cases where IHC was done, the slides were reviewed
of papillary, cribriform, and focal micropapillary pattern.
to subtype the NSCC. In those cases where IHC was not
There was one case which had an additional combination
done, the initial morphological diagnosis was considered
of lepidic as well as micropapillary pattern. Two of the
as a final diagnosis. The primary panel of SQCC and
four cases which showed predominant acinar morphology
ADC markers included p40, p63, CK5/6, TTF1, Napsin‑A,
in combination with solid areas were categorized as
and CK7. All IHCs were performed on fully automated
adenosquamous carcinoma (AD‑SQCC) after IHC. These
immunostainer (Xmatrx Elite; BioGenex) by Poly horse
two cases showed expression of SQCC markers in solid
raddish peroxide (Poly HRP) technique. Of the primary
areas and ADC markers in acinar areas. Of the 10 cases
antibodies used, Napsin‑A was supplied by Biocare, p40 by
of lepidic subtype, 8 cases had a pure lepidic pattern and
Pathinsitu, and the rest by BioGenex. All were monoclonal
2 cases had additional micropapillary and acinar patterns.
antibodies except p40.
Although NSCC‑NOS formed the second major subtype,
All cases of NSCC were categorized as per the proposed
40/123 (32.5%) on H and E morphology, 24 (60%) of these
International Association for the Study of Lung Cancer
were further subtyped on IHC. These included 12 cases
American Thoracic Society European Respiratory Society
as NSCC favoring ADC, 10 cases favoring SQCC, and
classification for small biopsies.[2,3] For all the markers, the
the remaining 2 cases as favoring AD‑SQCC. Still,
intensity of staining was taken into consideration and was
16/123 (13%) cases could not be further subcategorized
compared to positive controls. For the SQCC markers, p40
and were retained as NSCC‑NOS. Of these 16 cases,
and p63, nuclear staining was accepted, and cytoplasmic
IHC slides were not available in 6 cases and the rest 10
staining was ignored. For p40 and p63 antibody, the
remained uncategorized even after an appropriate panel of
intensity of staining was scored semi‑quantitatively using
IHC.
a 3‑tier system: weakly positive (Grade 1), moderate
positivity (Grade 2), and strongly positive (Grade 3). The SQCCs accounted for 23.6% (29/123) of the cases of
staining proportion pattern was scored on a 4‑tier system: NSCC in the present study. Of these, 19 (65.5%) were

536 Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology | Volume 41 | Issue 4 | July-August 2020
 Thamtam, et al.: Superiority of p 40 over p 63 in lung carcinoma

diagnosed on H and E morphology alone, while the done showed negative staining. In one of these cases, ADC
remaining (10 [34.5%]) required IHC to favor a diagnosis markers were negative, while in one case, they were not
of SQCC. The distribution of the cases based on histological performed.
subtype before and after IHC is provided in Table 1.
Of the total 4  cases finally categorized as NSCC favoring
Immunohistochemistry AD‑SQCC, two were morphologically ADC (predominantly
IHC was done in 110/123 (89.4%) cases, of which both acinar with focal solid areas) and the remaining two were
p40 and p63 was performed in 107 (86.9%) cases. The morphologically undifferentiated  (NSCC‑NOS). In all
most common IHC markers performed included lung these cases, there were distinct areas of staining for ADC
ADC markers, TTF‑1 and Napsin A, and SQCC markers, markers (TTF‑1 and Napsin‑A) and SQCC markers p40
p63 and p40. The other ADC marker, CK7 and the SQCC and CK5/6 (done in 1 case), but the marker p63 showed
marker, CK5/6, were performed in a smaller number of
cases. The results of ADC and SQCC markers done in the
NSCC cases are provided in Tables 2 and 3, respectively.
The morphological and immunohistochemical features of
SQCC and ADC are depicted in Figures 1‑3.
Squamous cell carcinoma markers
As stated earlier, SQCC markers, p63 and p40, which were a b
the main subjects of the present study, were performed
in 107/123 (86.9%) NSCC cases, which included both
morphologically differentiated and undifferentiated NSCC
cases. Both p63 and p40 showed near equal sensitivity
for SQCC (100% and 97%, respectively), whereas p63
showed far lower specificity when compared to p40 (51.3%
vs. 100%). Only one case in which p40 was negative but c d
p63 was positive was a case of NSCC‑NOS on initial
morphology which was later categorized as NSCC favoring
SQCC after IHC. This case showed additional positivity
for CK5/6 and was negative for both TTF‑1 and Napsin‑A.
None of the ADC cases were positive for p40, whereas p63
was positive in half of the cases of ADC including majority
of the morphologically well‑differentiated ones. Majority of
ADC showed Grade 1 to Grade 2 positivity in 5%–50% e f
of cells. However, there were also cases showing Grade Figure 1: (a and b) Squamous cell carcinoma (H and E; a, ×40; b, ×100).
(c) p63 and (d) p40 showing diffuse strong nuclear staining in the tumor
3 staining, as well as staining in more than 50% cells. cells (c and d, ×100). (e) TTF‑1, negative in tumor cells. Few cells showing
There were five cases where p63 showed weak staining in nuclear staining at the periphery of tumor nests are normal alveolar
5%–25% which were not categorized as NSCC favoring epithelial cells which serve as internal positive control (e, ×100). (f) Napsin
A, negative in tumor cells. Few cells showing granular cytoplasmic staining
SQCC and retained as NSCC‑NOS. These five cases were at the periphery of tumor nests are normal alveolar epithelial cells which
negative for p40 and two of these where CK5/6 was also serve as internal positive control (f, ×100)

