DETEKSI GEN GLUKOKINASE PADA PENDERITA PENYAKIT

DIABETES MELITUS TIPE 2

KARYA TULIS ILMIAH

DISUSUN OLEH:

ARSHY AL AZZARY

411119117

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS (D3)

FAKULTAS ILMU DAN TEKNOLOGI KESEHATAN
UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI
2022

i
DETEKSI GEN GLUKOKINASE PADA PENDERITA PENYAKIT

DIABETES MELITUS TIPE 2

KARYA TULIS ILMIAH

DISUSUN OLEH:

ARSHY AL AZZARY

411119117

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS (D3)

FAKULTAS ILMU DAN TEKNOLOGI KESEHATAN
UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI
2022

ii
 LEMBAR PENGESAHAN

DETEKSI GEN GLUKOKINASE PADA PENDERITA PENYAKIT

DIABETES MELITUS TIPE 2

Oleh

ARSHY AL AZZARY

411119117

Setelah membaca tugas akhir dengan seksama, menurut pertimbangan kami telah

memenuhi persyaratan ilmiah sebagai suatu tugas akhir.

Cimahi, 18 April 2022

Menyetujui,

Pembimbing Utama Pembimbing Pendamping

Fini Ainun Qolbi W, M.Si Sitti Romlah, M.Si

NIDN. 0416089003 NIDN. 412121775

Mengetahui,

Dekan Fakultas Ilmu dan Ketua Program Studi

Teknologi Kesehatan Teknologi Laboratorium Medis (D3)

Dr. Gunawan Irianto, dr., M.Kes Iis Herawati, S.Pd,M.Kes

NIDN. 8840070018 NIDN. 412120573
LEMBAR PERNYATAAN BEBAS PLAGIASI
Nama : Arshy Al Azzary
NIM : 411119117

iii
Program Studi : Teknologi Laboratorium Medis
TUGAS AKHIR TERSEBUT DI ATAS TELAH DICEK PLAGIASI
OLEH TIM TURNITIN PROGRAM STUDI , DISETUJUI OLEH
PEMBIMBING, SERTA DIPERKENANKAN UNTUK DILANJUTKAN
PROSES CETAK DAN UNGGAH MANDIRI

Cimahi, 04 Juli 2022

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

Nama : Arshy Al Azzary

iv
NPM : 411119117
Program Sudi : Teknologi Laboratorium Medis (D3)
Judul KTI : Deteksi Gen Glukokinase pada penderita Diabetes Melitus
Tipe 2

Demi pengembangan ilmu pengetahuan , menyetujui untuk memberikan kepada

Universitas Jenderal Achmad Yani Cimahi Hak Bebas Royalti Nonekslusif
(Non-exclusive Royalty-Free Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul:

Deteksi Gen Glukokinase pada penderita Diabetes Melitus Tipe 2

Beserta perangkat yang ada (Jika diperlukan) dengan Hak Bebas Royalti Non-
ekskutif ini, Universitas Jenderal Achmad Yani Cimahi berhak menyimpan ,
mengalih media/format-kan, mengelola dalam bentuk pangkalan data
(database), merawat dan mempublikasikan tugas akhir saya selama tetap
mencantumkan nama saya sebagai penulis/pencipta dan sebagai pemilik hak
cipta. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Cimahi, 04 Juli 2022

PROGRAM STUDI ILMU TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS (D-3)

FAKULTAS ILMU DAN TEKNOLOGI KESEHATAN UNJANI 2022

ARSHY AL AZZARY

v
DETEKSI GEN GLUKOKINASE PADA PENDERITA DIAETES MELITUS TIPE
2
XI+30 hal +4 tabel + 1 gambar

ABSTRAK

Glukokinase (GCK) adalah enzim kunci dalam regulasi pelepasan insulin

di sel β pankreas. Ini dikodekan oleh gen glukokinase yang terletak di kromosom
7p 15.3 – p15.1 yang terdiri dari 10 ekson dan mencangkup 45,168 bp. Kelainan
dalam GCK akibat mutasi gen akan mengganggu homeostatis glukosa yang
menyebabkan hiperglikemia dan hipoglikemia. Mutasi inaktivasi menyebabkan
GCK- MODY sementara mutasi homozigot atau senyawa heterozigot
menghasilkan fenotip yang lebih parah dari DM neonatal permanen..
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode
eksperimental..
Pada penelitian ini menggunakan 3 sampel darah DM dan 3 sampel
darah orang normal sampel darah dilanjutkan isolasi DNA menggunakan kit
gSYNC DNA Extraction hasil eletroforesis menunjukan pita DNA ditandai dengan
terdapat 12 pita DNA Hasil uji kuantitatif sampel DNA pada kemurniaan adalah
antara 1,17 hingga 1,23 dan hasil konsentrasi DNA yaitu ˂9,85 ng/µL 12 sampel.
Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa gen
Glukokinase pada sampel darah dapat diamplifikasikan menggunakan metode
PCR dengan adanya pita DNA gen Glukokinase.
Berdasarkan kesimpulan diatas dapat diberikan beberapa rekomendasi
untuk dikaji dan ditindak lanjuti untuk penelitian selanjutnya yaitu :pada penelitian
selanjutnya disarankan melakukan amplifikasi untuk melihat polimorfisme gen
glukokinase gen Glikokinase pada DiabetesMelitus tipe 2. untuk penelitian
selanjutnya , disarankan untuk melakukan pemeriksaan kadar DNA pada pasien
DM dan jumlah copy gen Glukoinase.
Kata Kunci : Gen Glukokinase, DM, Realtime PCR.
Kepustakaan : 12, 2013, 2020.

