MAKALAH

METODE ANALISIS VITAMIN LARUT AIR

Disusun untuk memenuhi tugas

Mata Kuliah : Analisis Zat Gizi

Dosen Pengampu : Rizki Widyan Aisha, S.Gz, M.Gz

DISUSUN OLEH:
1) Oshya Aryun Nur Annisya (22021140003)
2) Diah Prita Daniswara (22021140007)
3) Amara Maulida Alezafi (22021140008)
4) Sabila Rizqy Fauziah (22021140010)
5) Dinda Alya Raihana Najwa (22021140016)
6) Ani Nur Faizah
7) Annisa Surya Mustika

PRODI S1 GIZI

FAKULTAS GIZI

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH KUDUS

2023

1
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan hidayah-Nya
sehingga kami dapat menyelesaikan tugas makalah tugas makalah yang berjudul “Metode
Analisis Vitamin Larut Air” ini tepat pada waktunya.
Adapun tujuan dari penulisan dari makalah ini adalah untuk memenuhi tugas Bu Rizki
Widyan Aisha, S.Gz, M.Gz pada mata kuliah Analisis Zat Gizi. Selain itu, makalah ini juga
bertujuan untuk menambah wawasan tentang gizi bagi para pembaca dan juga bagi penulis.
Kami mengucapkan terima kasih kepada Bu Rizki Widyan Aisha, S.Gz, M.Gz, selaku
dosen mata kuliah Analisis Zat Gizi yang telah memberikan tugas ini sehingga dapat
menambah pengetahuan dan wawasan sesuai dengan bidang studi yang kami tekuni.
Kami juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membagi
sebagian pengetahuannya sehingga kami dapat menyelesaikan makalah ini.

Penulis,

Kelompok 2

2
 DAFTAR ISI
BAB I PENDAHULUAN..........................................................................................................4

1.1 Latar Belakang.................................................................................................................4

1.2 Rumusan Masalah............................................................................................................4

1.3 Tujuan Penulisan..............................................................................................................4

1.4 Manfaat Penulisan............................................................................................................4

BAB II PEMBAHASAN...........................................................................................................5

2.1. Thiamin (B1)...................................................................................................................5

2.2. Riboflavin (B2)................................................................................................................8

2.3. Niasin (B3).......................................................................................................................9

2.4. Piridoksin (B6)...............................................................................................................12

2.5. Biotin (B7).....................................................................................................................13

2.6. Kobalamin (B12)...........................................................................................................16

2.7. Vitamin C.......................................................................................................................17

BAB III PENUTUP..................................................................................................................20

3.1 Kesimpulan....................................................................................................................20

DAFTAR PUSTAKA..............................................................................................................21

3
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Vitamin (bahasa Inggris: vital amine, vitamin) adalah sekelompok senyawa organik
amina berbobot molekul kecil yang memiliki fungsi vital dalam metabolisme setiap
organisme, yang tidak dapat dihasilkan oleh tubuh. Nama ini berasal dari gabungan kata
bahasa Latin vita yang artinya "hidup" dan amina (amine) yang mengacu pada suatu
gugus organik yang memiliki atom nitrogen (N), karena pada awalnya vitamin dianggap
demikian. Kelak diketahui bahwa banyak vitamin yang sama sekali tidak memiliki atom
N. Dipandang dari sisi enzimologi (ilmu tentang enzim), vitamin adalah kofaktor dalam
reaksi kimia yang dikatalisasi oleh enzim. Pada dasarnya, senyawa vitamin ini digunakan
tubuh untuk dapat bertumbuh dan berkembang secara normal. Vitamin memiliki peranan
spesifik di dalam tubuh dan dapat pula memberikan manfaat kesehatan
Sebagian besar vitamin larut air merupakan komponen system enzim yang banyak
terlibat dalam membantu metabolism energy. Vitamin larut air biasanya tidak di simpan
di dalam tubuh dan di keluarkan melalui urin dalam jumlah kecil. Oleh sebab itu vitamin
larut air perlu di konsumsi tiap hari untuk mencegah kekurangan yang dapat menggangu
fungsi tubuh normal.
Vitamin larut air di kelompokan menjadi vitamin C dan vitamin B, viatamin B terdiri
dari 8 faktor yang saling berkaitan fungsinya  di dalam tubuh dan terdapat di dalam bahan
makanan yang hampir sama. Fungsi terkait ddalam proses metabolism sel hidup, baik
dalam tumbuh-tumbuhan maupun hewan sebagai koenzim atau kofaktor.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimanakah prinsip metode analisis vitamin larut air?
2. Apa kelebihan dan kekurangan metode analisis vitamin larut air?

1.3 Tujuan Penulisan

1. Mengetahui prinsip metode analisis vitamin larut air.
2. Mengkaji kelebihan dan kekurangan metode analisis vitamin larut air.