Table 1: Distribution of the cases of nonsmall cell lung carcinoma based on histological subtype before and after
immunohistochemistry
H and E diagnosis (before IHC) n Final diagnosis (after IHC*) n
ADC 64 ADC 62
NSCC favor AD-SQCC 2
SQCC 19 SQCC 19
NSCC-NOS 40 NSCC-NOS 16
NSCC favor ADC 12
NSCC favor SQCC 10
NSCC favor AD-SQCC 2
Total 123 Total 123
*IHC was not done in all cases. In such cases where IHC was not done initial morphological diagnosis was considered as final diagnosis.
H and E – Hematoxylin and Eosin; IHC – Immunohistochemistry; ADC – Adenocarcinoma; SQCC – Squamous cell carcinoma; NSCC –
Nonsmall cell carcinoma; NOS – Not otherwise specified; AD-SQCC – Adenosquamous carcinoma

Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology | Volume 41 | Issue 4 | July-August 2020 537
 Thamtam, et al.: Superiority of p 40 over p 63 in lung carcinoma

overlapping positivity both in squamous as well as in Adenocarcinoma markers

glandular areas.
a b
c d
e f
Figure 2: (a and b) Adenocarcinoma showing predominantly lepidic pattern
with focal acinar pattern (H and E; a, ×40; b, ×100). Both (c) p63 and (d) p40
being negative in the tumor cells. Please note nonspecific cytoplasmic
staining with p40 (c and d, ×100). (e) TTF‑1 showing diffuse strong nuclear
staining in tumor cells (e, ×40). (f) Napsin A showing diffuse strong granular
cytoplasmic staining in tumor cells (f, ×40)
This study also documented high sensitivities of the
markers TTF‑1 and Napsin‑A for ADC. The sensitivity
of TTF‑1 and Napsin‑A was 92.42% and 89.23%,
respectively. Although TTF‑1 showed slightly higher
sensitivity compared to Napsin‑A, both were 100%
specific. One case of invasive mucinous ADC showed
negativity for both TTF‑1 and Napsin‑A, while for another
double‑negative case, no primary was found in any other
part of the body even after extensive investigations; hence,
it was categorized as primary lung ADC. This case was
a morphologically well‑differentiated ADC of acinar type
and was positive for CK7.
There were four cases of ADC which showed discordant
staining for Napsin‑A and TTF‑1. Two of cases were
Napsin‑A postive and TTF‑1 negative, with other two
showing the reverse pattern of staining. None of the ADC
markers were positive in SQCC. As stated earlier, both
TTF‑1 and Napsin‑A distinctly highlighted the ADC areas,
while the remaining negative in SQCC areas of all four
cases of NSCC favor AD‑SQCC. Figures 4 and 5 show
cases categorized as NSCC favoring ADC and SQCCC
after IHC, respectively. Figure 6 depicts adenosquamous
carcinoma which was initially categorized as ADC with
solid and acinar patterns on morphology.
The sensitivity, specificity, PPV, and NPV of ADC and
SQCC markers are provided in Tables 4 and 5, respectively.