MEDICAL LABORATORY SCIENCE TECHNOLOGY STUDY PROGRAM (D-3)

vi
FACULTY OF HEALTH SCIENCE AND TECHNOLOGY UNJANI 2022

ARSHY AL AZZARY
DETEKSI GEN GLUKOKINASE PADA PENDERITA DIAETES MELITUS TIPE
2
XI+30 hal +4 tabel + 1 gambar

ABSTRAK

Glucokinase (GCK) is a key enzyme in the regulation of insulin release in

pancreatic cells. It is encoded by the glucokinase gene located on chromosome
7p 15.3 – p15.1 which consists of 10 exons and spans 45.168 bp. Abnormalities
in GCK due to gene mutations will disrupt glucose homeostasis causing
hyperglycemia and hypoglycemia. Inactivation mutations cause GCK-MODY
while homozygous or compound heterozygous mutations result in a more severe
phenotype of permanent neonatal DM.
The method used in this research is the experimental method.
In this study using 3 blood samples of DM and 3 blood samples of normal
people, blood samples were continued with DNA isolation using the gSYNC DNA
Extraction kit. Electrophoresis results showed DNA bands were marked with 12
DNA bands. The quantitative test results of DNA samples on purity were between
1.17 to 1, 23 and the result of DNA concentration was 9.85 ng/µL 12 samples.
Based on the results of this study, it can be concluded that the
glucokinase gene in blood samples can be amplified using the PCR method in
the presence of glucokinase gene DNA bands.
Based on the conclusions above, several recommendations can be given
to be studied and followed up for further research, namely: in further research it is
recommended to amplify to see the glucokinase gene polymorphism of the
Glycokinase gene in type 2 diabetes mellitus. Glucoinase gene copy.
Keywords: Glucokinase, DM, Realtime PCR.
Bibliography : 12, 2013, 2020

vii
viii
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT, karena rahmat dan
hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Penggunaan
Minyak Kayu Putih sebagai Clearing agent pada Preparat Ginjal yang diwarnai
dengan pewarnaan Periodic Acid Schiff”.

Penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak, oleh
karena itu penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada :

1. Bapak Gunawan Irianto, dr,.M.Kes.,(MARS) selaku Dekan Fakultas Ilmu

dan Teknologi Kesehatan Univesitas Jenderal Achmad Yani Cimahi.
2. selaku Ketua Program Studi D3 Teknologi Laboratorium Medis
Universitas Jenderal Achmad Yani Cimahi.

ix
3. Ibu Fini Ainun Qolbi W, M.Si selaku dosen pembimbing I yang telah
banyak membantu dan meluangkan waktu, ilmu, pikiran serta
perhatiannya untuk membimbing penulisan skripsi ini dengan sangat baik.
4. selaku pembimbing II. Terimakasih atas waktu, ilmu, serta masukan yang
berharga hingga skripsi ini dapat di selesaikan dengan sangat baik
5. selaku penguji. Terimakasih atas waktu, ilmu serta masukan yang berharga
hingga skripsi ini dapat di selesaikan dengan sangat baik.
6. selaku Pembimbing Akademik. Terimakasih atas waktu, ilmu, serta
masukan yang berharga hingga skripsi ini dapat di selesaikan dengan
sangat baik.
7. Kedua orang tua saya Ayahanda Irawan Hemayadi dan Ibunda Iceu
Kusmiati yang senantiasa memberikan dukungan, semangat serta do’a.
8. serta adik saya tercinta Qeyra Al Azzura yang selalu memberikan
semangat yang senantiasa memberikan dukungan, bantuan, semangat serta
do’a.
9. Sahabat-sahabat memberikan dukungan, bantuan dan semangat selama
penulis menyusun skripsi ini serta kebaikan-kebaikannya selama penulis
menempuh pendidikan.
10. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi ini.
Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan kepada pihak yang
telah membantu. Penulis juga mengetahui bahwa skripsi tidaklah
sempurna, namun penulis berharap skripsi ini dapat memberikan manfaat
bagi pembaca.

Cimahi, 04 Juli 2022

Penulis

x
11
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI........................................................................................................... i
DAFTAR TABEL..................................................................................................iii
DAFTAR GAMBAR.............................................................................................iv
BAB I PENDAHULUAN.......................................................................................1
A. Latar Belakang..............................................................................................1
B. Rumusan Masalah........................................................................................2
C. Tujuan Penelitian..........................................................................................3
D. Manfaat Penelitian........................................................................................3
1. Manfaat Teoritis.........................................................................................3
2. Manfaat Praktis..........................................................................................3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA..............................................................................4
A. Diabetes Melitus...........................................................................................4
B. Diabetes Melitus Tipe 2................................................................................4
C. Gen Glukokinase..........................................................................................5
D. Isolasi DNA...................................................................................................6
E. Polymerase Chain Reaction (PCR)...............................................................7
1. Definisi polymerase Chain Reaction..........................................................7
2. Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR).........................................7
F. Elektroforesis................................................................................................8
BAB III METODOLOGI PENELITIAN................................................................10
A. Metode Penelitian.......................................................................................10
B. Skema Penelitian........................................................................................10
C. Variabel Penelitian......................................................................................11
D. Definisi Operasional....................................................................................11
1. Gen Glukokinase.....................................................................................11
2. Diabetes Melitus (DM).............................................................................11
E. Populasi dan sampel penelitian..................................................................11
1. Populasi...................................................................................................11
2. Sampel....................................................................................................11
F. Alat dan Bahan...........................................................................................12
G. Prosedur Penelitian....................................................................................13

