Analisa Vitamin

Kelompok 4
Ahmad Rio Fatullah
Asiva Ajeng Armasyari
Dini Budiarti
Ester Maria M. P.
Ineu Ayu Oktapia
Muji Setyowati
Resa Prisilia Hanaf

Vitamin A
Pendahuluan
Metode ini dapat diterapkan pada lemak dan
hampir semua bahan pangan lainnya.
Prinsip
Mula-mula sampel disabunkan dan senyawa
yang tidak dapat disabunkan diekstrak dengan
dietil eter. Vitamin A kemudian dipisahkan dari
karotenoid dengan kromatograf alumina,
kemudian dianalisis secara spektrofotometri.

Pereaksi :
1. Larutan potasium hidroksida (60% w/w dalam
aquadest)
2. Larutan sodium hidroksida
3. Pereaksi Carr-price
4. Sodium sulfat
5. Etanol absolut
6. Petroleum eter
7. Dietil eter
8. Larutan pengelusi
9. Quinol
10.Alumina

11. Pembuatan Alumina Netral

- Fraksi alumina yang lolos saringan 150 mesh diaktivasi pada 800C selama 7 jam
- Dinginkan
- Tambahkan 2ml Aquadest setiap 98 gr alumina aktif kemudian campur dengan baik
- Simpan didalam botol bertutup
- Dengan menggunakan alumina ini, periksalah, apakah vitamin A mulai meninggalkan
kolom pada saat pelarut 24% melewati kolom.
- Lihat tahap pemeriksaan kromatograf
- Apabila vitamin A melewati kolom lebih lambat, tambahkan aquadest sampai kondisi
yang diinginkan tercapai
12. Pembuatan Alumina Basa
-. Timbang 20gr alumina netral dalam labu berdasarkan bulat dan tertutup
-. Tambahkan 20ml larutan NaOH 10%
-. Pasang adapter yang mempunyai lubang dibagian atas dan samping labu
-. Tutup lubang atas adapterdengan penutup karet berlubang
-. Pasang pipa gelas melalui lubang penutup karet sampai 5mm diatas dasar labu
-. Hubungkan pipa gelas dengan sumber gas nitrogen atau hidrogen
-. Hubungkan dengan lubang sisi adapter dengan pompa vakum, gunakan pipa yang
sesuai
-. Jalankan pompa vakum dan lewatkan aliran gas ke dalam labu perlahan-lahan selama
1 jam
-. Rendam labu dalam penangas minyak (oil bath) dan naikkan suhu penangas secara
bertahap selama 1 jam sampai mencapai 130C

- Pertahankan labu dalam penangas pada suhu tersebut

- Stop aliran gas
- Pindahkan labu dari penangas dan biarkan dingin sambil tetap
dalam keadaan vakum (pompa vakum masih dijalankan)
- Matikan pompa vakum
- Tentukan kadar air produk dengan pengeringan pada 500C
selama 2 jam
- Tambahkan air ke dalam alumina sehingga kadar air akhir
alumina 12,5-1%
- Simpan produk ini dalam tabung-tabung reaksi kecil yang
ditutup dengan lilin (1 gr per tabung)
Peralatan
1. Tabung berskala, kapasitas 1ml
2. Pipet ukur 0,5ml
3. Kolom kromatograf
4. Spektrofotometer dengan kisaran sinar tampak dan UV
5. Kuvet gelas dan silika, diameter 1 cm

Cara Kerja
Penyabunan dan ekstraksi
1. Timbang sejumlah sampel yang mengandung vitamin A, masukkan ke dalam labu
250ml
2. Tambahkan 20ml kuinol, 60ml etanol (96%w/v), 10ml larutan potasium hidroksida
60% dan 10ml petroleum eter
3. Didihkan dengan pendingin balik selama 30 menit
4. Dinginkan
5. A) Apabila setelah penyabunan tidak ada lagi padatan yang tertinggal, pindahkan
seluruh isi labu ke dalam labu pemisah, kemudian cuci labu dengan 80ml air
sebanyak 2x, masukkan cucian kedalam labu pemisah
B) Apabila setelah penyabunan masih ada padatan yang tertinggal, saring
larutan melewati corong buchner menggunakan kertas saring dan masukkan kedalam
labu pemisah. Tambahkan 160ml aquadest kedalam ekstrak.
6. Masukkan 100ml dietil eter kedalam ekstrak dalam labu pemisah. Kocok labu
pemisah secara kontinu sambil sesekali membuka tutupnya untuk mengurangi
tekanan didalam labu
7. Biarkan kedua fase untuk memisah secara sempurna
8. Tuangkan fase aqueous yang berada dibawah kedalam labu pemisah lainnya, simpan
lapisan eter
9. Ekstrak fase aqueous 3x, masing-masing menggunakan 50ml dietil eter dan
campurkan lapisan eter yang didapat kedalam fase eter hasil tahap 8
10.Tambahkan 50-100ml aquadest kedalam ekstrak eter, goyang memutar perlahanlahan