Table 2: Results of adenocarcinoma markers

Final diagnosis (after IHC) n TTF-1 (%) Napsin A (%) CK 7 (%)
ADC 62 46/50 45/49 14/14
NSCC favor ADC 12 11/12 9/12 2/2
Total 74 57/62 (91.9) 54/61 (88.5) 16/16 (100)
SQCC 19 0/14 0/12 0/1
NSCC favor SQCC 10 0/12 0/10 0/1
Total 29 0/26 (0) 0/22 (0) 0/2 (100)
NSCC favor AD-SQCC 4 4/4 (100) 4/4 (100) -
NSCC-NOS 16 0/14 (0) 0/15 (0) 1/1 (100)
ADC – Adenocarcinoma; SQCC – Squamous cell carcinoma; NSCC – Nonsmall cell carcinoma; NOS – Not otherwise specified; AD-SQCC
– Adenosquamous carcinoma

Table 3: Results of squamous cell carcinoma markers

Final diagnosis (after IHC) n P40 (%) P63 (%) CK5/6 (%)
ADC 62 0/56 30/56 5/7
NSCC favor ADC 12 0/12 4/12 3/12
Total 74 0/68 (0) 34/68 (50.0) 8/19 (42.1)
SQCC 19 19/19 19/19 6/6
NSCC favor SQCC 10 9/10 10/10 1/4
Total 29 28/29 (96.5) 29/29 (100) 7/10 (70.0)
NSCC favor AD-SQCC 4 4/4 (100) 4/4 (100) 1/1 (100)
NSCC-NOS 16 0/12 (0) 5/12 (41.6) 1/4 (25.0)
ADC – Adenocarcinoma; SQCC – Squamous cell carcinoma; NSCC – Nonsmall cell carcinoma; NOS – Not otherwise specified; AD-SQCC
– Adenosquamous carcinoma

538 Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology | Volume 41 | Issue 4 | July-August 2020
 Thamtam, et al.: Superiority of p 40 over p 63 in lung carcinoma

Discussion NSCC.[6] Epidermal growth factor receptor mutations or

anaplastic lymphoma kinase translocation in ADC have
Approximately 85%–90% of all lung carcinomas are
different specific targeted treatments, and so the small
NSCC.[4] ADC is the largest group among NSCC, followed
biopsy material needs to be conserved for molecular
by SQCC, NSCC‑NOS, large cell carcinoma, AD‑SQCC,
testing. In this context, ancillary testing, especially IHC,
and sarcomatoid carcinoma. Prior to 2004, the precise
becomes very important in the correct diagnosis of small
subtyping of NSCC was not necessary. Treatment options
biopsies/cytology material and poorly differentiated lung
for NSCC included primarily surgery, radiation, and
cancers (NSCC‑NOS).[2]
platinum‑based chemotherapy.[5]Major therapeutic advances
have had a profound impact on pathological diagnosis
and molecular testing, and it is now imperative to subtype

a b

a b

c d

c d

e f
Figure 3:  (a and b) Adenocarcinoma showing lepidic, acinar, and focal
micropapillary patterns (H and E; a, ×40; B, ×100). (c and d) p63 showing nuclear
positivity in the tumor cells. Staining of nuclei of the basal cells of bronchiolar
epithelium serves as internal positive control (c, ×40; d, ×100). (e and f) p40
being negative in tumor cells. Staining of nuclei of the basal cells of bronchiolar
epithelium serves as internal positive control (e, ×40; f, ×100)
e f
Figure 4: (a and b) Nonsmall cell lung carcinoma‑not otherwise specified on
morphology showing nests and cords of tumor cells infiltrating the fibrous
stroma  (H and E; a, ×40; b, ×100).  (c) p63 showing positivity within the
tumor cells (×100). (d) p40 being negative in tumor cells. (e) TTF‑1 showing
diffuse strong nuclear staining in tumor cells (e × 100). (f) Napsin‑A showing
moderate granular cytoplasmic staining in tumor cells. This case was later
categorized as nonsmall cell lung carcinoma favour adenocarcinoma after
immunohistochemistry

Table 4: The sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value of adenocarcinom markers
IHC marker Sensitivity (%) Specificity (%) PPV (%) NPV (%)
Value 95% CI Value 95% CI Value 95% CI Value 95% CI
TTF-1 92.42 83.20-97.49 100 91.19-100 100 94.13-100 88.89 75.95-96.29
Napsin A 89.23 79.06-95.56 100 90.51-100 100 93.84-100 84.09 69.93-93.36
CK7 100 79.41-100.00 66.67 9.43-99.16 94.12 71.31-99.85 100 15.81-100.00
IHC – Immunohistochemistry; CI – Confidence interval; PPV – Positive predictive value; NPV – Negative predictive value