i
H. Pengumpulan dan Analisis Data.................................................................16
I. Etika Penelitian............................................................................................16
1. Prinsip Etika Menghormati Harkat Martabat Manusia (Respect for
person)....................................................................................................16
2. Prinsip Etik berbuat baik (Beneficence) dan tidak merugikan (Non
Benficence)..............................................................................................16
3. Prinsip Etika Keadilan (Justice)...............................................................17
J. Waktu dan Tempat Penelitian......................................................................17
1. Waktu Penelitian......................................................................................17
2. Tempat Penelitian....................................................................................17

ii
 DAFTAR TABEL

Tabel 3. 1 Alat yang digunakan.....................................................................12

Table 3.2 Bahan yang digunakan..................................................................12

iii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 3.1 Rancangan Penelitian.................................................10

iv
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Diabetes Melitus (DM) merupakan salah satu dari sepuluh penyebab

utama kematian di dunia bersama dengan tiga penyakit mayor Non

Communicable Diseases (NCDs) atau penyakit tidak menular lainnya, yaitu

penyakit kardiovaskuler, kanker, dan penyakit pernapasan). Penyakit ini khas

ditandai dengan hiperglikemia,onset usia muda (sebelum 25 tahun),

diturunkan secara autosomal dominan dan tidak dihubungkan dengan

resistensi insulin. (Widodo & Kurniawan, 2014).

Diabetes melitus (DM) merupakan penyakit yang tidak menular yang

disebabkan oleh kerusakan pankreas atau berkurangnya insulin yang

diproduksi oleh pankreas sehingga terjadi peningkatan kadar gula didalam

darah atau resisten insulin yang menjadi masalah kesehatan terbesar di dunia

saat ini yang menjadi salah satu faktor penyebab turunnya kualitas sumber

daya manusia. Pada dasarnya diabetes terbagi menjadi beberapa tipe

diantaranya adalah Diabetes Melitus tipe II dengan prevalensinya tiap tahun

berjumlah 1994 orang, penderita diabetes dunia sebanyak 110,4 juta dan

meningkat pada tahun 2015 menjadi 175,4 juta atau sekitar 1,5 kali lipat, pada

tahun 2017 menjadi 366 juta sebagai kecatatan, kesakitan dan kematian

(Kesehatan & Husada, 2020).

Diabetes Melitus (DM) tipe 2 memiliki hubungan genetik lebih besar

dari tipe 1 DM. Efek lingkungan merupakan suatu faktor yang menyebabkan

tingkat diabetes tipe 2 lebih tinggi daripada DM tipe 1. Studi genetika

molekular pada diabetes tipe 2, menunjukkan bahwa mutasi pada gen insulin

1
 2

mengakibatkan sintesis dan sekresi insulin yang abnormal, keadaan ini disebut

sebagai insulinopati. Sebagian besar pasien dengan insulinopati menderita

hiperinsulinemia, dan bereaksi normal terhadap administrasi insulin eksogen.

Gen reseptor insulin terletak pada kromosom yang mengkodekan protein yang

memiliki alfa dan subunit beta, termasuk domain transmembran dan domain

tirosin kinase. Mutasi mempengaruhi gen reseptor insulin telah diidentifikasi

dan asosiasi mutasi dengan diabetes tipe 2 dan resistensi insulin tipe A telah

dipastikan.

Glukokinase merupakan mengkode enzim glukoinase yang berfungsi

dalam metabolisme glukosa. Proses akhir metaboslisme glukosa pada

mitokondria sel β-pankreas menghasilkan ATP yang berperan pada sekresi

insulin (Fajans, 2020).

Pada penelitian ini glukokinase (GCK) adalah enzim kunci dalam

regulasi pelepasan insulin di sel β pankreas. Ini dikodekan oleh gen

glocukinase yang terletak di kromosom 7p15.3 _p15,1 yang terdiri dari 10

ekson dan mencangkup 45,168 bp. Kelainan dalam GCK akibat mutasi gen

akan mengganggu homeostasis glukosa yang menyebabkan hiperglikemia

dan hipoglikemia. (Lio & Sugireng, 2019).

Berdasarkan latar belakang diatas maka peneliti berkeinginan melakukan

penelitian deteksi gen glukokinase pada penderita penyakit diabetes melitus.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian latar belakang diatas, maka didapatkan rumusan

masalah penelitian ini adalah “Apakah gen glukokinase dapat ditemukan pada

penderita Diabetes Melitus tipe 2?”

 3

C. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini untuk mengetahui Bagaimana hasil deteksi gen

glukokinase pada penderita diabetes melitus tipe 2.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat Teoritis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan wawasan dan

pengetahuan baru mengenai identifikasi gen glukokinase pada sampel

darah penderita diabetes melitus Tipe 2.