11. Buang fase aqueous yang berada dibawah

12. Lanjutkan pencucian dengan mengunakan 50ml aquadest sampai air
cucian bebas alkali (tes dengan fenolflalein)
13. Setelah air cucian terakhir dibuang, diamkan ekstrak eter beberapa menit
dan jika ada lapisan air dibuang dengan hati-hati
14.Uapkan ekstrak eter di atas penangas uap sampai kering sanbil
mengaalirkan gas inert kedalam wadah ekstrak eter
15. Tambahkan 2ml alkohol absolut segera setelah dietil eter menguap
16. Uapkan lagi sampai kering dengam menggunakan aliran gas inert
17. Ulangi tahap no 15 dan 16 sekali lagi
18. Larutkan segera residu dengan 5ml petroleum eter
19. Uapkan dengan menggunakan aliran gas inert sampai mengering
20. Ulangi tahap no. 18 dan 19 dua kali lagi
21. Larutkan residu dengan 2ml petroleum eter

Penetapan Vitamin A : Kromatografi Kolom Alumina

1. Letakkan sejumlah kecil kapas wool dibagian dasar dari kolom kromatograf
2. Tuangkan petroleum eter sampai setinggi setengah kolom
3. Tambahkan 5,5gr alumina netral
4. Biarkan petroleum eter yang tersisa mengalir melalui permukaan alumina
sampai tinggal lebih kurang 2mm diatas permukaan (menggunakan tekanan
gas inert)
5. Tuangkan ekstrak ke dalam kolom, cuci wadah ekstrak berturut-turut dengan
1ml petroleum eter, masukkan cucian kedalam kolom
6. Dengan bantuan vakum, lakukan pengembangan kolom (elusi)
7. Secara berturut turut tuangkan kedalam kolom, pada saat miniskus dari
larutan yang terdahulu mencapai permukaan alumina, 5ml petroleum eter
dan kemudian masing-masing 5ml larutan pengelusi dietil eter 4-20% dalam
petroleum eter
8. Apabila selama elusi menggunakan petroleum eter sampai dietil eter 12%
dalam petroleum eter ada karoten yang ikut terelusi, pisahkan dan simpan
9. Pasang kolom kromatograf bawah yang berisi 1 gr alumina basa dalam
petroleum eter segera setelah menuangkan larutan mengelusi dietil eter 20%
10.Tampung eluen didalam tabung-tabung reaksi berskala 1ml
11.Lanjutkan pengembangan kolom dengan masing-masing 5ml larutan
pengelusi dietil eter 24 dan 36% sampai seluruh vitamin A terelusi
12.Ambil 0,2ml larutan dari masing-masing tabung

13. Tambahkan 0,3 pereaksi Carr-Price, timbulnya warna biru menunjukan adanya
vitamin A
14. Dari setiap tabung reaksi yang mengandung vitamin A ambil 0,5ml larutan dan
masukkan kedalam labu takar 10ml. Encerkan dengan petroleum eter sampai tanda
tera.
15. Ukur absorbansinya dengan kuvet silika pada 323,324,325 dan 326 nm. Gunakan
petroleum eter sebagai blanko
16. Juga ukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum dikurangi 15 dan
panjang gelombang maksimum ditambah 10 (lihat catatan 3)
Perhitungan
Vitamin A
Jika : Berat sampel (gr) = W
Absorbansi = D
E 1% 1cm untuk vitamin A dalam petroleum eter = 1830 ( 324nm)
Jadi : Vitamin A (Retinol) dalam sampel (mg/100)
=

D x 10 x 2 =
1830 x 100 x W

D x 10.9
W

Catatan
1. Seluruh proses dilakukan secepat mungkin untuk
mengindari pengaruh cahaya
2. Untuk sampel-sampel seperti susu, lemak
diekstrak terlebih dahulu dengan cara RoeseGottlieb, hasilnya kemudian disabunkan
3. Rasio Absorbansi pada ( maksimum - 15)
Absorbansi pada maksimum

dan Absorbansi pada ( maksimum + 10)

Absorbansi pada maksimum
Untuk vitamin A murni tidak akan > 0,9. apabila rasio
tersebut > 0,9 menunjukkan adanya senyawa
pengganggu.

