PROPOSAL TUGAS AKHIR

ISOLASI DAN PURIFIKASI SENYAWA AZADIRACHTIN

DARI DAUN MIMBA (Azadirachta indica) DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR VAKUM DAN KROMATOGRAFI
LAPIS TIPIS

WAYAN IRA MASUARI

1708551026

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2020

1
 Lembar Pengesahan

ISOLASI DAN PURIFIKASI SENYAWA AZADIRACHTIN

DARI DAUN MIMBA (Azadirachta indica) DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR VAKUM DAN KROMATOGRAFI
LAPIS TIPIS

PROPOSAL TUGAS AKHIR

Proposal Tugas Akhir ini diajukan sebagai syarat untuk melanjutkan ke Tugas Akhir

di Program Studi Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Udayana

Oleh

WAYAN IRA MASUARI

1708551026

Menyetujui:

Pembimbing I Pembimbing II

apt. Ni Made Widi Astuti, S.Farm., M.Si. Dr.rer.nat. apt. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si.

NIP. 1987091620181123001 NIP. 196804201994021001

2
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa

karena atas berkat dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan proposal

tugas akhir yang berjudul “Isolasi dan Purifikasi Senyawa Azadirachtin dari

Daun Mimba (Azadirachta indica) dengan Kromatografi Cair Vakum dan

Kromatografi Lapis Tipis” tepat pada waktunya. Penyusunan proposal

tugas akhir ini tidak terlepas dari dukungan, bimbingan dan saran yang

penulis terima dari berbagai pihak. Maka dari itu, pada kesempatan ini

penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Tuhan Yang Maha Esa yang selalu memberikan kesehatan,

semangat, dan petunjuk kepada penulis dari awal hingga proposal

tugas akhir ini dapat selesai dengan baik dan tepat waktu.

2. Drs. Ni Luh Watiniasih, M.Sc., Ph.D, selaku Dekan Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang

selalu memfasilitasi penulis selama penyusunan proposal tugas

akhir ini.

3. apt. Dewa Ayu Swastini, S.F., M.Farm. selaku ketua Program Studi

Farmasi Udayana yang selalu memberikan perhatian, dukungan

dan semangat kepada penulis untuk mengikuti pendidikan di

Program Studi Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Udayana, khususnya penyusunan

proposal tugas akhir ini.

3
4. apt. Ni Made Widi Astuti., S.Farm., M.Si. selaku dosen Pembimbing I

yang dengan penuh perhatian telah memberikan motivasi,

semangat, saran, dan bimbingan dengan sabar selama penulis

mengikuti pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana,

khususnya penyusunan proposal tugas akhir ini.

5. Dr.rer.nat. apt. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si. selaku

pembimbing II yang selalu memberikan motivasi, semangat,

bimbingan dan saran selama penulis mengikuti pendidikan di

Program Studi Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Udayana, khususnya penyusunan

proposal tugas akhir ini.

6. Seluruh dosen dan staf pengawai di Program Studi Farmasi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Udayana yang memberikan bantuan kepada penulis selama

penyusunan proposal tugas akhir ini.

7. Keluarga, yaitu orang tua, kakek, nenek, dan adik yang penulis

sayangi dan cintai. Terima kasih atas dukungan dan doa yang

selalu diberikan selama penyusunan proposal tugas akhir ini.

8. Teman-teman tersayang “Siebzehn Martius” yang selalu

memberikan semangat, bantuan dan sudah menemani dari awal

kuliah hingga saat ini.

4
9. Keluarga besar Analisis Farmasi Udayana yang memberikan

motivasi dan semangat selama penulis mengerjakan proposal

tugas akhir.

10. Keluarga besar “Angkatan 17” analisis yang selalu menemani,

memberi semangat, dan bersama mempersiapkan segala sesuatu

mengenai proposal tugas akhir ini.

11. Semua pihak yang terlibat dan telah membantu penulis dalam

menyelesaikan proposal tugas akhir ini yang tidak dapat penulis

sebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penyusunan proposal tugas akhir ini

masih jauh dari sempurna. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan

saran dari seluruh pihak yang bersifat membangun, sehingga dimasa

mendatang dapat menjadi lebih baik. Penulis berharap semoga proposal

tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi seluruh pihak yang membacanya.