2. Manfaat Praktis

Dapat dijadikan prosedur untuk deteksi Gen Glukokinase pada

penderita diabetes melitus Tipe 2.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Diabetes Melitus

Diabetes adalah penyakit kronis serius yang terjadi karena pankreas

tidak menghasilkan cukup insulin (hormon yang mengatur gula darah atau

glukosa), atau ketika tubuh tidak dapat secara efektif menggunakan insulin

yang dihasilkannya. Diabetes adalah masalah kesehatan masyarakat yang

penting, menjadi salah satu dari empat penyakit tidak menular prioritas yang

menjadi target tindak lanjut oleh para pemimpin dunia. Jumlah kasus dan

prevalensi diabetes terus meningkat selama beberapa dekade terakhir. (OMS,

2016).

Diperkirakan terdapat 463 juta orang dengan usia 20-79 tahun di dunia

menderita diabetes atau setara dengan 9,3% dari seluruh penduduk di usia

yang sama pada tahun 2019. Berdasarkan usia, pada orang dengan usia 65-

79 diperkirakan terdapat 19,9% pada tahun 2019 dan diprediksi meningkat

menjadi 20,4% pada tahun 2030 dan 20,5% pada tahun 2045.Prevalensi

diabetes pada tahun 2019 sebanyak 9% wanita dan 9,6% laki-laki. Angka

diprediksi akan meningkat hingga 578,4 juta di tahun 2030 dan 700,2 juta di

tahun 2045. (Diabetes International, 2019)

B. Diabetes Melitus Tipe 2

Diabetes melitus tipe 2 (DMT2) merupakan penyakit metabolik yang

ditandai dengan tingginya kadar glukosa darah (hiperglikemia) yang

disebabkan oleh defiensi sekresi dan atau insufiensi fungsi insulin. Penderita

DMT2 umumnya mengalami komplikasi serius pada jantung. Pembuluh darah,

mata, ginjal, sistem syaraf dan gigi. Prevalensi DMT2 di dunia pada tahun

4
 5

2020 sekitar 9.3% Indonesia urutan ketujuh dengan perkiraan jumlah pasien

DM sekitar 10.7 juta pada tahun 2019 dan diprediksi menjadi 13.7 juta pada

tahun 2030.gen yang memiliki asosiasi terkuat dengan DMT2 adalah

transcription factor 7 like 2 (TCF7L2). Gen TCF7L2 mengkode faktor

transkripsi high mobility Group (HMG) yang berperan dalam jalur sinyal

memproduksi hormon inkretin yang mengontrol ekspresi dan fungsi beberapa

hormon yang penting pada homeostatis glukosa seperti GLP-1, GIP dan

insulin. Diabetes Melitus merupakan salah satu penyakit yang dapat

diturunkan pada saat ini dengan angka kejadian yang paling banyak terjadi

selain penyakit jantung dan stroke (Badriyya & Achyar, 2020).

Diabetes Melitus adalah sekumpulan gejala yang timbul pada

seseorang yang disebabkan oleh karena adanya peningkatan kadar gula

dalam darah akibat kurangnya insulin baik absolut maupun relative

(soegondo, 2009).

C. Gen Glukokinase

Glukokinase (GCK) adalah enzim kunci dalam regulasi pelepasan

insulin di sel β pankreas. Ini dikodekan oleh gen glukokinase yang terletak di

kromosom 7p 15.3 – p15.1 yang terdiri dari 10 ekson dan mencangkup 45,168

bp. Kelainan dalam GCK akibat mutasi gen akan mengganggu homeostatis

glukosa yang menyebabkan hiperglikemia dan hipoglikemia. Mutasi inaktivasi

menyebabkan GCK- MODY sementara mutasi homozigot atau senyawa

heterozigot menghasilkan fenotip yang lebih parah dari DM neonatal

permanen.

Sebaliknya mutasi aktivasi heterozigot menyebabkan hipoglikemia

hiperinsulinemik yang persinten pada bayi (Gloyn et al., 2003; Osbak et al.,
 6

2009; DeFronzo et al., 2015) . Ada 620 mutasi berbeda yang ditemukan pada

1441 keluarga dalam 10 ekson (ekson 1-10) dari gen GCK yang diekpresikan

dalam sel b pankreas. Meskipun mutasi patogen GCK heterozigot beragam,

mereka semua mengarah ke fenotip yang sama yakni hiperglikemia puasa

ringan.(Osbak et al., IDF, 2017).

D. Isolasi DNA

Isolasi DNA dari darah dilakukan dengan melisiskan sel darah merah

yang tidak mengandung DNA genom agar dapat dipisahkan dari sel darah

putih. Sel-sel darah darah putih yang sudah dipisahkan kemudian dilisiskan

dengan bantuan bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang dapat

melarutkan komponen selular. Bila perlu dapat ditambahkan RNase untuk

menyingkirkan kontaminasi RNA. Selanjutnya dengan presipitasi garam, DNA

genom dipisahkan dari protein plasma dan inti. Akhirnya DNA genom diisolasi

dan pelarutan kembali endapan yang terbentuk dari larutan dapar yang

mengandung suatu bahan pengawet DNA. Disamping menggunakan sampel

darah segar utuh, isolasi DNA juga dapat dilakukan hanya terhadap sel darah

putih. Sampel darah WB yang masih segar langsung dipisahkan menjadi

serum, sel darah merah , dan sel darah putih (di lapisan buffy coat) dengan

teknik sentrifugasi.