Total Karoten dalam

Minuman

Pendahuluan

Metode ini dapat diterapkan untuk menetapkan total karoten

dalam minuman seperti saribuah, vitamin juices, fruitmilk,
fruitbuttermilk, vitamin drink dan lain-lain

Prinsip
Sampel minuman diekstrak dengan kloroform, ekstrak yang
diperoleh dikromatografkan pada aluminium oksida sehingga
karoten terpisah dari komponen lainnya. Absorbans fraksi karoten
yang diperoleh dapat diukur pada panjang gelombang 450nm

Pereaksi
- Pasir laut (sea sand) yang sudah dicuci dengan asam
- Sodium sulfat anhydrous
- n-Heksana
- Etanol absolut
- Kloroform, distabilkan dengan etanol
- Aluminium oksida 90 aktif, netral (tingkat aktiftas I). Diaktifasi dengan
cara : masukkan 100 gr AlO, kedalam erlenmeyer, tambahkan 12ml
air, aduk merata sampai tidak ada gumpalan dan biarkan selama 2 jam
Peralatan
- Peralatan laboratorium standar
- Labu bulat berdasar rata 500ml
- orbit shaker
- Centrifuge
- Rotary evaporator
- Kolom kromatograf, diameter 2mm, dilengkapi dengan saringan dan
serat
- Spektrofotometer
- Kuvet gelas, tebal 1cm

Cara Kerja
Persiapan Sampel
1. Minuman yang tidak jernih atau mengandung endapan harus dikocok
dulu sebelum dilakukan pengambilan contoh
2. Jumlah sampel yang diambil untuk analisa tergantung dari jenis
minuman yang dianalisa, biasanya sekitar 50ml atau 50gr.
Ekstraksi
3. Masukkan 50ml atau 50gr minuman kedalam labu bulat berdasar
rata, tambahkan 200-400ml kloroform
4. Kocok campuran dengan menggunakan orbit shaker selama 30menit
5. Centrifuge untuk memisahkan emulsi kloroform dan air
6. Buang fase aqueous (atas)dan ekstrak kloroform (bawah) disaring
dengan kertas wool yang dilapisi dengan sodium sulfat anhydrous.
Filtrat yang diperoleh disebut dengan ekstrak sampel.
7. Uapkan ekstrak sampel sampai kering dengan menggunakan rotary
evaporator dalam keadaan vakum dan suhu 10C
8. Jika masih ada air, tambahkan sedikit etanol kemudian diuapkan lagi
9. Jika perlu residu kering ditambah n-Heksana lalu diuapkan lagi untuk
menghilangkan sisa etanol, lalu tambahkan lagi n-Heksana sampai
volumenya 3-5ml, larutan ini disebut konsentrat karoten

Pemisahan Karoten dengan Kromatografi Kolom

1. Siapkan kolom kromatograf, masukkan pasir laut kedalam kolom sampai
setinggio 0,5cm. Kemudian masukkan aluminium oksida yang sudah
diaktifasi yang disuspensikan dalam n-Heksana. Tuang perlahan-lahan
suspensi kedalam kolom dan tepuk-tepuk kolom sehingga partikel
terdistribusi merata keseluruh kolom. Lanjutkan sampai tinggi lapisan
aluminium oksida 8-9cm. Kolom ini selalu dibasahi dengan heksana.
2. Pindahkan secara kuantitatif konsentrat karoten kedalam kolom dengan
bantuan pipet tetes, cuci wadah konsentrat dengan heksana, masukkan
cucian kedalam kolom
3. Lakukan elusi dengan menggunakan n-Heksana sampai seluruh karoten
yang berwarna kuning-orange keluar dari kolom. Elusi diakhiri apabila
eluen yang keluar dari kolom sudah tidak berwarna lagi. Tampung hasil
elusi dalam labu takar yang sesuai misalnya labu takar 100ml.
4. Tepatkan volume eluat dalam labu takar sampai tanda tera dengan
menggunakan heksana, larutan ini disebut larutan uji.
Pengukuran Spektrofotometrik
5. Ukur absorbans larutan uji dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 450nm, gunakan heksana sebagai blanko
6. Buat kurva standar, absorbans vs konsentrasi -karoten. Buat satu seri
larutan -karoten dengan konsentrasi 0,1-5 g/ml
7. Hitung konsentrasi karoten dalam sampel berdasarkan kurva standar yang
dibuat

Vitamin B1 : Metode Manual I

Pendahuluan
Metode ini dapat diterapkan pada semua bahan makanan

Prinsip
Tiamin, diekstrak dengan menggunakan asam encer panas, dan diurai (digest) dengan
fosfatase pada Ph 4,5. Ekstrak yang didapat dikromatografkan pada silikat basa dan tiamin
yang terelusi dioksidasi dengan ferisianida basa menjadi tiokrom, yang diukur secara
fluorometri.