1.4 Manfaat Penulisan

1. Menambah wawasan tentang zat gizi.
2. Menjadi dasar pembelajaran analisis zat gizi tentang vitamin larut air.

4
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1. Thiamin (B1)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Thiamin dalam tablet vitamin B1 dapat dianalisis dengan menggunakan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi. Larutan standar tiamin yang digunakan dengan konsentrasi 30 ppm.
Sampel vitamin B1dilarutkan dan diencerkan dengan larutan buffer fosfat. Pemisahan
tiamin dilakukan dengan menyuntikkan analit ke dalam instrumen HPLC.
• Metode kromatografi
thiamin dalam tablet vitamin B1 dapat dianalisis dengan menggunakan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
~Prinsip Penetapan
Thiamin dilarutkan dalam larutan buffer posfat PH 4,5. Pemisahan terhadap thiamin
dilakukan dengan menginjeksikan larutan contoh pada HPLC menggunakan kolom fase
terikat C18. Fase gerak campuran buffer posfat methanl (55 : 45), secara isokratik
dengan kecepatan alir 0,5 m/menit. Detector yang digunakan adalah jenis UV-VIS pada
panjang gelombang 254 nm. Dengan membandingkan area contoh terhadap standar,
maka kadar thiamin dapat diketahui.
Penentuan thiamin secara fluorometer :
•Prinsip :
- Oksidasi thiamin menjadi thiokrom
- Reagensia : kalium ferrisianida 1% baru
- Bila senyawa yang didapat berfluoresen lain dapat dipisah,maka tingkat fluoresensi
thiamin akan proporsional.
a. Kelebihan :
Kelebihan HPLC adalah mampu menentukan semua tingkat antioksidan dalam single
chromatogram. Semua senyawa polar hingga nonpolar dapat ditentukan dengan
menggunakan teknik gradien elusi. Deteksi yang paling umum digunakan adalah
absorpsi UV pada gelombang 280 nm, pengukuran emisi fluoresensi pada 315 nm, dan
deteksi amperiometer. Deteksi amperiometer mampu menangkap sensivitas dan
spesifisitas antioksidan fenol (Macrae, 1988).
b. Kekurangan :
- Teknik kromatografi gas terbatas untuk zat yang mudah menguap

5
- Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah
besar.
 Metode Kolorometri
Prinsip :
- Thiamin + garam reinecke : endapan
- Endapan + aseton : larut : diukur kadarnya pada 525 nm
- Diperlukan standar thiamin.
a. Kelebihan : kemudahannya dalam menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil.
b. Kekurangan :
- Reagen pewarna sulit didapat dan harganya mahal.
- Untuk mendapatkan warna spesifik dibutuhkan kondisi tertentu.
- Kepekaan detektor mata berbeda-beda. (Vogel: 1989) III.
 Metode spektrofluorometri
Spektrofotometri UlV-Vis dalam analisis kuantitatif spektrofotometri Ultraviolet dan
sinar tampak telah banyak diterapkan untuk penetapan senyawa-senyawa organik yang
umumnya dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang sangat kecil.
Tiamin dalam makanan dan dalam sediaan farmasi harus disari terlebih dahulu secara
kuantitatif yang biasanya dengan mendidihkannya dalam asam encer kemudian tiamin
dibebaskan dari persenyawaan kompleks dengan enzim fosfatase.
Prinsip : berdasar pada fluoresensi dan fosforesensi, yaitu proses emisi foton yang terjadi
pada saat relaksasi molekuler dari keadaan elektron yang tereksitasi.
a. Kelebihan :
- filter fluorometer bisa sangat sensitif, jadi sangat cocok untuk penelitian ilmiah yang
tepat. (Sumber :
b. Kekurangan :
- Ketergantungan pada keadaan lingkungan dan tidak ada pegangan senyawa apa
yang akan berfluoresensi.
- Masalah lain dalam fluorimetri adalah penghapusan (quenching) yaitu energi yang
seharusnya dilepas sebagai sinar fluoresensi terserap oleh molekul lain.
 Metode Gravimetri
Prinsip : thiamin dalam tablet vitamin b1 dan dalam injeksi dapat ditetapkan secara
gravimetrik dengan cara mengandapkan larutan tiamin menggunakan asam
silikowolframat.

6
- thiamin + garam reinecke = endapan = dikeringkan = ditimbang
- hanya dapat dilakukan jika sampeel mengandung banyak thiamin > 50 mg
- jika kurang lebih baik menggunakan fluorometer atau kolorimeter
a. kelebihan : Kelebihan gravimetri antara lain adalah tidak membutuhkan zat
pembanding dan alat yang terkalibrasi hanya neraca analitik.
b. kekurangan : Proses pengerjaannya lama. Waktu yang dibutuhkan selama proses
pengendapan dan pengeringan endapan sangat lama. Pengukuran kadarnya hanya dapat
digunakan untuk komponen yang besar, sedangkan untuk jumlah sampel yang sangat
kecil tidak valid.
 Metode Argentomeri
Prinsip : Prinsip pada percobaan argentometri adalah berdasarkan pada reaksi
pengendapan zat yang dianalisa dengan larutan baku AgNO3 sebagai penitrasi dengan
menggunakan metode Mohr dan metode Volhard.
a. Kelebihan : Dapat dimanfaatkan sebagai penentu takaran atau kadar zat dalam sebuah
larutan.
b. Kekurangan :
- Dapat terjadinya indikator yang tidak cocok dengan larutan
- Komponen dari endapan yang pada titrasi argentometri ini tidak diketahui dengan
pasti.
- Teknik atau metode dari titrasi argentometri tidak banyak jika dibandingkan dengan
teknik atau metode dari titrasi asam basa.
 Metode Alkalimetri
Prinsip : Prinsip kerja dari metode ini adalah dengan adanya hidroklorida dalam tiamin
hidroklorida dapat dititrasi dengan natrium hidroksida 0,1 N menggunakan indikator
brom timol biru. Selanjutnya diamati hasil perubahan warnanya, warna yang dihasilkan
adalah warna biru muda.
a. Kelebihan :
- Merupakan metode yang sederhana
- Berbagai senyawa organik dan anorganik dapat ditentukan dengan mudah
- Ketelitian dan ketepatan yang cukup Tinggi
b. Kekurangan :
- Memerlukan yang relatif lama untuk perhitungan atau penentuan nilai konsentrasi
larutan