Buffy coat adalah konsentrat DNA yang terkandung dalam sel darah

putih. Setelah sentrifugasi sampel darah total akan terbagi menjadi tiga

lapisan, yaitu lapisan paling atas merupakan serum, lapisan tengah berwarna

putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel

darah merah. Masing-masing buffy coat yang telah diperoleh kemudian

ditambahkan PBS hingga volume mencapai 200ul, kemudian sampel

 7

disimpan pada suhu -80◦C. keuntungan penyimpanan sampel dalam bentuk

buffy coat yaitu sampel dapat disimpan lebih lama dan stabil, bahkan masih

dapat digunakan untuk analisis genetic sesudah penyimpanan. Namun

demikian, untuk mendapatkan buffy coat yang jumlahnya banyak, maka

sampel darah segar yang dibutuhkan lebih banyak pula.

E. Polymerase Chain Reaction (PCR)

1. Definisi polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu metode enzimatis

untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali

dikembangkan pada tahun 1985 oleh kary B. Mullis (K. Yusuf, 2010).

(PCR) salah satu teknik untuk mempelajari biologi molekuler, metode ini

sangat sensitif. (Widowati, 2013). PCR sekarang menjadi teknik umum dan

sering digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi untuk

berbagai aplikasi (Basyar, 2012). Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan

bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipat gandakan harus

diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipat gandaan tersebut dapat

dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan

primer, yaitu sekuen oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali

sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polymerase (Widowati, 2013).

2. Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama, yaitu

DNA cetakan, oligonukleotida primer, Deoksiribonukleotida trifostat

(DNTP), enzim DNA Polimerase , dasn komponen pendukung lain, yaitu

senyawa buffer. Pada proses PCR menggunakan alat thermalcycler,

sebuah mesin tabung reaksi dan mengatur temperatur untuk tiap tahapan
 8

reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang

dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat yaitu denaturasi,

anneling, dan pemanjangan untai DNA. Produk pcr dapat diidentifikasi

melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa

(K.Yusuf, 2010).

Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama, yaitu :

a. DNA cetakan , yaitu fragmen DNA yang akan dilipat gandakan, DNA

cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 1010 molekul.

Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.

b. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek ( 18

– 25 basa nukleotida ) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai

DNA. Dan mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60 %.

c. Deoksiribonukleotida trifosfat (DNTP), terdiri dari

DATP,DCTP,DGTP,DTTP,DNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat

mengubah konsentrasi efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi

polimerase.

F. Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu analisis kimiawi yang didasarkan pada

pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik

isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan medan listrik dipengaruhi oleh

bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Titrawani, 2015).

Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul

dan muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus

listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein
 9

plasma maka komponen – komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi

(Ricardson, eat al., 2015).

Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan yang

memanfaatkan medan listrik yang dihasilkan elektroda-elektroda untuk

memisahkan senyawa-senyawa yang memiliki muatan berupa kation dan

anion. Elektroforesis membutuhkan media pemisah berupa fase diam seperti

sel agarosa yang tercampur larutan buffer untuk menjaga kondisi keasaman

sampel saat proses pemisahan. Alat ini sangat mendukung keterbaruan

penelitian khususnya dibanding teknologi rekayasa genetika. Hasilnya akan

memberikan rekam jejak berupa pita-pita pemisahan senyawa. Kecepatan

gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muata terhadap massanya,

serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. (bintang M. 2010)

10
 BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode eksperimental.

B. Skema Penelitian

Skema penelitian ini dapat dilihat pada gambar berikut:

Informed consent

Pengambilan sampel darah

penderita Diabetes Melitus

Isolasi DNA metode

Spin colomn

Amplifikasi metode PCR

Uji kualitatif menggunakan

metode elektroforesis

Gambar 3.1 Rancangan Penelitian

11
 12

C. Variabel Penelitian

1. Variabel terikat : Gen Glukokinase

2. Variabel bebas : Pasien Penderita Diabetes Melitus Tipe 2

D. Definisi Operasional

1. Gen Glukokinase

Gen Glukokinase adalah gen yang menentukan bagaimana tubuh

memproduksi enzim pencernaan dengan kecacatan genetika, tubuh bisa

memproduksi cukup insulin pada mulanya untuk menjaga fungsi – fungsi

tubuh berjalan dengan baik.

2. Diabetes Melitus (DM)

Diabetes Melitus (DM) merupakan pemeriksaan glukosa darah

(hiperglikemia) Kronik diserai berbagai kelainan metabolik akibat

gangguan hormonal berupa gangguan ketersediaan insulin ataupun

pemanfaatan insulin dalam tubuh.

E. Populasi dan sampel penelitian

1. Populasi

Populasi yang diambil dalam penelitian ini adalah pasien Diabetes

Melitus (DM) di Rumah Perawatan Luka DM di Kota Cimahi.

2. Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 5 Pasien

pada penderita DM di Rumah Perawatan Luka DM di Kota Cimahi.