Bukit Jimbaran, 10 November 2020

Penulis

5
 DAFTAR ISI

Halaman
Lembar Pengesahan ii
KATA PENGANTAR iii
DAFTAR ISI vi
DAFTAR GAMBAR viii
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR ISTILAH x
DAFTAR SINGKATAN xi
DAFTAR LAMPIRAN xii
BAB I PENDAHULUAN 1
1.1 Latar Belakang 1
1.2 Rumusan Masalah 3
1.3 Tujuan Penelitian 4
1.4 Manfaat Penelitian 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 5
2.1 Tanaman Mimba 5
2.1.1 Deskripsi Tanaman 5
2.1.2 Taksonomi 6

6
 2.1.3 Kandungan Senyawa Azadirachtin dalam Daun Mimba 6
2.2 Isolasi dan Purifikasi 7
2.3 Ekstraksi dengan Maserasi 7
2.4 Kromatografi Cair Vakum (KVC) 8
2.5 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) 8
BAB III METODE PENELITIAN 10
3.1 Rancangan Penelitian 10
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian 10
3.3 Alat dan Bahan Penelitian 10
3.3.1 Alat Penelitian 10
3.3.2 Bahan Penelitian 11
3.4 Prosedur Penelitian 11
3.4.1 Uji Skrining Fitokimia Golongan Terpenoid 11
3.4.2 Ekstraksi Senyawa Azadirachtin dari Daun Mimba 12
3.4.3 Pemisahan dengan Kromatografi Cair Vakum 12
3.4.4 Identifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis 13
3.5 Analisis Data 13
3.6 Skema Penelitian 14
3.7 Jadwal Kegiatan 14
DAFTAR PUSTAKA 16

7
 DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1 Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) 6

Gambar 2 Struktur Senyawa Azadirachtin 6

8
 DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1 Daftar Rf standar Azadirachtin dari berbagai fase gerak 7

Tabel 2 Jadwal Pelaksanaan Penelitian 14

9
 DAFTAR ISTILAH

Empiris : Kepercayaan turun-temurun

Ekstrak : Sediaan yang diperoleh dari jaringan hewan atau tumbuhan

dengan menarik sari aktifnya dengan pelarut yang sesuai,

kemudian memekatkannya hingga tahap tertentu.

Ekstrak kental : Ekstrak yang telah mengalami proses penguapan dan sudah

tidak mengandung cairan pelarut lagi, tetapi konsistensinya

tetap cair pada suhu kamar.

10
 DAFTAR SINGKATAN

GF : Gypsum Fluoresence

KCV : Kromatografi Cair Vakum

KLT : Kromatografi Lapis Tipis

Rf : Retardation factor

11
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Cara Pembuatan Fase Gerak 18

Lampiran 2 Cara Pembuatan Pereaksi Warna 19

12
 13

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman mimba (Azadirachta indica) adalah tanaman yang banyak

ditemukan di negara-negara tropis seperti India, Pakistan, Burma dan Indonesia

(Asif, 2012). Menurut Asif (2012) ; Razak dan Kusuma (2018) menyebutkan

hampir semua bagian dari tanaman mimba mempunyai khasiat sebagai obat dan

dapat dimanfaatkan sebagai bioinsektisida.

Daun mimba secara empiris digunakan lebih dari 4000 tahun dalam

pengobatan Ayurveda. Daun mimba mengandung azadirachtin sebagai senyawa

aktif utama dan metabolit sekunder seperti salanin, meliantriol, nimbin dan

nimbidin (Indiati dan Marwoto, 2008). Senyawa azadirachtin memiliki aktivitas

farmakologi seperti antiinflmasi, antikanker, antioksidan, antipiretik, antirematik,

antidiabetes, hipolipidemik, hipoglikemik, imunostimulan dan hepatoptotektif

(Sulistyoningrum, 2010; Agus, 2011, Balaji dan Cheralathan 2015; Agustin dkk.,

2016). Berdasarkan penelitian Wahjuni (2016) dan Supriyanto dkk (2017)

menyebutkan bahwa senyawa azadirachtin merupakan golongan terpenoid yang

juga memiliki aktivitas sebagai antibakteri, antivirus, antiprotozoa dan antifungi

sehingga berpotensi digunakan sebagai bioinsektisida. Azadirachtin dapat

menimbulkan berbagai pengaruh pada serangga, seperti hambatan aktivitas

makan, ketahanan hidup, gangguan perkembangan dan lain sebagainya (Sari dan

Suharsono, 2014). Berdasarkan penelitian Dewi dkk (2017) menyatakan semakin

tinggi konsentrasi azadirakhtin, maka jumlah racun yang mengenai kutikula

 14

serangga semakin banyak, sehingga dapat menghambat pertumbuhan dan

menyebabkan kematian serangga 100 %. Menurut penelitan Rusdy (2009)

membuktikan semakin tinggi tingkat kepekatan suatu bahan kimia akan semakin

banyak bahan aktif yang dikandungnya yang membuat semakin besar daya

bunuhnya dalam penggunaannya sebagai bioinsektisida semakin efektif.