7
2.2. Riboflavin (B2)
1) Metode Spektrometri
Metode ini telah ditemukan untuk menjadi spesifik, cepat dan meyakinkan untuk
riboflavin dan formylmethylfalvin. Pada prinsipnya metode tersebut menyelesaikan
campuran kompleks senyawa dalam sinyal tumpang tindih yang kuat. Metode ini telah
digunakan untuk mempelajari kinetika reaksi kimia dan fotodegradasi dari vitamin
tersebut.
2) Spektrofluorimetri
Metode tersebut ternyata sensitif dan telah menunjukkan presisi yang baik tanpa
gangguan dari aditif farmasi. Metode spektrofluorimetri pada prinsipnya sinkron cepat
untuk penentuan riboflavin dan asam folat secara simultan dalam minuman bernutrisi
telah dibentuk untuk memberikan hasil yang memuaskan.
3) Spektrometri massa
Teknik ini tidak memerlukan perawatan apa pun sebelum melanjutkan. prinsip
dasarnya adalah Dalam spektrometri massa, molekul sampel dalam fase uap
dibombardir dengan elektron berenergi tinggi yang menyebabkan lepasnya satu
elektron dari kulit valensi molekul tersebut. Kelebihannya adalah sederhana dan andal
telah dilaporkan untuk penentuan riboflavin bersama dengan vitamin B3, B6, kafein
dan taurin dalam minuman energi dengan spektrometri massa ionisasi elektro-semprot
kromatografi planar.
4) Metode Elektrokimia
Riboflavin dan fotoproduknya, formilmetilflavin dan lumikrom juga telah ditentukan
dengan metode polarografi menggunakan potensial setengah gelombang masing-
masing -0,47V, -0,45V dan -0,58V. pada prinsipnya metode ini didasari pada reaksi
redoks yang berlangsung pada suatu sistem elekrokimia
5) Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)
Penentuan riboflavin bersama dengan vitamin B lainnya telah dilakukan dengan
metode RP-HPLC. Pemulihan rata-rata antara 95,2-103,9% sedangkan RSD untuk
riboflavin adalah 0,7%. Metode tersebut memiliki kelebihan seperti berhasil diterapkan
pada pemisahan dan penentuan vitamin lain termasuk B1, B3, B6, B9 dan B12.
Beberapa metode HPLC lain untuk penentuan simultan riboflavin dan vitamin lain
dalam makanan, campuran multivitamin, obat-obatan, susu dan cairan biologis .
6) Kromatografi elektrokinetik / elektroforesis kapiler

8
 Metode yang cepat, akurat, sederhana dan murah telah dikembangkan untuk
penentuan simultan enam vitamin larut dalam air termasuk riboflavin menggunakan
elektroforesis kapiler yang dioperasikan dalam mode misel.
7) Metode Uji Enzimatik
Prinsip metode ini adalah menggunakan enzim tertentu sesuai dengan jenis
metodenya sebagai katalis reaksi. Metode ini dapat digunakan untuk penentuan
riboflavin dalam plasma manusia dan urin.kekurangannya yaitu memiliki prosedur
yang sangat Panjang dan tidak praktis sehingga memerlukan waktu yang lama
(Ceirwyn, 1999).
8) Metode Mikrobiologi
Dapat digunakan untuk pengujian riboflavin, tiamin, piridoksin, sianocobalamin,
kalsium pantotenat asam nikotinat, pantotenol dan asam folat. Pada prinsipnya
metodologi ini adalah mengencerkan sample sampai tingkat tertentu sehingga
memperoleh konsentrasi mikroorganisme yang pas. Kelebihanya adalah cara
inokulasi cukup mudah dan koloni bakterinya mudah diamati namun mudah terjadi
kontaminasi bila dikerjakan kurang aseptis.
2.3. Niasin (B3)
Metode kimia untuk penetapan kadar vitamin B3 bisa dilakukan dengan titrasi bebas air,
kolorimetri, spektrofotometri, conlinous-flow analysis, kromatografi lapis tipis (KL T),
kromatografi gas, dan kromatografi cair kinetja tinggi (KCKT).
• Titrasi dilakukan dengan menggunakan asam perklorat dan indikator kristal violet.
Kelebihan :
 Karena adanya keterbatasan asam basa.
 Dapat dipakai untuk penetapan uji yang bersifat asam lemah, basa lemah yang
kadarnya tidak bisa ditetapkan secara titrasi asam basa biasa.
 Zat uji yang tidak larut dalam air kemungkinan kadarnya dapat ditentukan secara
tba dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai.
 Dalam bidang farmasi banyak zat uji dalam bentuk sediaan obat tertentu
kadarnya dapat langsung dititrasi tanpa pemisahan.
 Hasilnya cukup akurat.
Kekurangan :
 Pelarut bukan air, sehingga pelarut organik yang digunakan berbau tajam,
menusuk, mudah terbakar, toxic, irritant, lebih mahal.