Peralatan
- kolom kromatograf. Diameter internal 10mm, panjang 20cm. Sebuah labu penyimpanan
(reservoir) berkapasitas 30ml dapat dipasang dibagian atas kolom
- Labu oksidasi. Labu pemisah bertutup dan bercerat berkapasitas 100ml
- Spektrofluorometer. Panjang gelombang eksitasi 360nm, panjang gelombang emisi 435nm.
- Penangas air

Pereaksi
- Asam klorida 0,2N
- Asam sulfat 0,1N
- Asam asetat 3%
- Larutan potasium klorida 25% dalam aquadest
- Larutan potasium klorida asam
- Sodium hidroksida 15% dalam aquadest
- Potasium ferisianida basa
- Sodium asetat 2,5M
- Etanol
- Isobutanol
- Suspensi enzim (fosfatase)
- Silikat penukar basa aktif. Zeolit butiran buatan berukuran 60-90 mesh diaktivasi dengan cara:
a.Timbang 500gr silikat dan masukkan kedalam gelas piala 1
Liter
b.Tambahkan asam asetat encer secukupnya sampai seluruh silikat terendam
c. Panaskan pada 100C selama 15 menit dengan pengocokkan berkala
d.Dekantasikan cairan supernatan
e.Bilaslah residu dengan melakukan dekantasi menggunakan tiga porsi larutan potasium klorida
asam panas
f. Bilaslah silikat dengan air mendidih sampai air cucian bebas klorida
-. Larutan stok tiamin standar
-. Larutan kerja tiamin standar
-. Bromkresol hijau 0,1% dalam alkohol 20%

Cara Kerja
Ekstraksi
1. Timbanglah sejumlah sampel dan masukkan ke dalam tabung reaksi
100ml yang dilengkapi dengan gelas pengaduk
2. Tambahkan 50ml asam klorida 0,2N
3. Panaskan tabung selama 30menit dalam penangas air mendidih sambil
diaduk secara berkala
4. Periksalah apakah akhir digestion sampel masih asam dengan
menggunakan indikator bromkresol hijau. Apabila tidak, buang ekstrak
dan ulangi digestion dengan asam yang lebih pekat
5. Dinginkan ekstrak sampai suhunya dibawah 50C
6. Atur pH ekstrak sampai diantara 4-4,5 dengan sodium asetat (biasanya
dibutuhkan 5ml)
7. Tambahkan 5ml suspensi enzim dan aduk
8. Inkubasi pada suhu 37C selama semalam
9. Dinginkan ekstrak sampai suhu kamar
10.Pindahkan ekstrak kedalam labu takar 100ml dan encerkan sampai
tanda dengan aquadest
11.Saring ekstrak melalui kertas saring berporositas cepat. Apabila
diperlukan, encerkan ekstrak sampai mengandung tiamin tidak lebih
dari 0,05 g/ml

Pemurnian
1. Isilah kolom kromatograf dengan 6 gr silikat penukar basa
yang disuspensikan dalam aquadest
2. Biarkan air mengalir turun sampai tinggal 2mm diatas
permukaan silikat
3. Tambahkan 5ml asam asetat 3% kedalam kolom dan biarkan
mengalir turun seperti sebelumnya
4. Pipet dan masukkan 25ml ekstrak sampel kedalam kolom dan
biarkan mengalir turun
5. Buang eluat yang didapat
6. Cuci kolom 3x masing-masing dengan 10ml air mendidih dan
buang eluat yang didapat
7. Elusi tiamin dari kolom 2x masing-masing dengan 10ml
potasium klorida panas (hampir mendidih)
8. Kumpulkan eluat dan masukkan kedalam labu takar 25ml
9. Dinginkan pada suhu kamar, dan encerkan sampai tanda tera
dengan larutan potasium klorida asam, kocok sampai merata.

Oksidasi Tiamin
1. Pipet larutan sampel masing-masing sebanyak 10ml dan
masukkan masing-masing kedalam labu pemisah yang
berbeda
2. Kedalam labu pemisah pertama, tambahkan 5ml larutan
potasium ferisianida basa (larutan uji) dan kedalam labu
pemisah kedua tambahkan 5ml sodium hidroksida 15%
(blanko)
3. Kedalam keduanya masukkan 5ml etanol dan kocok merata
4. Tambahkan masing-masing 25ml isobutanol jenuh air
5. Campur merata dengan melewatkan nitrogen kedalam
larutan selama 2menit
6. Ambil dan buang lapisan aqueous yang berada dibawah
sampai tinggal 1ml dengan tabung blow-out
7. Tambahkan etanol kedalam lapisan isobutanol, kocok dengan
hati-hati dan jaga agar lapisan aqueous tidak terganggu
8. Pipet masing-masing 10ml alikuot larutan kerja tiamin standar
dan masukkan masing-masing kedalam labu pemisah 100ml
yang berbeda. Ulangi tahap 2-7