Penggunaan bioinsektisida merupakan alternatif untuk menekan

penggunaan pestisida sintetik yang tidak ramah ligkungan dan sering

meninggalkan residu yang sulit terurai oleh alam serta berpotensi menimbulkan

keracunan. Bioinsektisida memilki keuntungan yaitu ramah terhadap lingkungan,

relatif aman dari segi kesehatan, mudah terurai di alam sehingga tidak mencemari

lingkungan (Suprapta, 2005).

Berkaitan hal tersebut, diperlukan teknik isolasi dan purifikasi senyawa

azadirachtin dari daun mimba untuk mendapatkan kandungan azadirachtin yang

murni. Isolasi dan purifikasi dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan

metode pemisahan kromatografi cair vakum dan kromatografi lapis tipis. Sebelum

dilakukan pemisahan dengan kromatografi cair vakum dan kromatografi lapis tipis

dilakukan ekstraksi terlebih dahulu dengan metode maserasi yang bertujuan untuk

menarik senyawa azadirachtin yang terdapat dalam daun mimba. Metode maserasi

merupakan metode perendaman sampel dengan pelarut organik, umumnya

digunakan pelarut organik dengan molekul relatif kecil seperti metanol dan

perlakuan pada temperatur kamar sehingga pelarut mudah terdistribusi ke dalam

sel tumbuhan. Penggunaan suhu tinggi memungkinkan terdegradasinya senyawa-

senyawa metabolit sekunder sedangkan metode maserasi menggunakan suhu

kamar sehingga lebih aman. Metode maserasi juga sangat menguntungkan dalam
 15

isolasi senyawa bahan alam karena mudah dan murah (Djaswir, 2004 ; Khan et

al., 2010). Setelah dilakukan ekstraksi, ekstrak yang didapat selanjutnya

dimurnikan kembali dengan KCV. Keunggulan penggunaan KCV dibandingkan

kromatografi kolom biasa terletak pada kecepatan proses sehingga dapat

mengefisiensi waktu pengerjaan, karena proses pengelusian dipercepat dengan

memvakumkan kolom selain itu KCV juga dapat memisahkan sampel dalam

jumlah banyak (Septyaningsih, 2010). Pemilihan metode Kromatografi Lapis

Tipis sebagai metode deteksi kandungan senyawa azadirachtin dikarenakan

metode KLT memiliki beberapa keuntungan yaitu mempunyai prosedur

preparasi sampel serta pengerjaannya yang mudah, konsumsi pelarut

yang relatif sedikit, dapat menganalisis hampir setiap jenis senyawa,

mampu menetapkan dua atau lebih senyawa secara simultan, selektif dan

sensitif serta kromatogramnya dapat diamati secara visual (Cie’sla dan

Hajnos, 2009).

Teknik isolasi dan purifikasi senyawa azadirachtin dengan kromatografi

cair vakum dan kromatografi lapis tipis diharapkan mendapatkan senyawa

azadirachtin dengan kemurnian tinggi, sehingga dapat digunakan sebagai

bioinsektisida yang ramah lingkungan serta dapat dilakukan uji aktivitas

farmakologis lebih lanjut mengingat banyaknya efekfarmakologi yang

ditimbulkan dari penggunaan senyawa azadirachtin.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang, adapun permasalahan yang dapat dirumuskan

adalah sebagai berikut :

 16

1. Bagaimana cara mengisolasi dan mempurifikasi senyawa azadirachtin

dari daun mimba ?

2. Bagiamana kemurnian senyawa azadirachtin dalam daun mimba ?

1.3 Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dilakukannya penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Untuk mengetahui cara mengisolasi dan mempurifikasi senyawa

azadirachtin dari daun mimba.

2. Untuk mengetahui kemurnian senyawa azadirachtin dalam daun mimba.

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini dapat dimanfaatkan sebagai pertimbangan dalam melakukan

isolasi dan pemurnian senyawa azadirachtin yang terkandung dalam daun mimba

untuk uji aktivitas farmakologis lebih lanjut dan bioinsektisida.

17
 18

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Mimba

2.1.1 Deskripsi Tanaman

Tanaman mimba memiliki tinggi batang dapat mencapai 20 m. Kulit tebal,

batang agak kasar, daun menyirip genap, dan berbentuk lonjong dengan tepi

bergerigi dan runcing, sedangkan buahnya merupakan buah batu dengan panjang

1 cm. Buah mimba dihasilkan satu kali setahun pada bulan Desember-Januari,

berbentuk oval, bila masak daging buahnya berwarna kuning, biji ditutupi kulit

keras berwarna coklat dan didalamnya melekat kulit buah berwarna putih.