9
  Adanya air akan mempengaruhi ketajaman titik akhir titrasi, jadi air yang ada
harus diikat dengan anhidra asetat.
 Pada alkalimetri, titrannya natrium metoksida yang mudah bereaksi dengan CO2
dari udara sehingga perlu dilakukan titrasi blangko/dialirkan gas nitrogen.
• Metode kolorimetri, spektrofotometri, dan conlinous-flow analysis digunakan pada
AOAC (Hortwitz, 2000) untuk menetapkan kadar vitamin B3. Ketiga metode ini sama-
sama diperlakukan dengan sianogen bromida. Sianogen bromida akan memutus ikatan
karbon-nitrogen pada cincin pyridin, kemudian direaksikan dengan amin aromatik yang
akan menghasilkan komplek berwana yang bisa diukur dengan kolorimetri atau
spektrofotometri (Gennaro, 2000).
Kolorimetri
Kelebihan :
- murah, cepat dan memiliki pengoperasian spektrometer yang sederhana.
- metode yang cepat dan nyaman dibandingkan dengan proses volumetrik atau
gravimetri dan mudah dioptimalkan untuk otomatisasi.
- Tidak membutuhkan orang yang berpengalaman untuk menanganinya.
- Bahan kimia dalam air dapat diidentifikasi dengan metode ini.
- diterapkan pada analisis kuantitatif senyawa berwarna.
Kekurangan :
- senyawa tidak berwarna tidak dapat dianalisis.
- membutuhkan lebih banyak sampel untuk analisis.
- Sensitivitasnya rendah.
- Warna yang sama dari bahan pengganggu dapat membuat kesalahan pada hasil.
- Interferensi matriks dapat menyebabkan hasil yang buruk dalam kondisi yang tidak
terkendali.
Spektrofotometri
Kelebihan :
 Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi
 Caranya sederhana
 Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil
Kekurangan :
 Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan
kebersihan dari kuvet
 Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang >185 nm
10
 Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi dengan
energyeksitasi rendah
 Sinar yang dipakai harus monokromatis
Amin aromatik yang digunakan pada kolorimetri dan conlinous-flow analysis adalah
asam sulfanilat dan pada spektrofotometri digunakan asam barbiturat (Hortwitz, 2000).
• Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) bisa digunakan untuk analisis vitamin B3.
Penetapan vitamin B3 dalam tablet multivitamin telah dilakukan oleh Ropte dan
Aieloff(1985) menggunakan plat silika gel dengan fase gerak aseton-kloroform-butanol-
arnmoniumhidroksida 25%, kuantifikasi dilakukan dengan densitometri pada 262 nm.
Selain itu, Ismaiel et al (1985) melakukan penetapan vitamin B3 dalam sediaan
multivitamin dengan ekstraksi di dalam air, yang dilanjutkan KLT pada plat silika gel
dengan fase gerak kloroform-etanol. Deteksi bercak dilakukan dengan uap anilin dan
sianogen bromida yang akan memberikan warna bercak kuning, dan kuantifikasi
dilakukan dengan densitometri pada 468 nm.
Keuntungan KLT menurut Gandjar & Rohman (2012) adalah:
- KLT banyak digunakan untuk tujuan analisis.
- Idenifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan
pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet.
- Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun
(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
- Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.
Kekurangan :
- Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang
diharapkan.
- Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
- Tidak dapat menentukan kadar dari zat yang diidentifikasi
• Metode Kromatografi Coir Kinerja Tinggi (KCKT) juga telah digunakan untuk analisis
vitamin B3. Metode KCKT untuk analisis vitamin B3 menggunakan kolom fase
sungsang dengan sistem fase gerak pasangan ion yang beragam. Takatsuki ef al (1987)
menggunakan air yang mengandung asam heptanasulfonat 10mM sebagai sistem
pasangan ion untuk analisis vitamin B) di dalam daging. Asam heptana sulfonat 5mM
dan asetonitril juga telah digunakan oleh Valls el of (2000) untuk analisis vitamin B3 di
dalam sosis. Sedangkan Stein et al (1995) untuk analisis vitamin B3 di dalam sampel
11
 biologis mengatakan tetrabutilammonium fosfat dan metanol USP 25 (2002)
menggunakan natrium 1-heptanasulfonat 0,005 M dan metanol untuk analisis vitamin
B3.
Keuntungan :
- Cepat
- Resolusi
- Sensitivitas detector
- Kolom yang dapat digunakan kembali
- Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik
- Mudah rekoveri sampel
Kekurangan :
- Mahal
- Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
- Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan
2.4. Piridoksin (B6)
Analisis vitamin B6 dalam beberapa sampel banyak yang sudah dipublikasikan.
Analisis vitamin B6 diantaranya menggunakan HPLC (High Performance Liquid
Chromatography), GC (Gass Chromatography) serta menggunakan FITR. Penggunaan
HPLC dalam analisis memiliki beberapa keterbatasan diantaranya optimasi yang
memakan waktu cukup lama, pemilihan fase gerak yang cukup rumit serta instrument
yang cukup mahal, begitu juga analisis vitamin B6 menggunakan GC maupun FTIR.
Kedua instrument ini juga memiliki beberapa kekurangan ketika akan digunakan
untuk analisis vitamin B6. GC dan FTIR merupakan metode analisis yang rumit dan
membutuhkan preparasi sampel yang lama, sehingga dibutuhkan metode analisis yang
simple, cepat serta dengan biaya yang relative murah (Amaro et al., 2014, Vergara et al.,
2005; Nugrahani et al., 2016).
Analisis vitamin B6 dalam sediaan tablet multivitamin neurotropik membutuhkan
metode yang simple, cepat serta murah. Salah satu metode yang memiliki kriteria
tersebut adalah spektrofotometer UV-Vis. Rentang panjang gelombang yang lebar akan
mampu mendapatkan panjang gelombang maksimal untuk analisis vitamin B6.
Kelebihan lain dari metode analisis ini adalah cepat, tidak memerlukan biaya yang
besar dan mudah dilakukan. Jumlah sampel dan pelarut yang dibutuhkan juga sedikit,
namun tetap memberikan hasil yang akurat. Analisis yang cepat akan memberikan
efisisensi waktu dalam mengerjakannya. Kemungkinan terjadinya kerusakan vitamin B6
12
 yang dilarutkan pada pelarutnya sebelum dianalisis juga dapat dicegah. Penentuan
panjang gelombang maksimal dilakukan dengan menggunakan standar baku vitamin B6
pada kadar 100 ppm. Pada analisis vitamin B6 menggunakan pelarut air karena
piridoksin termasuk vitamin larut air. Pemilihan air sebagai pelarut karena
ketersediannya yang melimpah dan mudah didapatkan.
Kekurangan vitamin B6 dapat menyebabkan anemia, ruam kulit, depresi serta system
kekebalan tubuh yang lemah. Vitamin B6 sering dikombinasikan dengan vitamin B1 dan
B12 sebagai vitamin neurotropi. Kombinasi dengan vitamin B1 dan B12 akan
memperbaiki serta mengoptimalkan sistem syaraf. Hal ini menunjukkan pentingnya
asupan vitamin B6 yang cukup pada tubuh (Mooney et al, 2009; NIH, 2016).