1. Penderita DM dengan hasil pemeriksaan glukosa >150gr/dl.

2. Usia dewasa : 21- 40 tahun

 13

F. Alat dan Bahan

Tabel 3. 2 Alat yang digunakan

No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah

1. Elektroforesis Apparatus Cleaver 1 buah
(111101473)
2. Erlenmeyer Pyrex, 50 mL 1 buah
3. Gelas Ukur Pyrex 1 buah
Pyrex 1 buah
4. Thermal Cycler 0 1 buah
5. Mikropipet 0,5-10 µ 1 buah
10-100µ 1 buah
6. UV transiluminator - 1 buah

Table 3.2 Bahan yang digunakan

No. Nama Bahan Spesifikasi Jumlah

1. Agarose 2% -

2. Alkohol 70% -

3. Buffer PCR - G.

4. ddH₂ O - P

5. dNTPs
6. Isolat DNA
7. Loading Dye 10 µL
8. Marker 12 µl
9. Microtube PCR
10. Parafilm 10x20cm 1

11. Primer Forward -

12. Primer reverse 1 Buah

13. TAE 1 Buah

14. Taq polymerase 50

rosedur Penelitian
 14

1. Prosedur pengambilan darah

Teknik pengambilan darah vena (WHO, 2010)

1) Persiapkan peralatan, termasuk jarum suntik atau tabung

2) Cuci tangan (jika menggunakan sabun dan air, keringkan dengan

kertas tisu) dan gunakan sarung tangan.

3) Mengidentifikasi dan melakukan persiapan untuk pasien.

4) Pilih daerah yang akan ditusuk, sebaiknya didaerah antecubital (lipatan

siku). Lakukan palpasi untuk menumukan daerah vena yang terlihat

atau menonjol. Jangan menyentuh daerah yang akan ditusuk apabila

sudah diberikan alcohol atau antiseptik lainnya.

5) Pasang tourniquet sekitar 4-5 jari diatas daerah venipuncture yang

dipilih.

6) Minta pasien untuk mengepalkan tangan sehingga pembuluh darah

lebih terlihat atau menonjol.

7) Mensterilkan daerah yang akan ditusuk dengan menggunakan alkohol

70% selama 30 detik dan biarkan kering.

8) Pegang lengan pasien agar vena tidak bergerak dan menempatkan ibu

jari di bawah daerah venepuncture dan tusuk jarum ke vena dengan

cepat pada sudut 300.

9) Setelah jumlah darah yang dikehendaki cukup, lepaskan tourniquet

sebelum menarik jarum.

10) Tarik jarum dengan hati – hati dan tekan daerah yang telah ditusuk

menggunkan kapas kering.

11) Pindahkan darah dari spuit ke tabung dan beri identitas pasien

a. Isolasi DNA Metode Kit gSYNC (Lot No.SE22205-B)

 15

1) Siapkan spesimen darah, ambil 300 μL masukkan pada

microtube 1,5 mL

2) Ditambahkan 200 μL PBS dan 20 μL Proteinase K dan

campurkan dengan menggunakan mikropipet.

3) Kemudian inkubasi pada 60 ⁰C selama 5 menit

4) Setelah itu tambahkan 200 μL GBS Buffer dan campurkan

dengan vortex.

5) Sampel kemudian diinkubasi kembali pada 60 ⁰C selama 20

menit. Microtube dibolak-balikkan setiap 5 menit. Selama

inkubasi, masukkan 200 μL Elution Buffer ke dalam microtube

1,5 mL baru dan inkubasi pada 60 ⁰C.

6) Ditambahkan 200 μL etanol absolut ke dalam sampel dan

dicampur dengan vortex selama 10 detik.

7) Diletakkan GS Column ke dalam collection tube.

8) Dipindahkan seluruh sampel ke dalam GS Column.

9) Sentrifugasi pada 14.000 x g selama 1 menit, buang collection

tube beserta larutan di dalamnya.

10) Diletakkan GS Column ke dalam collection tube baru.

11) Ditambahkan 400 μL W1 Buffer ke dalam GS Column dan

sentrifugasi pada 14.000 xg selama 30 detik.

12) Cairan yang tertampung dalam collection tube dibuang,

kembalikan GS Column ke collection tube kembali.

13) Ditambahkan kembali W1 Buffer ke dalam GS Column sebanyak

600 μL dan sentrifugasi pada 14.000 x g selama 30 detik.

 16

14) Cairan tertampung dalam collection tube dibuang, kembalikan

GS Column ke collection tube.

15) Sentrifugasi GS Column pack pada 14.000 x g selama 3 menit.

16) Dipindahkan GS Column ke microtube 1,5 mL baru.

17) Ditambahkan 40 μL Elution Buffer ke bagian tengah column.

18) Inkubasi pada suhu ruang selama 3 menit, setelah itu

sentrifugasi kembali pada 14.000 x g selama 3 menit.

19) DNA berhasil diisolasi dan dapat disimpan pada suhu -20 ⁰C.

Prosedur optimasi PCR

1) Mengencerkan primer TCF7L2- Forward 5-GAG AGC TAA

GCA CTT TTT AGG TA-3 menjadi konsentrasi 100 µL
2) Mengencerkan primer TCF7L2- Reverse 5-CTG ACA TTG
ACT AAG TTA CTT GC-3 menjadi konsentrasi 100 uMol Tm
51.6 C
3) Penambahan TE buffer sebagai pelarut sesuai dengan
keterangan datasheet primer dengan mengalikan10 pada
nmole.
2. Deteksi gen glukokinase dengan PCR

a) Prosedur kerja Elektroforesis

1) Hasil amplifikasi DNA (amplicon) dianalisis menggunakan

elektroforesis gel agarosa.

2) Konsentrasi agarosa sebesar 5 % dalam buffer TBE 1 x (Tris-

borateEDTA)

3) Lalu ditambahkan pewarna Diamond sebanyak 2 µl.

 17

4) Amplicon dimasukan ke dalam sumuran sebanyak 5 µl yang

ditambahkan 1 µl loading dye (Promega). Sebagai penanda

(Marker) digunakan ladder 100 bp (Promega).