Batangnya agak bengkok dan pendek, oleh karena itu kayunya tidak terdapat

dalam ukuran besar (Heyne, 1987).

Daun mimba tersusun spiralis, mengumpul di ujung rantai, merupakan

daun majemuk menyirip genap. Anak daun berjumlah genap diujung tangkai,

dengan jumlah helaian 8-16. tepi daun bergerigi dan helaian daun tipis. Bentuk

anak daun memanjang sampai setengah lancet, pangkal anak daun runcing, ujung

anak daun runcing dan setengah meruncing. Helaian anak daun berwarna hijau,

bentuk bulat telur memanjang agak melengkung, panjang helaian daun 5 cm, lebar

3 cm sampai 4 cm. Ujung daun meruncing, pangkal daun miring, tepi daun

bergerigi kasar. Tulang daun menyirip, tulang cabang utama umumnya hampir

sejajar satu dengan lainnya. Tanaman ini dapat diperbanyak melalui stek,

cangkok, dan biji. Tanaman mimba umumnya berbuah pada umur 3-5 tahun, buah

yang dihasilkan dapat mencapai 50 kg per pohon (Girish dan Shankara, 2008).
 19

Gambar 1. Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) (Kapsara dan Akhmadi,

2016)
2.1.2 Taksonomi

Kingdom : Plantae

Ordo : Rutales

Sub ordo : Rutinae

Famili : Meliaceae

Subfamili : Melioideae

Genus : Azadirachta

Spesies : Azadirachta indica

(Girish dan Shankara, 2008).

2.1.3 Kandungan Senyawa Azadirachtin dalam Daun Mimba

Azadirachtin merupakan senyawa yang tidak mudah menguap dan sangat

polar serta merupakan senyawa golongan terpenoid. Senyawa azadirachtin

memiliki serapan UV pada panjang gelombang 212 nm (Palupi dkk., 2016).

Rumus molekul : C35H44O16 Mr : 720,721 g/mol

Gambar 2. Struktur Senyawa Azadirachtin (Jadeja et al., 2011)

 20

Tabel 1. Daftar Rf standar Azadirachtin dari berbagai fase gerak (Yamasaki et al.,
1986 ; Soni et al., 2012)
2.2 Isolasi dan Purifikasi

Isolasi adalah proses pemisahan komponen kimia yang terdapat dalam

suatu ekstrak yang dilakukan ketika ingin mengambil bahan aktif dari ekstrak

kasar (crude extract). Sedangkan purifikasi adalah metode untuk mendapatkan

komponen bahan alam murni bebas dari komponen kimia lain yang tidak

dibutuhkan. Tingkatan kemurnian (purity) suatu struktur senyawa tertentu harus

95-100% (Nugroho dkk., 2013).

2.3 Ekstraksi dengan Maserasi

Ekstraksi merupakan peristiwa perpindahan massa zat aktif dari dalam sel

akibat tertarik oleh cairan penyari. Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa

polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam senyawa non polar (like

dissolves likes) (Depkes RI, 2000). Maserasi dilakukan dengan merendam bahan

baku tanaman (utamanya berbentuk serbuk) dalam wadah tertutup bersifat inert

dengan pelarut yang sesuai, serta didiamkan pada suhu kamar selama minimal 2

hari dengan sesekali dilakukan pengadukan (Azwanida, 2015). Proses ekstraksi

 21

dengan maserasi dikombinasikan dengan pengadukan guna meningkatkan

frekuensi kontak antara sampel dengan pelarut, sehingga proses ekstraksi semakin

optimal (Prasetya dkk., 2020). Apabila kesetimbangan konsentrasi analit antara

sel serbuk tanaman dengan pelarut telah tercapai, maka proses maserasi dapat

dihentikan.

2.4 Kromatografi Cair Vakum (KVC)

Kromatografi cair vakum (KVC) merupakan salah satu metode fraksinasi

yaitu dengan memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih

sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fase diam dan

aliran fase geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fase diam yang digunakan

dapat berupa silika gel atau aluminioum oksida (Ghilsalberti, 2008). Cara kerja

kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering (biasanya

dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh

kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya

rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah

sampai kering dan sekarang siap dipakai (Ghilsalberti, 2008).