2.5. Biotin (B7)
- Metode Avidin-biotin complex (ABC)
Aplikasi metode ABC bergantung pada antibodi sekunder yang dibiotinilasi dan
kompleks enzim reporter avidin-biotin. Karena avidin bersifat tetravalent, terbentuklah
kompleks yang cukup besar, menghasilkan intensitas sinyal yang tinggi.
Deteksi berbasis ABC adalah salah satu metode pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Sistem ini memanfaatkan afinitas tinggi yang ditunjukkan antara protein
avidin dan vitamin biotin. Avidin bersifat tetravalent, sehingga setiap molekul avidin
dapat berikatan hingga empat konjugat biotinilasi. Dalam sistem ABC, avidin dan enzim
yang dibiotinilasi digabungkan untuk membentuk kompleks makromolekul besar yang
mengandung beberapa molekul enzim. Kompleks tambahan ini mengikat target yang
dibiotinilasi, seperti antibodi primer atau antibodi sekunder, asam nukleat, lektin dan
makromolekul. Ketika substrat enzim kromogenik ditambahkan akan menghasilkan
endapan berwarna pada reaksi. Kompleks multi-enzim yang besar memperkuat sinyal,
memberikan sensitivitas yang lebih besar.
- Metode Labeled streptavidin-biotin (LSAB)
Umumnya kit deteksi sekarang didasarkan pada varian LSAB dari metode ABC, yang
menggunakan streptavidin,alih-alih avidin. Hasilnya berupa ikatan jaringan yang kurang
non-spesifik, karena streptavidin tidak terglikosilasi dan memiliki lebih banyak titik
isoelektrik netral dibanding avidin.
- Metode Berbasis Polimer
Tantangan utama pada sistem berbasis biotin adalah adanya biotin endogen yang
akan mempengaruhi background pewarnaan secara signifikan pada jaringan tertentu
misalnya saja jaringan otak. Meski fiksasi formalin dan embedding paraffin mengurangi
13
level biotin, antigen retrieval bisa menghasilkan tereksposnya biotin. Pada frozen section
(potong beku), biotin endogen merupakan masalah yang penting. Meski langkah ekstra
telah dilakukan misalnya dengan larutan blocking biotin yang bisa mengurangi
background, metode berbasis polimer non biotin bisa menjadi alternatif.
Metode polimer generasi awal menggunakan tulang punggung dextran sebagai
tempat perlekatan beberapa molekul enzim dan antibodi sekunder. Saat ini telah
dikembangkan metode mikro-polimer atau polimer kompak yang lebih unggul
menggunakan kompleks deteksi yang lebih kecil dengan kecenderungan agregat yang
lebih sedikit. Ini menghasilkan sensitivitas yang lebih besar melalui penetrasi jaringan
yang lebih baik dan pengurangan pewarnaan background dari biotin endogen.
Reagen berbasis polimer adalah metode deteksi yang bisa dikatakan baru dalam
metode deteksi IHC dibandingkan dengan metode tradisional sebelumnya yaitu konjugat
avidin dan biotin, misalnya saja format kit ABC. Polimer menawarkan keuntungan yang
berbeda dibandingkan dengan metode tradisional terutama untuk aplikasi misalnya saja
pelabelan banyak antigen (multiple antigen labeling atau multiplexing) pada jaringan
yang sama atau dalam kasus dimana tingkat biotin endogen yang dapat dideteksi bisa
menyebabkan masalah.
Sistem berbasis polimer pada dasarnya terdiri dari polimer terintegrasi dari enzim
aktif dan antibodi sekunder yang mengikat target antibodi primer. Format terintegrasi ini
memperkenalkan lebih banyak enzim pada situs lokalisasi, sehingga menyebabkan reaksi
lebih besar dengan kromogen, dibandingkan dengan antibodi sekunder yang langsung
terkonjugasi dengan enzim. Selain itu, penggunaan metode polimer one-step akan
memperpendek prosedur IHC dengan menghindari two-step antibodi sekunder biotinilasi
dan reagen ABC yang dibutuhkan untuk sistem avidin-biotin.
- Metode Multiwarna
Jika banyak antigen yang menarik maka dimungkinkan untuk menodai hingga tiga
antigen berbeda pada saat yang sama menggunakan kromogen berwarna berbeda. Ini
biasanya membutuhkan antibodi primer yang dinaikkan pada spesies yang berbeda,
kecuali jika antigen hadir pada tingkat yang cukup tinggi sehingga antibodi primer yang
terkonjugasi langsung ke enzim reporter dapat digunakan.
Zat penghambat juga dapat digunakan yang memungkinkan pewarnaan dengan satu
antibodi primer yang diangkat pada spesies tertentu, diikuti dengan pemblokiran situs
pengikatan antibodi sekunder pada antibodi primer tersebut, dan kemudian pewarnaan
dengan antibodi primer kedua yang diangkat pada spesies yang sama.
14
 Beberapa penanda dapat diimunisasi dalam satu bagian jaringan menggunakan multi-
color IHC (mIHC). mIHC kromogenik tradisional bergantung pada setiap antibodi yang
dibesarkan dalam spesies yang berbeda atau dari isotipe yang berbeda. Antibodi
sekunder spesifik kemudian digunakan, dengan kromogen yang berbeda untuk setiap
penanda. Namun, sulit untuk membedakan lebih dari dua chromogen pada slide,
terutama jika ada chromogen yang saling tumpang tindih.
mIHC neon dapat dengan mudah digunakan dengan tiga atau lebih penanda. Ini
dapat digunakan dengan antibodi primer terkonjugasi pewarna fluoresen namun lebih
umum digunakan dengan antibodi sekunder terkonjugasi pewarna, karena amplifikasi
ekstra mereka, dan terbatasnya ketersediaan konjugat pewarna primer. Sebagian besar
mIHC fluoresen terbatas pada tiga penanda (ditambah noda balik) dengan set filter
fluoresensi yang tersedia, dan oleh kebutuhan setiap antibodi primer untuk dinaikkan
dalam spesies yang berbeda / memiliki isotipe yang berbeda.
Metode yang paling umum untuk meningkatkan jumlah penanda lebih lanjut
menggunakan: a) mikroskop spektral unmixing yang memungkinkan lebih banyak
pewarna fluoresen untuk dibedakan; dan b) metode pengupasan dan pewarnaan antibodi
berurutan, seringkali dengan amplifikasi sinyal tyramide. Metode lain seperti pencitraan
sitometri massa, bergantung pada pembuatan gambar semu. mIHC memungkinkan data
konten tinggi dihasilkan dari satu bagian jaringan, secara efektif mengurangi jumlah
jaringan yang dibutuhkan, dan memungkinkan hubungan antara penanda yang berbeda
untuk dipahami dengan lebih baik.
Prinsip:
Ektraksi, pembersihan dan kompensasi adanya substansi pengganggu dan ditentukan
dengan fluorometer
Metode spektrometri:
Larutan riboflavin dalam pH 4,0 menunjukkan absorbs maksimum (λ maks) pada
444 nm. Cara ini digunakan untuk menetapkan kemurnian riboflavin atau untuk
penetapan riboflavin dilakukan dengan cara terlindung dari cahaya.
Prosedur penetapan kadar riboflavin tunggal secara spektrofotometri:
Sekitar 100 mg riboflavin yang ditimbang seksama dilarutkan dengan pemanasan
dalam campuran 2 mL asam asetat glacial dan 150 mL air. Larutan selanjutnya
diencerkan dengan air, didinginkan, ditambah air secukupnya hingga 1000 mL. pada
10,0 mL larutan ditambah 3,5 mL natrium asetat 0,1 M kemudian ditambah air