Pengukuran Fluoresensi
1. Atur panjang gelombang eksitasi pada 360nm dan panjang gelombang emisi
435nm
2. Isilah sebuah sel fluorometer dengan asam sulfat 0,1N dan sebuah sel lainnya
dengan larutan alikuot, lapisan isobutanol yang diperoleh dari tahap 8 oksidasi
tiamin
3. Atur fluorometer sampai memberikan angka nol untuk asam sulfat 0,1N dan
angka 100 untuk larutan standar
4. Ukur semua larutan sampel dan blanko
Perhitungan
Misalkan : berat sampel (gr) = W
volume ekstrak (ml) = 100
alikuot hasil oksidasi (ml) = 10
pembacaan sampel = Ts
pembacaan blanko sampel = Tb
pembacaan standar = Ss
pembacaan blanko standar = Sb
Fluorosensi tiokrom dalam sampel = Ts - Tb
Fluorosensi tiokrom dalam standar = Ss Sb
Maka :
Kadar tiamin dalam sampel (mg/100gr) = Ts Tb
Ss Sb
W

0,5

Catatan
1. Salah satu contoh enzim fosfatase yang sesuai
yaitu Taka-diastase yang dikeluarkan oleh
Serva ( Heidleberg, Jerman)
2. Salah satu contoh silikat penukar ion yang
sesuai yaitu Zerolit S/F (Decalso F)
3. Pengukuran flourosensi dari isobutanol
sebaiknya dilakukan selambat lambatnya
10menit
4. Hindarkan larutan isobutanol dari cahaya
matahari, karena dapat menyebabkan
kerusakan thiokrom

VITAMIN B1 METODE
MANUAL II
Metode ini dapat di terapkan untuk
vitamin B1 serealia.

PRINSIP
Sama seperti pada penetapan vitamin
B1 metode manual I, hanya pada
tahap digest dilakukan dengan
pemanasan pada otoklaf pada tekanan
15 lb/in2 selama 30 menit.

Pereaksi
1. Larutan sodium asetat
larutan 272 g NaOAC.3H2 O dalam air dan encerkan sampai volume 1
liter.
2. Bahan pengisi kolom: silikat penukar ion basa.
3. Larutan potasium klorida netral
larutkan 250 g KCl dalam air dan encerkan sampai volume 1 liter.
4. Larutan potassium klorida asam
tambahkan 8,5 ml HCl pekat kedalam 1 liter larutan KCl netral.
5. Larutan sodium hodroksida 15%
6. Larutan potassium ferisianida 1% dalam air
7. Larutan pengoksidasi
Encerkan 4 ml larutan potassium ferisianida 1 % menjadi 100 ml
dengan menggunakan larutan NaOH 15%
8. Isobutanol
Didistilasi kembali dan dijenuhkan dengan air.
9. Larutan kerja tiamin standar 1 g/ml.

PERALATAN
1. Flourometer
2. Ph meter
3. Kolom kromatograf

CARA KERJA
A. Persiapan sampel
1. Hancurkan sampel serealia dengan blender
kering atau willey mill sampai terbentuk tepung.
2. Timbang 1,00 g sampel, masukkan kedalam
labu ukur 100 ml.
3. Tambahkan 20 ml HCl 0,1 N
4. digest dalam otoklaf selama 30 menit pada
tekanan 15 lb/in2 . Angkat dan biarkan dingin
5. Atur Ph larutan menjadi 4,5 dengan
menggunakan larutan natrium asetat.

B. Pemurnian
1. Tempatkan sedikit glass wool pada dasar kolom kromatograf
(gunakan buret, jika tidak ada) yang berisi air dengan bantuan gelas
pengaduk.
2. Suspensikan 1,0 2,0 g Thiochrome decalso (silikat penukar ion
basa) dalam 10 ml air, kemudian masukkan kedalam kolom. Hindari
terperangkapnya udara di dalam kolom dengan cara mempertahankan
cairan tetap berada diatas permukaan silikat.
3. Masukkan ekstrak sampel yang sudah disaring yang diperkirakan
mengandung sekitar 15 g tiamin (dipipet tepat) kedalam kolom. Cuci
berturut turut dengan 5 ml air yang hamper mendidih sebanyak 3 kali.
Buang eluat yang keluar.
4. Elusi tiamin dari kolom dengan melewatkan berturut-turut 4 ml larutan
KCl asam yang hamper mendidih sebanyak 5 kali.. Tampung eluat
yang keluar dalam labu takar 25 ml. Encerkan eluat sampai tanda tera
dengan larutan KCl asam.