2.5 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis merupakan metode pemisahan yang berdasarkan

atas prinsip adsorpsi dan afinitas analit terhadap dua fase yaitu fase diam dan fase

gerak. Fase diam yang umum digunakan pada KLT antara lain silika gel,

alumina, dan selulosa. Sedangkan fase gerak yang digunakan dapat

berupa campuran pelarut yang memiliki kepolaran yang berlawanan

dengan fase diam. Terdapat beberapa sifat-sifat ideal pelarut fase gerak

yang digunakan dalam KLT antara lain:

 22

1. Tersedia dalam bentuk yang sangat murni dengan harga yang

memadai.

2. Bersifat inert atau tidak bereaksi dengan komponen dalam

sampel maupun material fase diam.

3. Memiliki tegangan permukaan dan viskositas yang sesuai.

4. Memiliki titik didih yang rendah untuk memudahkan pengeringan

setelah pengembangan.

5. Mempunyai kelarutan yang ideal pada berbagai campuran.

6. Tidak toksik dan mudah pembuangan limbahnya.

(Rubiyanto, 2017)
 23

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

Isolasi dan purifikasi senyawa azadirachtin dari daun mimba dilakukan

dengan metode Kromatografi Cair Vakum dan Kromatografi Lapis Tipis.

Penelitian dimulai dari pengumpulan sampel, preparasi sampel, uji

skrining golongan terpenoid pada sampel, ekstraksi daun mimba dengan

metode maserasi, pemisahan dengan KCV, penotolan fraksi yang didapat

pada plat KLT, pengelusian plat KLT dengan fase gerak yang sesuai

dengan golongan senyawa yang ingin diidentifikasi, penyemprotan plat

KLT dengan reagen penampak bercak. Hasil data yang diperoleh

dianalisis dengan menggunakan analisis deskriptif sebagai hasil

kemurnian senyawa azadirachtin pada sampel daun mimba.

3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Proses penyiapan sampel, isolasi dan purifikasi senyawa azadirachtin dari

daun mimba dengan Kromatografi cair vakum dan Kromatografi Lapis Tipis serta

analisis data dilakukan di UPT Laboratorium Toksikologi Forensik, Lembaga

Forensik Sains dan Kriminologi Universitas Udayana. Waktu pelaksanaan

penelitian ini dilakukan selama 4 bulan.

3.3 Alat dan Bahan Penelitian

3.3.1 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Erlenmeyer 25

mL, dan 50 mL (Iwaki-Pyrex®), gelas ukur 5 mL, 10 mL, dan 25 mL,50 mL

 24

(Iwaki-Pyrex®), labu ukur 5 mL, 10 mL, dan 25 mL, 50 mL (Iwaki-Pyrex®),

gelas beaker 50 mL dan 100 mL (Iwaki-Pyrex®), pipet ukur 2 mL, 5 mL, 10

mL dan 25 mL (Iwaki-Pyrex®), pipet mikro 1000 µL (eppendorf®),

timbangan analitik (Kern-Alj®), vial 10 mL dan 20 mL, tabung reaksi (Iwaki-

Pyrex®), blender, alumunium foil, bulbfiller, chamber ADC (CAMAG), plat

TLC silica gel GF254, oven (Memmert®), spray, ATS (CAMAG), TLC

Visualizer (CAMAG), spektrofotodensitometer CAMAG TLC Scanner 4,

cawan porselin, vacuum rotary evaporator, vacuum liquid chromatography

(VLC).

3.3.2 Bahan Penelitian

Bahan utama daun mimba (A. indica) diambil dari desa Ubud, Kecamatan

Ubud, Kabupaten Gianyar, Provinsi Bali. Bahan kimia dan pelarut yang

digunakan merupakan bahan kimia teknis dan yang memiliki derajat

kemurnian pro analisis. Pelarut dan pereaksi yang digunakan yaitu etanol

P (Merck®), akuades (Bratacem®), n-heksana (Merck®), kloroform(Merck®),

metanol (Merck®), diklorometana (Merck®), dietil eter (Merck®) dan asam

sulfat pekat P (Merck®). Silica gel dan octadecylsilyl-silica gel (ODS).

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Uji Skrining Fitokimia Golongan Terpenoid

2 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL

etanol didihkan dan disaring. Diambil 5 mL ekstrak kemudian ditambahkan 2

mL kloroform dan 3 mL asam sulfat pekat, lalu diamati perubahannya. Terbentuk

warna cokelat kemerahan pada antarmuka menunjukkan sampel mengandung

senyawa terpenoid (Odeoga, 2005).