15
 secukupnya hingga 100 mL. kadarnya dihitung dengan menggunakan riboflavin baku
sebagai pembanding.
- Kelebihan Biotin (Vit B7)
Biotin atau vitamin B7 masuk ke dalam salah satu vitamin yang larut dalam
air.Eksresi dari vitamin yang larut air adalah melalui urine. Penyimpanan vitamin ini
dalamtubuh juga tidak dalam jumlah yang besar. Jadi untuk kasus kelebihan kadar biotin
dalamtubuh hampir tidak ada
- Kelemahan Biotin
Kekurangan biotin mempengaruhi aktivitas biotin karboksilase yang bergantung.
Karboksilase ini memfasilitasi berbagai reaksi metabolisme seperti glukoneogenesis,
sintesis asam lemak, dan metabolisme asam amino. Kegiatan ini mengulas evaluasi
defisiensi biotin dan menyoroti peran tim interprofessional dalam mengevaluasi dan
merawat pasien dengan kondisi ini.
2.6. Kobalamin (B12)
Prinsip analisis (Apriyantono, 1989)
Vitamin B12 dipisahkan dari makanan memakai larutan buffer asetat pH 4,5. Kobalamin
(tidak stabil) ditambah Na-sianida terbentuk sianokobalamin yang stabil
Kadar vitamin ditetapkan dengan menumbuh-kan Lactobacillus leichmanii (bakteri
tersebut membutuhkan vitamin B12 untuk pertumbuhannya sehingga pada kondisi
terkontrol pertumbuhannya spesifik).
Metode spektofometri
Metode ini digunakan untuk produk-produk farmasetik dengan konsentrasi tinggi.
Diukur pada panjang gelmbang 362 nm.
Kromatografi
Pengembangan metode kromatograf ini untuk analisis vitamin B12 dibatasi oleh
sensitifitas dan selektifitasnya yang rendah. Oleh karena itu, kebanyakan prosedur
melibatkan tahapan clean up dan pemekatan untuk menguji vitamin ini dalam
konsentrasi rendah
Detektor spektrometer massa mampu menawarkan sensitifitas dan selektifitas yang lebih
baik dibandingkan detektor UV.
Contoh analisis dengan kromatografi ( KCKT )
Sampel: produk-produk makanan
Penyiapan sampel:
vitamin B12 bebas menjadi digesti dengan α-amilase
16
 vitamin B12 total menjadi digesti dengan α-amilase,pepsin
Clean up: kolom imunifitas
Kolom: C18
Fase gerak: gradien. Asam trifluoroasetat 0.025% dalam air ph(2.6)- asetonitril.
Kecepatan alir=0.25 ml/menit
Deteksi: UV 361 nm
2.7. Vitamin C
Uji Benedict
Uji benedict dilakukan ketika gula pereduksi dipanaskan dengan pereaksi benedict.
Kehadiran natrium karbonat basa mengubah gula menjadi zat pereduksi kuat yang
disebut enediol. Selama terjadinya reaksi reduksi, campuran berubah warna dari endapan
biru menjadi merah bata karena terbentuknya kupro oksida Cu2o. Tembaga yang dalam
bentuk tembaga Cu2+ atau tembaga (I) kemudian direduksi menjadi bentuk tembaga
Cu+ atau tembaga (II). Karena oksida tembaga berwarna merah tidak larut dalam air, ia
dipisahkan. Jika konsentrasi gula tinggi, warna larutan yang dihasilkan menjadi lebih
kemerahan, dan volume endapan meningkat.
Kekurangan
1) Penisilin, isoniazid, streptomisin, salisilat, dan asam p-aminosalisilat semuanya
menghasilkan hasil positif palsu.
2) Bahan kimia seperti kreatinin, asam askorbat, dan urat memperlambat reaksi Benedict
di urin.
3) Tidak mungkin untuk menentukan konsentrasi gula pereduksi yang tepat; hanya
estimasi semikuantitatif yang dapat diberikan.
4) Pengujian lebih lanjut diperlukan untuk mengidentifikasi karbohidrat.
Kelebihan
Kontribusi utama pereaksi Benedict adalah deteksi cepat gula pereduksi dengan
perubahan warna, menggunakan agen basa stabil yang tidak terlalu korosif.
Metode Iodimetri
Yodium sebagai oksidator mengoksidasi vitamin C, kelebihan yodium akan segera
terdeteksi dengan indicator amilum yang dalam suasana basa berwarna biru muda
Kekurangan : Penitarnya mudah terurai oleh cahaya sehingga preparasi contohharus
dilakukan terlebih dahulu, Pada saat titrasi dikhawatirkan kehilangan ion iod,dalam
keadaan asam larutan iod dapat dioksidasi oleh udara.