Table 5: The sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value of squamous cell carcinoma
markers
IHC marker Sensitivity (%) Specificity (%) PPV (%) NPV (%)
Value 95% CI Value 95% CI Value 95% CI Value 95% CI
P63 100.00 89.42-100.00 51.25 39.81-62.59 45.83 34.02-58.00 100.00 91.4-100.00
P40 96.97 84.24-99.92 100.00 94.72-100.00 100.00 89.11-100.00 98.55 92.19-99.96
CK5/6 72.73 39.03-93.98 60.87 38.54-80.29 47.06 22.98-72.19 82.35 56.57-96.20
IHC – Immunohistochemistry; CI – Confidence interval; PPV – Positive predictive value; NPV – Negative predictive value

Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology | Volume 41 | Issue 4 | July-August 2020 539
 Thamtam, et al.: Superiority of p 40 over p 63 in lung carcinoma

Table 6: The comparison of immunohistochemistry results for p40 and p63 of the present study with others
Study p-40 p63
Type of antibody Sensitivity Specificity PPV NPV Type of Sensitivity Specificity PPV NPV
(%) (%) (%) (%) antibody (%) (%) (%) (%)
Bishop et al., 2012 Polyclonal 100 98 92 100 Monoclonal 100 64 34 100
(n=470)[1]
Righi et al., 2011 - 100 96 94 100 Monoclonal 96 80 64 98
(n=103)[11]
Tacha et al., 2013 Monoclonal 85 98 - - Monoclonal 85 90 - -
(n=90)[12] Polyclonal 85 98 - -
Collins et al., 2013 Monoclonal 89.4 100 100 93.9 Monoclonal 86.8 96.7 94.3 92.3
(n=100)[13]
Ming-Hui et al., 2014 - 80.5 90 - - Monoclonal 93.5 80 - -
(n=200)[8]
Dvorak et al., 2016 Monoclonal 92.6 94.8 94.1 93.8 Monoclonal 92.1 89.2 88.3 92.6
(n=538)[14] (BC28)
Monoclonal 75 98.6 97.9 81.6
(VP Echelon 40)
Present study Polyclonal 96.97 100 100 98.55 Monoclonal 100 51.25 45.83 100
PPV – Positive predictive value; NPV – Negative predictive value

pattern (48.4% vs. 71.9%).[7] However, unlike the present

a b
c d
e f
Figure 5: (a and b) Nonsmall cell lung carcinoma‑not otherwise specified on
morphology showing nests and cords of tumor cells infiltrating the fibrous
stroma (H and E; a, ×40; b, ×100). (c) p63 and (d) p40 showing positivity
within the tumor cells (c, ×100; d, ×100). (d) TTF‑1 and (e) Napsin‑A being
negative in tumor cells (e, ×100; f, ×100). This case was later categorized as
nonsmall cell lung carcinoma favoring SQCCC after immunohistochemistry
According to Travis et  al., there is no well‑established
grading system for ADC, but grading according to the
predominant histologic architecture is a simple and
reproducible method and seems to be of prognostic
importance.[7] In the present study, we classified ADC
based on this approach. Similar to Travis et  al., we also
found an acinar pattern to be the most common histological
study, they found solid pattern as the second most
important histologic pattern (37.7%). There was no solid
pattern in this study. The solid areas in our study were seen
in combination with predominant acinar pattern in four
cases. This combination of pattern probably is the reason
which might have reflected a higher incidence of an acinar
pattern as the predominant histologic pattern in this study.
IHC was performed in 110 of the total 123 cases in the
present study, while 107 cases had both p63 and p40
performed. In the present study, it was possible to diagnose
more than 80% of ADC and more than 65% of SQCC
on morphology alone without the need for special stains
or IHC. Among the poorly differentiated/undifferentiated
cases  (40/123), IHC was able to favor a definite diagnosis
in 24 cases.
The antibody, anti‑p63, recognizes two isoforms of the
p63 gene product, the TAp63 isoform, which contains
the N‑terminal transactivation domain and acts as a
tumor suppressor, and a truncated isoform known as
p40 (ΔNp63), which lacks the N‑terminal domain and acts
as an oncogene. The new anti‑p40 antibody recognizes
only the ΔNp63 isoform and not the TAp63 isoform.[1,8]
Many studies have established the lack of specificity of
p63 for SQCC.[8‑10] Quest for a more specific antibody
has brought about the novel antibody, p40, which is both
sensitive and specific for lung SQCC. In the present
study, the antibody p40 was nearly as sensitive as p63 for
detecting SQCC but was far more specific than p63 for
SQCC. According to several studies, apart from staining
squamous cells, p63 also stains 15%–65% of ADCs.[1]
This lack of specificity is more important in the context
of limited tissue availability for categorization as well as
for further molecular testing to administer the targeted