 25

3.4.2 Ekstraksi Senyawa Azadirachtin dari Daun Mimba

Daun mimba segar dicuci dengan air kemudian dikeringkan pada suhu

kamar. Selanjutnya daun mimba yang sudah kering dihaluskan hingga menjadi

serbuk. Serbuk kering daun mimba sebanyak 1 kg di maserasi dengan 2

bagian n-heksana selama 24 jam sebanyak 3 kali, dimana setiap 24 jam

pelarut diganti.

Residu diremaserasi kembali dengan 2 bagian metanol. Ekstrak metanol

disaring dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak kental

dilarutkan dalam 2 bagian metanol dan diencerkan secara perlahan dengan 2

bagian akuades sambil diaduk. Campuran metanol dan akuades kemudian

diekstraksi tiga kali dengan 4 bagian n-heksana, diikuti dengan tiga bagian

diklorometana kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator.

3.4.3 Pemisahan dengan Kromatografi Cair Vakum

Ditimbang sejumlah silica gel, kemudian dimasukkan ke dalam kolom

sambil digetar-getarkan. Kolom diekuilibasi dengan campuran dietil eter : metanol

(49: 1). Ekstrak kental hasil maserasi dilarutkan dengan diklorometana

secukupnya dan dimasukkan kedalam kolom. Kolom dielusi dengan dietil eter :

metanol (49 :1) dengan laju alir 25 mL/menit, setiap 20 mL fraksi dipisahkan.

Fraksi yang terbentuk dikumpulkan, dideteksi dengan KLT, kemudian diuapkan

dengan vacuum rotary evaporator.

Ekstrak kental dilarutkan dalam 75 mL akuades : metanol (3 : 2) dan

dimasukkan kedalam kolom yang dikemas dengan octadecylsilyl-silica gel (ODS)

 26

dalam 20 mL akuades : metanol (3 : 2). Fraksi yang terbentuk dikumpulkan,

dideteksi dengan KLT, kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator.

3.4.4 Identifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis

Penelitian ini mengacu pada metode yang telah dikembangkan oleh

Yamasaki et al. (1986). Fase diam yang digunakan yaitu plat KLT silica gel

GF254 dan fase gerak yang digunakan yaitu dietil eter : metanol (49: 1) v/v.

Ekstrak kental yang diperoleh dari proses KCV dideteksi dengan KLT pada

panjang gelombang 254 nm dan 365 nm dan menggunakan penampak bercak

yaitu campuran Vanillin 1% : asam sulfat pekat.

Langkah pertama yang dilakukan yaitu penyiapan plat silica gel GF254

yang akan digunakan. Plat silica gel GF254 dicuci dengan metanol dan

diaktivasi selama 10 menit pada suhu 110°C. Larutan ekstrak hasil KCV

ditotolkan pada plat menggunakan CAMAG Automatic TLC Sampler 4.

Plat dielusi dalam chamber yang telah dijenuhkan menggunakan fase

gerak.

Plat yang telah dielusi kemudian diamati secara visual, baik di bawah

sinar putih, sinar UV 254 nm, dan sinar UV 366 nm dengan CAMAG TLC

Visualizer. Plat KLT yang telah diamati selanjutnya di-scan pada panjang

gelombang 210 nm, 366 nm, serta panjang gelombang maksimum dari

standar azadirachtin dengan Spektrofotodensitometer CAMAG TLC

Scanner 4. Hasil pengamatan berupa kromatogram yaitu data puncak

kemudian di-scan pada rentang panjang gelombang 200-700 nm untuk

memperoleh spektrum masing-masing puncak. Plat KLT selanjutnya

 27

dideteksi dengan pereaksi pendeteksi, diamati kembali di bawah sinar

putih, UV 254 nm dan 366 nm menggunakan TLC Visualizer.

3.5 Analisis Data

Analisis data terhadap kromatogram yang diperoleh pada penelitian ini

tergolong sebagai analisis deskriptif. Analisis data dilaksanakan dengan

membandingkan hasil yang diperoleh pada visualisasi pada plat KLT

sebelum direaksikan dengan pereaksi semprot dan sesudah direaksikan

dengan pereaksi semprot dengan perbandingan hasil berupa spot. Plat

yang belum disemprotkan dengan pereaksi semprot di scan pada panjang

gelombang 210 nm, 366 nm, dan panjang gelombang maksimum dari

standar sehingga akan diperoleh hasil berupa kromatogram atau

densitogram dan nilai Rf masing-masing komponen yang diduga analit.

Hasil densitogram kemudian di scan pada panjang gelombang 200-700

nm agar diperoleh spektrum dari masing-masing puncak pada

kromatogram senyawa yang diduga analit.