5) Elektroforesis dijalankan dengan kondisi tegangan 110 V selama

35 menit.

6) Hasil elektroforesis divisualisasi dibawah sinar Blue Light (Mupid)

kemudian didokumentasikan sebagai hasil analisis

H. Pengumpulan dan Analisis Data

Data yang diperoleh dari penelitian ini merupakan data primer dari

hasil elektroforesis akan disiapkan dalam bentuk elektroforegram.

I. Etika Penelitian

Etika penelitian menurut CIOMS, (2016) adalah sebagai berikut :

1. Prinsip Etika Menghormati Harkat Martabat Manusia (Respect for

person)

Prinsip Etika Menghormati Harkat Martabat Manusia merupakan

bentuk penghormatan dari seseorang kepada orang lain. Bentuk

penghormatan terhadap harkat martabat manusia sebagai pribadi yang

memiliki kebebasan dalam memilih beranggung jawab atas keputusannya

sendiri. Peneliti memiliki kewajiban untuk memberikan informed concent

kepada responden yang akan dijadikan sebagai subjek penelitian untuk

ikut berpartisipasi dalam penelitian yang akan dilakukan oleh peneliti,

peneliti memberikan informasi secara relevan tentang penelitian yang

akan dilakukan kepada responden sampai responden mengerti dan

memahami informasi yang disampaikan oleh peneliti sehingga peneliti

 18

mendapatkan persetujuan dari responden untuk ikut berpartisipasi dalam

penelitian

2. Prinsip Etik berbuat baik (Beneficence) dan tidak merugikan (Non

Benficence)

Prinsip etik berbuat baik (Beneficence) dan tidak merugikan (Non

Benficence) adalah menyangkut kewajiban peneliti dalam membantu

orang lain yang dilakukan dengan mengupayakan manfaat yang baik dan

tidak menimbulkan adanya kerugian. Subjek manusia ini diikutsertakan

dalam penelitian kesehatan dimaksudkan untuk membantu tercapainya

tujuan penelitian kesehatan. Pada prinsip etika penelitian berbuat baik

disini kerahasiaan (Confidentiality) pasien harus dijaga dengan baik

seperti identitas (nama, usia, alamat, Riwayat penyakit).

3. Prinsip Etika Keadilan (Justice)

Prinsip etik dalam keadilan ini mengacu pada kewajiban etik untuk

memperlakukan setiap orang dengan perilaku yang sama tanpa

membeda bedakan antara satu dengan yang lainya, prinsip etik keadilan

menyangkut keadilan yang merata (distributive justice) dengan adanya

syarat pembagian yang seimbang (equitable).

J. Waktu dan Tempat Penelitian

1. Waktu Penelitian

Waktu penelitian dilaksanakan pada bulan Januari-Juli 2022.

2. Tempat Penelitian

Tempat penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler

FITKES UNJANI Cimahi.

 19

BAB IV

A. Hasil Penelitian
 20

Pada penelitian ini diperoleh 6 sampel darah dimana 3 sampel

darah diambil dari orang sehat dan 3 sampel lain nya diambil dari

penderita Diabetes Melitus tipe 2 dan untuk selanjutnya dilakukan isolasi

DNA menggunakan KIT Gsync. Hasil isolasi DNA divisualisasi dengan

metode elektroforesis. Hasilnya dapat dilihat pada gambar 4.1

Gambar 4.1: Hasil elektroforesis DNA spesimen darah. Lajur 1:

Ladder 1 kb, Lajur atas 2-6: spesimen darah DM, Lajur bawah 1-6
spesimen darah normal Lajur 7 bawah: Ladder 1 kb

Isolat DNA dilakukan uji Kemurniaan dan Konsentrasi dengan

menggunakan mikro Spektrofotometer pada absorban 260 nm dan

absorban 280 nm. Diperoleh data pada Tabel 4.1 berikut :

Kode sampel Abs 260 Abs 280 Rasio Konsentrasi/

Absorbansi C (ng/μL)

(A260/A280)

1 0,197 0,190 1,03 9,85

2 0,097 0,089 1,08 4,85

3 0,112 0,101 1,10 5,6

4 0,113 0,099 1,14 5,65

 21

5 0,118 0,105 1,12 5,9

6 0,099 0,089 1,11 4,95

7 0,121 0,108 1,12 6,05

8 0,128 0,112 1,14 6,4

9 0,118 0,106 1,11 5,9

10 0,161 0,146 1,10 8,05

11 0,157 0,140 1,12 7,85

12 0,125 0,108 1,15 6,25

B. Pembahasan

Ekstraksi DNA merupakan tahapan penting dalam teknik molekuler.

Ekstraksi DNA diperoleh dengan cara merusak atau memecahkan dinding

sel, sehingga DNA keluar dari dalam sel. Ekstraksi DNA merupakan

proses pemisahan DNA dari komponen sel lainnya seperti protein,

karbohidrat, lemak dan lain lain. Ekstraksi DNA terdiri dari tiga tahap

utama yakni perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari komponen

lainnya serta pemurnian DNA . Pemecahan sel atau lisis pada proses

ekstraksi sel bertujuan untuk menghancurkan membran dan dinding sel

sehingga bagian dalam sel dapat keluar Selanjutnya tahap pemisahan

DNA dari makromolekul lain seperti protein, sebagian kecil RNA, lipid dan

polisakarida. Tahap terakhir ialah pemurnian DNA. Tahap ini bertujuan

untuk menghilangkan residu dari zat yang digunakan pada tahap lisis dan

pemisahan DNA (Hutami et al., 2018).