540 Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology | Volume 41 | Issue 4 | July-August 2020
 Thamtam, et al.: Superiority of p 40 over p 63 in lung carcinoma

a b

c d

e f g h
Figure  6:  (a and b) Adenosquamous carcinoma which was initially categorized as adenocarcinoma with solid and acinar pattern on morphology
(H and E; a, ×40; b, ×100). (c) p63 Showing diffuse nuclear staining in solid areas. Few nuclei in the glandular areas also show positive staining. (c, ×100). (d) p40
also showed diffuse nuclear staining in solid areas but negative in glandular areas (d, ×100). (e) TTF‑1 showing positive nuclear staining in glandular areas
but negative in (f) solid areas (e, ×100; f, ×100). (g) Napsin‑A showing moderate granular cytoplasmic staining in tumor cells but is negative in (h) solid
areas (g, ×100; h, ×100)

therapies. In our study, p63 stained 50% of ADC, while p40
did not stain even a single case of ADC. The comparison of
IHC results for p40 and p63 in NSCC in different studies
including the present series is provided in Table 6.[1,8,11‑14]
The reported sensitivity for p40 has ranged 75%–100%
among various studies. The present study showed a very
high sensitivity of 96.97% which is comparable to the
results of Bishop et al., Righi et al., and Dvorak et al.[1,11,14]
All the studies, including the present one, have shown p40
to be highly specific for SQCC with reported specificity
ranging from 90% to 100%. Our results are consistent with
that reported by Collins et  al.[13] who also documented
100% specificity with p40. In the present study, we used a
polyclonal antibody of p40, which has shown nonspecific
cytoplasmic staining and also staining of macrophages.
However, being a nuclear marker, the cytoplasmic staining
was not a hindrance to the definite categorization of lung
NSCC. The nuclear staining was distinctive enough to
make a definite diagnosis. Bishop et  al. and Tacha et  al.
also used polyclonal antibody for p40 similar to the
present study and noticed similar nonspecific cytoplasmic
staining.[1,12] Tacha et  al. compared monoclonal with
polyclonal antibody for p40 and found no statistically
significant difference in terms of sensitivity, specificity,
and predictive values between the two antibodies, except
for nonspecific cytoplasmic staining observed with a
polyclonal antibody.[12] Dvorak et  al. compared the results
of two monoclonal antibodies for p40 (BC28 and VP
Echelon 40) and noticed a slightly higher sensitivity for
BC28 compared to the other clone.[14]
Most of the published studies have reported p63 to be
a highly sensitive antibody for SQCC with reported
sensitivity ranging from 85% to 100%. The present study
demonstrated p63 to be 100% sensitive for SQCC, similar
to that reported by Bishop et  al.[1] However, the reported
specificity of p63 has varied from 64% to 97%. Our study

Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology | Volume 41 | Issue 4 | July-August 2020 541
 Thamtam, et al.: Superiority of p 40 over p 63 in lung carcinoma
showed the lowest specificity of 51.3% when compared
other studies. In regard to our study, the results are closer
to the lower specificity of 64% reported by Bishop et  al.[1]
We are unable to explain such variable specificity reported
in different studies as most of the other studies used similar
cutoffs as applied in the present study. In the present study,
tumors positive for p63 but negative for p40 and CK5/6
were diagnosed as SQCC only if they were diffusely and
strongly positive for p63 and negative for TTF‑1 and
Napsin‑A.
The present study also showed TTF‑1 and Napsin‑A to be
highly sensitive and specific markers for lung ADC. Both
showed comparable sensitivities of 92.42% and 89.23%,
respectively, with 100% specificity. However, Tacha
et  al. noted slightly lower sensitivity and specificity for
TTF‑1 (69% and 94.7%) as compared to the present study.
However, the sensitivity and specificity of Napsin‑A were
similar in both the studies.[12]
In the present study, it was possible to accurately
subtype 26/40 cases of NSCC‑NOS on IHC. Twelve cases
favored ADC, ten cases favored SQCC, and 4 cases favored
AD‑SQCC after IHC. Based on our results, we recommend
a panel of three markers including TTF‑1, Napsin‑A and
p40 to subclassify most of the poorly differentiated NSCC.
Conclusion
The present study compared two lung SQCC markers – the
routinely used monoclonal antibody, p63, and the novel
polyclonal antibody, p40, and confirmed as well as validated
that p40 is equally sensitive but highly specific than p63
in detecting SQCC. Despite being a very sensitive marker
for SQCC, p63 lacks specificity and stains 50% ADCs as
reported in other studies. The results of the present study
confirm and expand upon the previous studies that p40 is
a more specific marker for lung SQCC than the already
established marker in routine use, p63 antibody. Hence, we
recommend the routine use of p40 instead of p63 for the
definite categorization of NSCC of the lung. Our results
also confirm that TTF‑1and Napsin‑A are equally sensitive
and specific markers for ADC of the lung.
Financial support and sponsorship
Nil.
Conflicts of interest
There are no conflicts of interest.
542 Indian Journal of Medical and Paediatric Oncology | Volume 41 | Issue 4 | July-August 2020
References
1. Bishop JA, Teruya‑Feldstein J, Westra WH, Pelosi G,
Travis WD, Rekhtman N. p40 (ΔNp63) is superior to p63 for the
diagnosis of pulmonary squamous cell carcinoma. Mod Pathol
2012;25:405‑15.
2. Thunnissen E, Kerr KM, Herth F. The challenge of NSCC
diagnosis and predictive analysis on small samples.Practical
approach of a working group. LungCancer 2012;76:1‑188.
3. Travis WD, Brambilla E, Noguchi M, Nicholson AG,
Geisinger KR, Yatabe Y, et al. International association for
the study of lung cancer/american thoracic society/european
respiratory society international multidisciplinary classification
of lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol 2011;6:244‑85.
4. Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012. CA
Cancer J Clin 2012;62:10‑29.
5. Pikor LA, Ramnarine VR, Lam S, Lam WL. Genetic alterations
defining NSCC subtypes and their therapeutic implications. Lung
Cancer 2013;82:179‑89.
6. MitsudomiT, Morita  S, Yatabe  Y. Gefitinib versus cisplatin
plus docetaxel in patients with nonsmall cell lung cancer
harbouring mutations of the epidermal growth factor
receptor (WJTOG3405): An open label, randomised phase 3 trial.
Lancet Oncol 2010;11:121‑28.
7. Travis WD, Rekhtman N, Riley GJ, Geisinger KR, Asamura H,
Brambilla E, et al. Pathologic diagnosis of advanced lung cancer
based on small biopsies and cytology: A paradigm shift. J Thorac
Oncol 2010;5:411‑4.
8. AO MH, Zhang H, Sakowski L, Sharma R, Illei PB, Gabrielson E,
et al. The utility of a novel triple marker (combination of TTF1,
napsin A, and p40) in the subclassification of non‑small cell lung
cancer Hum Pathol 2014;45:926‑34.
9. Weinstein IB, Joe AK. Mechanisms of disease: Oncogene
addiction‑a rationale for molecular targeting in cancer therapy.
Nat Clin Pract Oncol 2006;3:448‑57.
10. Nonaka D. A study of ΔNp63 expression in lung non‑small cell
carcinomas. Am J Surg Pathol 2012;36:895‑9.
11. Righi L, Graziano P, Fornari A,Rossi G, Barbareschi M,
Cavazza A, et al. Immunohistochemical subtyping of nonsmall
cell lung cancer not otherwise specified in fine‑needle aspiration
cytology a retrospective study of 103 cases with surgical
correlation. Cancer 2011;117:3416‑23.
12. Tacha D, Bremer R, Haas T, Qi W. An immunohistochemical
analysis of a newly developed, mouse monoclonal p40 (BC28)
antibody in lung, bladder, skin, breast, prostate, and head and
neck cancers. Arch Pathol Lab Med 2014;138:1358‑64.
13. Collins BT, Wang JF, Bernadt CT. Utilization of p40 (ΔNp63)
with p63 and cytokeratin5/6 immunohistochemistry in non‑small
cell lung carcinoma fine‑needle aspiration biopsy. Acta
Cytologica 2013;57:619‑24.
14. Dvorak K, Yambert J, Palting J, Reinhardt K, Roessler C, Moh A,
et al. Improved lung cancer classification using new optimized
immunohistochemical assay with anti‑p40 (BC28) mouse
monoclonal antibody. Int J Clin Exp Pathol 2016;9:2693‑701.