3.6 Skema Penelitian

Pengumpulan sampel

Preparasi sampel

Uji skrining fitokimia golongan terpenoid

Pemisahan dengan kromatografi cair vakum

Identifikasi dengan kromatografi lapis tipis

 28

Analisis data

3.7 Jadwal Kegiatan

Tabel 2. Jadwal Kegiatan Penelitian

No. Kegiatan Okt Nov Des Jan
1. Penentuan tema
2. Penelusuran pustaka
3. Penyusunan proposal
4. Pengumpulan sampel
5. Preparasi sampel
6. Uji skrining fitokimia
7. Pemisahan dengan KCV
8. Deteksi dengan KLT
9. Analisis data dan interpretasi hasil
10. Penyusunan laporan akhir
11. Publikasi
Keterangan: Okt=Oktober, Nov=November; Des=Desember; Jan=Januari
29
 30

DAFTAR PUSTAKA

Agus, F. 2011, Mimba (Azadirachta indica) dan Manfaatnya, World Agroforestry

Centre, Jakarta.
Agustin, S.,Asrul. dan Rosmini. 2016, Efektivitas Ekstrak Daun Mimba
(Azadirachta indica A.Juss) Terhadap Pertumbuhan Koloni Alternaria porri
Penyebab Penyakit Bercak Ungu Pada Bawang Wakegi (Allium x wakegi
Araki) Secara In Vitro, e-J. Agrotekbis, 4 : 419-424.
Asif, M. 2012, Antimicrobial Potential of Azadirachta indica Against Pathogenic
Bacteria and Fungi, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 1 :
78–83.
Azwanida, N. N. 2015, A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal
Plants, Principle, Strength and Limitation, Medicinal & Aromatic Plants, 4:
1-6.
Balaji, G. dan Cheralathan, M. 2015, Experimental Investigation of Antioxidant
Effect on Oxidation Stability and Emissions in a Methyl Ester of Neem Oil
Fueled DI Diesel Engine, Renewable Energy, 74 : 910–916
Camag. 2019, CAMAG Derivatizer, Camag Chemie-Erzeugnisse &
Adsorptionstechnik, Switzerland.
Cie’sla, L. dan Hajnos M.W. 2009. Two-Dimensional Thin Layer
Chromatography in The Analysis of Secondary Plant Metabolites, Journal
of Chromatography A. 12:1035−1052.
Depkes RI. 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Direktorat
Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta.
Dewi, A.A.L.N., Karta, I.W., Wati, N.L.C. dan Dewi, A.N.M. 2017, Uji
Efektivitas Larvasida Daun Mimba (Azadirachta indica) terhadap Larva
Lalat Sarcophaga pada Daging untuk Upacara Yadnya di Bali. Jurnal Sains
dan Teknologi, 6: 126-135.
Djaswir, D. 2004, ‘Teknik Penelitian Kimia Bahan Alam’, Workshop Peningkatan
Sumber Daya Manusia Penelitian dan Pengelolaan Sumber Daya Hutan
yang Berkelanjutan, FMIPA Universitas Andalas, Padang, 13-19 Juni.
Ghisalberti, E.L. 2008, Detection and Isolation of Bioactive Natural Products
dalam Bioactive Natural Product: Detection, Isolation and Structural
Determination 2nd Edition, CRC Press, New York:
Girish, K. and Shankara, B.S. 2008, Neem – A Green Treasure. Electronic
Journal of Biology, 4 : 102-111.
Heyne, K. 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid III, Badan Penelitian dan
Pengembangan Kehutanan, Jakarta.
Indiati, S.W. dan Marwoto. 2008, Potensi Ekstrak Biji Mimba Sebagai Insektisida
Nabati, Buletin Palawija, 15 : 9-14.
Jadeja. G.C., Maheshwari, R.C. and Naik, S.N. 2011, Extraction of Natural
Insecticide Azadirachtin from Neem (Azadirachta indica A.Juss) Seed
Kernels Using Pressurized Hot Solvent, The Journal of Supercritical Fluids,
56 : 253-258.
Kapsara, L dan Akhmadi, A. N. 2016, Ekstrak Daun Mimba Terhadap Mortalitas
Hama Belalang Kembara, Jurnal Biologi dan Pembelajaran Biologi, 1 : 56-
68.
 31