C. Oksidasi Dan Pengukuran Fluoresensi

1. Masukkan masing-masing 1,5 g KCl kedalam 4 tabung reaksi besar.
2. Tambahkan masing-masing 5 ml larutan elut kedalam masing masing
tabung reaksi tersebut.
3. Sambil digoyang memutar secara kontinyu, tambahkan 3 ml larutan
pengoksiadasi kedalam dua tabung reaksi. Dua tabung sisanya tidak
ditambahkan larutan pengoksiadsi (blanko).
4. Tambahkan segera 10 ml isobutanol kedalam masing-masing tabung,
tutup dengan paraflm kocok merata.
5. Siapkan blanko, dengan menambahkan masing-masing 3 ml larutan
NaOH 15% kedalam dua tabung reaksi yang tidak ditambah larutan
pengoksidasi, lalu lakukan tahap 4.
6. Ulangi tahap 1 sampai 4 dengan menggunakan 5 ml larutan tiamin
standar.
7. Dekantasi lapisan isobutanol. Masukkan kedalam kuvet, ukur
fluoresesnsinya pada panjang gelombang eksitasi 365 nm dan emisi

VITAMIN B1 METODE HPLC

Metode ini dapat diterapkan pada
semua bahan makanan.

PRINSIP
Vitamin B1 diekstrak dari makanan dengan
hidrolisa asam. Perlakukan dengan papain
dilakukan untuk menghilangkan senyawa
pengganggu analisis berupa protein, sedang
perlakukan dengan diastase dilakukan untuk
membevaskan vitamin dari bentuk fosfatnya.
Filtrat jernih yang didapat kemudian dielusi
pada kolom HPLC dan eluen yang mengandung
vitamin B1 kemudian dioksiadasi dengan
potassium ferisianat menjadi tiokrom dan
diukur fluoresensinya dengan fluorometer.

PEREAKSI
1. Asam sulfat 0,25 N. Encerkan 7 ml asam sulfat (BJ 1,84) menjadi 1 liter dengan
aquades
2. Larutan buffer. Larutkan 160 g sodium hidroksida dalam aquades dan encerkan
sampai 500 ml. larutkan 272 g asam asetat glasial (BJ 1,04) dalam aquades dan
encerkan sampai 500 ml. Campur kedua larutan tersebut dalam jumlah yang
sama.
3. Takadiastase. Siapkan suatu suspense yang mengandung 100 mg diastase per ml
4. Papain. 12000 E/g. siapkan suatu suspense yang mengandung 100 mg papain per
ml.
5. Asam trikloro asetat. Larutkan 45 g asam trikloro asetat dalam aquades dan
encerkan sampai 100 ml.
6. Merckosob SI 60. silica gel untuk HPLC, ukuran partikel 10 micron. Disuplai oleh
merck jerman
7. Larutan pengelusi Ph 6,5. Larutkan 11,88 g disodium hydrogen fosfat dihidrat (Na 2
HPO4 . 2H2O) dalam aquades dan encerkan sampai 1 liter. Larutkan 9,08 g
potassium dihidrogen fosfat (KH2PO4) dalam air dan encerkan menjadi 1 liter.
Campur 150 ml Na2 HPO4 dengan 350 ml larutan KH2PO4, encerkan sampai 1 liter
dengan aquades. Kemudian tambahkan 120 ml etanol.

8. Ferisianida basa. Siapkan segar setiap hari. Larutkan 0,5 g potassium

ferisianat dalam 50 ml aquades. Larutkan 15 g sodium hidroksida
dalam aquades, dinginkan sampai suhu kamar, dan encerkan sampai
100 ml. campur 24 ml larutan sodium hidroksida, 1 ml potassium
ferisianat dan 25 ml aquades.
9. Larutan stok tiamin standar. 500 g/ml. larutkan 125 mg tiamin
hidroklorida dalam aquades, tambhakan 20 ml asam sulfat 0,25 N
dan 2 ml asam trikloro asetat 45%. Kemudian encerkan sampai 250
ml dalam labu takar dengan air. Simpan dalam tempat gelap pada 0
4 C
10.Larutan kerja tiamin standar. 4 g/ml. pipet 2 ml larutkan stok tiamin
standar dan masukkan ke dalam labu takar 250 ml. encerkan sampai
tanda tera dengan aquades