 22

Pada penelitian ini menggunakan 3 sampel darah DM dan 3

sampel darah orang normal sampel darah dilanjutkan isolasi DNA

menggunakan kit gSYNC DNA Extraction. Hasil isolasi DNA

menggunakan kit gSYNC DNA Extraction, kemudian di elektroforesis

dan divisualisasi dengan UV transiluminator pada gambar 4.1 . hasil

eletroforesis menunjukan pita DNA ditandai dengan terdapat 12 pita

DNA. Isolat DNA dijadikan sebagai cetakan untuk amplifikasi gen

Glukokinase menggunakan Real-Time PCR. Tahapan Real-Time PCR

terdiri dari denaturasi, penempelan, pemanjangan dan deteksi (Brown,

2018).

Uji kuantitatif dilakukan untuk menguji tingkat kemurnian DNA

yang telah diisolasi menggunakan niai absorbansi pada

spektrofotometer. Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi

protein dalam larutan, kemurnian larutan tersebut dapat tilihat dengan

membagi nilai A260 dengan A280. Hasil uji kuantitatif sampel DNA tabel

4.1 berkisar antara 1,17 hingga 1,23 yang menunjukkan nilai di bawah

rasio. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio kedua nilai tersebut

berkisar antara 1,8 hingga 2,0. Sedangkan jika rasio A260 dibagi

dengan A280 lebih kecil dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi yang

disebabkan oleh protein atau fenol pada hasil isolasi. Selain itu, jika

rasio A260 dibagi dengan A280 lebih dari 2,0 ini dimungkinkan

terkontaminasi oleh RNA (Ratnasari et al., 2019)

Proses isolasi DNA selanjutkan dilakukan pengujian kemurnian

dengan spektrofotometer dari 4 kali pengujian sampel dengan total

sampel 12 dilakukan uji kemurnian sebanyak 12 sampel yaitu dimana

 23

didapatkan hasil kemurniaan dan konsentrasi seperti yang tercantum

pada table 4.1 didapatkan hasil kemurnian rendah dengan hasil kurang

dari 1,8 sebanyak 12 sampel. Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat

kontaminasi protein dalam larutan, kemurnian larutan tersebut dapat

tilihat dengan membagi nilai A260 dengan A280. Hasil uji kuantitatif

sampel DNA (tabel 4.1) berkisar antara 0,1 hingga 1,1 yang

menunjukkan nilai di bawah rasio. Molekul DNA dikatakan murni jika

rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8 hingga 2,0. Sedangkan jika

rasio A260 dibagi dengan A280 lebih kecil dari 1,8 menunjukkan adanya

kontaminasi yang disebabkan oleh protein pada hasil isolasi. Selain itu,

jika rasio A260 dibagi dengan A280 lebih dari 2,0 ini dimungkinkan

terkontaminasi oleh RNA (Ratnasari & Faridah, 2019).

Pada penelitian ini memiliki hasil konsentrasi DNA yaitu ˂9,85

ng/µL 12 sampel tidak memenuhi syarat untuk dilakukan proses tahap

selanjutnya karena untuk dapat dilakukan amplifikasi, konsentrasi

minimal sampel adalah 25 ng/μL (Syahfitri et al., 2017)

Terdapat beberapa faktor yang dapatmenentukan tingkat

keberhasilan teknikamplifikasi DNA menggunakan PCR. Faktor-faktor itu

antara lain deoksiribonukleotidatriphosphat (dNTP); oligonukleotida

primer;DNA cetakan (template); komposisis larutanbuffer; jumlah siklus

reaksi; enzim yangdigunakan; dan faktor teknis dan non-teknislainnya,

seperti kontaminasi. PCR memilikikeunggulan yaitu mampu

melipatgandakansuatu fragmen DNA sehingga mencapai 109kali lipat.

Oleh karena itu, adanya kontaminasidalam jumlah sangat sedikit

sekalipun dapat mengakibatkan terjadinya kesalahan

 24

denganmenghasilkan produk amplifikasi yang tidak diharapkan 10.

Amplikon, atau hasil amplifikasiDNA dengan PCR dapat dilihat

setelahmelalui teknik elektroforesis. DNA amplikondiberi pewarnaan

dengan ethidium bromidayang akan berfluoresens ketika

dipaparkanpada sinar UV level medium dengan panjang gelombang

300nm dari UV transilluminator Loop-mediated Isothermal Amplification

(LAMP) (Feranisa, 2016).

 25

BAB V

A. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa gen

Glukokinase pada sampel darah dapat diamplifikasikan menggunakan

metode PCR dengan adanya pita DNA gen Glukokinase.

B. Saran

Berdasarkan kesimpulan diatas dapat diberikan beberapa rekomendasi

untuk dikaji dan ditindak lanjuti untuk penelitian selanjutnya yaitu :

1.pada penelitian selanjutnya disarankan melakukan amplifikasi untuk

melihat polimorfisme gen glukokinase gen Glikokinase pada

DiabetesMelitus tipe 2.

2. untuk penelitian selanjutnya , disarankan untuk melakukan

pemeriksaan kadar DNA pada pasien DM dan jumlah copy gen

Glukoinase.
 26

32LAMPIRAN
27
28
29