Khan, I., Srikakolupu, S.R., Darsipudi, S., Gotteti, S.D. and Amaranadh, H. 2010,
Phytochemical Studies and Screening of Leaf Extracts of Azadirachta
indica for its Anti-microbial Activity Against Dental Pathogens, Archives of
Applied Science Research, 2 : 246 - 250.
Nugroho, A.E., Malik, A. dan Pramono, S. 2013, Total Phenolic and Flavonoid
Contents and In Vitro Antihypertension Activity of Purified Extract of
Indonesia Cashew Leaves (Anacardium occidentale L.), International Food
Research Journal, 20 : 299-305.
Odeoga, H. O., Okwu, D. E. and Mbaebie, B. O. 2005, Phytochemical
Constituents of Some Nigerian Medicinal Plants, African Journal of
Biotechnology, 4 : 685-688.
Palupi, D., Kusdiyantini, E., Rahadian, R. dan Prianto, A. H. 2016, Identifikasi
Kandungan Senyawa Fitokimia Minyak Biji Mimba (Azadirachta indica, A.
Juss), Jurnal Biologi, 5 : 23-28.
Prasetya, I. W. G. A., Putra, G. G., dan Wrasiati, L. P. 2020, Pengaruh Jenis
Pelarut dan Waktu Maserasi terhadap Ekstrak Kulit Biji Kakao (Theobroma
cacao L.) sebagai Sumber Antioksidan, Jurnal Rekayasa dan Manajemen
Agroindustri, 8: 150-159.
Razak, M.S.B.A. dan Kusuma, S.A.F. 2018, Artikel Review : Efek Farmakologi
Minyak Neem (Azadirachta indica, A.Juss), Farmaka, 17: 64-78.
Rusdi, A. 2009, Efektivitas Ekstrak Nimba dalam Pengendalian Ulat Grayak
(Spodoftera litura F.) Pada Tanaman Selada, J. Floratek, 4 : 41-54.
Sari, K.P. dan Suharsono. 2014, Efikasi: Insektisida Nabati dalam Mengendalikan
Kutu Kebul, Bemisia tabaci Genn). (Homoptera: Aleyrodidae), Widyariset,
17 : 219-266.
Septyaningsih, D. 2010. Isolasi dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak Biji
Buah Merah (Pandanus conoideus Lamk), Skripsi, Fakultas MIPA,
Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Soni, H., Mishra, K., Sharma, S. dan Singhai, A.K. 2012, Charaterization of
Azadirachtin from Ethanolic Extract of Leaves of Azadirachta indica,
Journal of Pharmacy Research, 5 : 199-201.
Sulistyoningrum, E. 2010, Tinjauan Molekuler dan Aspek Klinis Resistensi
Insulin, Mandala of Health, 4 : 132-133.
Suprapta, D.N. 2005, Pertanian Bali Dipuja Petaniku Merana, Taru Lestari
Foundation, Denpasar.
Supriyanto, Simon, B.W., Rifa, I. M. dan Yunianta. 2017. Uji Fitokimia dan
Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Mimba (Azadiracta indica Juss),
Prosiding SNATIF, 4 : 523-529.
Wahjuni, S., Puspawati, N.M. dan Arista, N.P.R.E. 2016, Isolasi dan Identifikasi
Senyawa Aktif Antijamur dari Daun Mimba (Azadiractha Indica A. Juss.)
sebagai Pengendali Jamur Fusarium sp. pada Tanaman Buah Naga
(Hylocereus sp.), Jurnal Kimia, 10 : 197-203
Yamasaki, R.B., Klocke, J.A., Lee, S.M., Stone, G.A. and Darlington, M.V. 1986,
Isolation and Purification of Azadirachtin from Neem (Azadirachta indica)
Seeds Using Flash Chromatography and High Performance Liquid
Chromatography, Journal of Chromatography, 356 : 220-226.
 32

Lampiran 1. Cara Pembuatan Fase Gerak

a. Fase gerak Akuades : Metanol (3 : 2) v/v

Dipipet 12 mL akuades menggunakan pipet ukur, dimasukkan kedalam labu

ukur 20 mL. Ditambahkan metanol sebanyak 8 mL ke dalam labu ukur yang

sama. Digojog campuran hingga homogen.

b. Fase gerak Dietil eter : Metanol (49: 1) v/v

Dipipet 24,5 mL dietil eter menggunakan pipet ukur, dimasukkan kedalam

labu ukur 25 mL. Ditambahakan metanol sebanyak 0,5 mL ke dalam labu ukur

yang sama. Digojog campuran hingga homogen.

 33

Lampiran 2. Cara Pembuatan Pereaksi Warna

a. Reagen Vanilin 1% - Asam Sulfat Pekat

Dilarutkan 1 gram Vanillin dalam 100 mL etanol 96% dan ditambahkan secara

hati-hati 2 mL asam sulfat pekat (Camag, 2019).