17
Kelebihan : Titrasi berlangsung lebih cepat karena titrat dan titran langsungbereaksi,
Penambahan kanji diawal titrasi, warna titik akhir lebih mudah teramatidati tidak
berwarna menjadi biru
Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DICP)
Menetapkan kadar vitamin C pada bahan pangan berdasarkan titrasi dengan 2,6-
diklorofenol indofenol dimana terjadinya reaksi reduksi 2,6-diklorofenol indofenol
dengan adanya vitamin C dalam larutan asam.
Kelebihan dan kekurangan
Zat pereduksi lain tidak menganggu penetapan kadar vitamin C. Selain itu reaksi terjadi
secara kuantitatif sehingga dapat diketahui jumlah atau kadarnya. Disamping itu metode
ini juga praktis dan spesifik untuk larutan asam askorbat pada pH 1-3,5. Pada pH rendah
atau suasana asam akan memberikan hasil yang lebih akurat dibandingkan dalam
suasana netral atau basa.
Metode Spektofotometri
Asam askorbat dalam larutan air netral menunjukkan absorbansi maksimum pada 264
nm dengan nilai E1%= 579. Panjang gelombang maksimum ini akan bergeser oleh
adanya asam mineral.
Kekurangan
1) Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan
kebersihan dari kuvet
2) Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang >185 nm
3) Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi dengan
energi eksitasi rendah
4) Sinar yang dipakai harus monokromatis
Kelebihan
1) Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi
2) Caranya sederhana
3) Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil
Metode Spektrofluorometri
Menentukan kadar vitamin C yang mendasar pada reaksi yang dikatalisis oleh
hemoglobin telah dikembangkan berdasarkan pada reaksi antara asam askorbat (AA)
dengan metilen biru (MB).
Kekurangan:

18
1) Ketergantungan pada keadaan lingkungan dan tidak ada pegangan senyawa apa yang
akan berfluoresensi.
2) Masalah lain dalam fluorimetri adalah penghapusan (quenching) yaitu energi yang
seharusnya dilepas sebagai sinar fluoresensi terserap oleh molekul lain.
3) Sebaliknya bahan-bahan diluar sampel seperti bahan pencuci (detergent), minyak
pelumas, kertas saring atau kertas lap dapat mempengaruhi pengukuran fluorimeter
karena dapat melepas sinar fluoresensi sendiri.
Kelebihan:
1) Dapat untuk mengukur konsentrasi sampel yang rendah (pikogram).
2) Kepekaan fluorimetri dapat diatur dengan penguatan aliran listrik yang terbentuk dari
jalinan fotosel.
3) Spektroflurorimetri sangat mungkin menggunakan spectrum pilihan yang lebih luas
karena geseran Stokes dan adanya dua monokhromator yang dapat dipakai, atau untuk
spectrum yang mengenai sampel dan yang lain untuk spectrum fluroresensi yang
timbul.
4) Untuk fluorimetri tidak diperlukan kuvet pembanding (referensi) tapi kurva kalibrasi
tetap harus dibuat.

19
 BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Vitamin adalah sekelompok senyawa organik amina berbobot molekul kecil yang
memiliki fungsi vital dalam metabolisme setiap organisme, yang tidak dapat dihasilkan
oleh tubuh. Vitamin larut dalam air adalah vitamin yang hanya dapat disimpan dalam
jumlah sedikit dan biasanya akan segera hilang bersama aliran makanan. Terdapat banyak
metode untuk menetapkan kadar vitamin dengan analisis secara maupun kuantitatif.
Metode yang bisa digunakan untuk semua vitamin larut air dominan yaitu metode
spektrofotometri. Spektrofotometri adalah suatu instrument yang digunakan untuk
mengukur absorban suatu sampel pada panjang gelombang tertentu, memiliki kelebihan,
(1) Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi, (2) Caranya sederhana, (3)
Dapat menganalisis larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil. Namun metode tersebut
juga memiliki kelemahan, (1) Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat
pengganggu dan kebersihan dari kuvet, (2) Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet
yang panjang gelombang >185 nm, (3) Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang
mengandung elektron valensi dengan energi eksitasi rendah, (4) Sinar yang dipakai harus
monokromatis

20
 DAFTAR PUSTAKA
Ananda Ghifari Leying, F. R. (n.d.). PENETAPAN THIAMIN HIDROKLORIDA
DALAM TABLET VITAMIN B1 SECARA HPLC. Kelas XIII-8 SMK-SMAK BOGOR .

Gul, W. (2014). Methods of Analysis of Riboflavin (Vitamin B2): A Review. Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences , 10-21.

Hanwar, D. (2004). VALIDASI METODE UNTUK PENETAPAN KADAR VITAMIN

B3 DALAM BERAS DAN AIR CUCIANNYA DENGAN KROMATOGRAFI GAS
RESOLUSI TINGGI. Tesis .

Novalisha Techinamuti, R. P. (2018). REVIEW: METODE ANALISIS KADAR

VITAMIN C. Farmaka , 309-315.

21