PERALATAN
Otoklaf. Dapat menghasilkan uap air bertekanan 15 lb/in 2 atau 2
atm (pada 121 C)
Penangas air. Dengan suhu 40-50C dan 50-60 C
Centrifuge berkecepatan tinggi. Maksimum 300000 x g
Tabung centrifuge. Kapasitas 50 ml
Peralatan untuk HPLC. Bagian bagian yang harus ada antara lain
adalah:
1. Pompa bertekanan tinggi
2. sampler dengan tabung sampel berkapasitas 1,7 ml
3. Kolom logam. 12,5 cm x 0,46 cm diameter dalam. Isi kolom (packing)
merckosorb SI 60 dengan ukuran partikel 10 micron.
4. Sampel loop 60 l.
5. Detektor fluorimeter dengan sel yang dapat di aliri sampel. Panjang
gelombang eksitasi 366 nm, emisi 464 nm.

Pompa pengatur

CARA KERJA
1.

Timbang tepat sejumlah sampel yang mengandung 0,5 g padatan

(misalnya apabila kadar air sampel 80%, timbang 2.50 g) dan masukkan
ke dalam tabung centrifuge 50 ml.

2.

Tambahkan aquades menggunakan pipet mohr sampai kandungan air

total menjadi 2 g (misalkan sampel mengandung air kurang dari 10%
maka aquades yang dibutuhkan adalah 2 ml)

3.

Pipet dan masukkan 2 ml larutan kerja tiamin standar kedalam sebuah

tabung centrifuge lainnya (catatan: untuk setiap 5 tabung sampel di
perlukan satu tabung standar)

4.

Tambahkan kedalam masing masing tabung 10 ml asam sulfat 0,25 N

5.

Tutup tabung tabung tersebut dengan menggunakan aluminium foil

6.

Panaskan dalam otoklaf pada 121 C (15 lb/in2 ) selama 30 menit

7. Dinginkan, dan tambahkan 1,5 ml larutan buffer. Kocok sampai Ph nya

mencapai 4,6
8. Tambahkan 1 ml suspense takadiastase dan kocok merata.
9. Letakkan tabung dalam penangas air bergoyang pada 40 C selama
25 menit.
10.Tambahkan 1 ml larutan papain, kocok merata dan lanjutkan
pemanasan selama 2 jam pada 40 -45 C
11.Tambhakan 2 ml asam trikloro asetat, kocok merata
12.Panaskan tabung selama 5 menit dalam penangas air 50-60C
13.Centrifuge tabung selama 5 menit pada kecepatan 300.000 x g
14.Injeksikan secara manual 60 g supernatant kedalam kolom HPLC
atau setara otomatis. jika secara otomatis, isi tempat sampel pada
sampler sampai penuh.
15.Kromatografkan dengan kecepatan aliran 1 ml per menit dan

PERHITUNGAN
Tinggi puncak sampel = h
Tinggi puncak standar = H
Berat sampel (g) = W
Maka:
Kadar tiamin dalam sampel (mg/100mg) sebagai tiamin
klorida HCl
= (8 x h x 100)/ W x H x 1000 = 0,8 H/W x H
Catatan:
1. Periksa setiap batch enzim yang digunakan dengan
metode yang menggunakan kokarboksilase sebagai
substrat. Apabila perekasi ini memberikan nilai blanko,
koreksi tinggi puncak sampel maupun standar
2. Hindarkan seluruh prosedur kerja dari cahaya UV langsung

Vitamin B2
Metode : manual 1
Prinsip: Riboflavin diekstrak dengan
menggunakan asam encer panas.
Setelah diatur pHnya hingga mencapai
4,5 ekstrak disaring dan dihilangka
warnanya menggunakan potasium
permanganat dan hidrogen peroksida.
Fluorosensi ekstrak yang sudah
dihilangkan warnanya diukur
menggunakan larutan ditionit sebelum
dan sesudah reduksi, perbedaannya

pereaksi
1. Asam klorida 0,2 N. encerkan 18 ml asam klorida (BJ. 1,18) menjadi 1 liter
dengan aquades.
2. Asam sulfat 0,1 N. encerkan 28 ml asam sulfat (BJ. 1,84) menjadi 1 liter dengan
aquades
3. Asam klorida 1 N. encerkan 80 ml asam klorida (BJ. 1,18) menajdi 1 liter
aquades.
4. Sodium hidroksida 40%. Larutan 40 gram sodium hidroksida dalam aquades
dan encerkan smapai 100 ml.
5. Asam asetat glasial. BJ 1,05
6. Potasium permanganat 3%. Larutkan 3 gram potasium permanganat dalam
akuades dan diencerkan sampai 100 ml
7. Sodium ditionoit. Na2S206. 2H2O padat.
8. Larutan stok riboflavin standar, 25 mikrogram/ml. Larutkan 25 miligram
riboflavin dalam 3 ml asam asetat glasial, panaskan apabilaperlu dan encerkan
sampai 100 ml dengan aquades. Hindarkan dari sinar matahari langsung.
9. Larutan kerja riboflavin standar, 0,1 mikrogram/ml. encerkan 4 ml larutan stok
riboflavin standar menjadi 1 liter dan ahindarkan dari sinar matahari langsung.

Cara kerja
a. Ekstraksi
1. Timbangalah sejumlah sampel (jangan lebih dari 5. g, dan perkirakan agar
mengandung riboflavin minimum 10 mikrogram) dan masukan ke dalam labu
erlenmeyer.
2. Tambhakan 50 ml asam klorida 0,2 N, kemudian tutup dengan gelas piala
terbalik
3. Otoklaf sampel pada (121 c) selama 15 menit
4. Dinginkan dan tuang kedalam gelas piala 100 ml
5. Tambahkan sedikit demi sedikit sodium hidroksida 40% ke dalam ekstrak
sambil diaduk sampai pH-nya mencapai 6,8
6. Lakukan langkah 5 dengan menggunakan asam klorida 1 N sampai pH
ekstrak 4,5.
7. Pindahkan ekstrak ke dalam labu takar 100 ml dan encerkan dengan
aquades sampai tanda tera.
8. Saring ekstrak melalui kertassaring berporositas cepat. Apanila perlu,
encerkan ekstrak ini sampai mengandung roboflavin kurang lebih 0,1
mikrogram/ml

b. Dekolorisasi Ekstrak
1. Pipet ekstrak empat kali masing-masing 10 ml dan
masukkan masing-masing ke dalam empat tabung
reaksi 25 ml.
2. Tambahkan masing-masing 2 ml larutan kerja
riboflavin standar ke dalam tabung.
3. Tambahkan maisng-masing 2 ml aquades ke dalam
kedua tabung yang lain.
4. Tambahkan 1 ml asam asetat glasial ke dalam
masing-masing tabung dan kocok.
5. Tambahkan 0,5 ml potasium permanganat 3% dan
kocok.
6. Dua menit kemudain tambahkan 0,5 ml hidrogen
peroksida 3% dan campur.
7. Lakukan pengukuran fluoresensi secepat mungkin.

Pengukuran Fluoresensi
1. Atur Fluorometer hingga memberi angka 0
terhadap asam sulfat 0,1 N dan atur 100 terhadap
sampel + standar pada panjang gelombang 525
nm.
2. Ukur masing-masing fluoresensi dari keempat
tabung diatas.
3. Kemudian tambahkan 20 miligram sodium ditionit
kedalm masing-masing tabung dan kocok. Ukur
blanko tidak lebih dari 10 detik sesudah
pencampuran ( blanko dala hal ini ialah tabung
reaksi yang terdiri sampel saja dan yang terdiri
sampel + standar).

perhitungan
Misalkan .
Berat sampel (g) = W
volume ekstrak = 100
Alikuot yang didekolorisasi (ml) = 10
Pembacaan sampel+standar
= T
pembacaan sampel = S
pembacaan blanko sampel = Sb
pembacaan sampel+blanko standar
= Tb
Maka, : Flouresensi sampel+standar = T Tb
Flouresensi sampel = S Sb
Flouresensi standar (0,2 mikrogram) = (T Tb) ( S Sb)
Dan, : kadar riboflavin dalam sampel (mg/100g) =
(S Sb ) x 0,2
(T Tb) (S Sb)
W

Metode :
HPLC
Prinsip : vitamin B2 diekstrak dari makanan
dengan hidrolisa asam. Perlakuan dengan
papain dilakukan untuk menghilangkan
senyawa pengganggu analisis berupa
protein. Sedangkan perlakuan dengan
diastase dilakukan untuk membebaskan
vitamin dari bentuk fosfatnya. Filtrat jernih
yang didapat kemudian dielusi pada kolom
HPLC dan vitamin B2 kemudian diukur
langsung dengan fluorometer.

Pereaksi
1.
2.

3.
4.
5.
6.
7.

8.

9.

Asam sulfat 0,25 N. Encerkan 7 ml asam sulfat (BJ, 1,84) menjadi 1 liter dengan
aquades.
Larutan buffer. Larutkan 160 gram sodium hidroksida dalam aquades dan
encerkan sampai 500 ml. larutkan 272 gram asam asetat glasial(BJ. 1,04) dalam
aquades dan encerkan 500 ml. campur merata larutan tersebut dalam jumlah
yang sama.
Takadiastase. Siapkan suatu suspensi yang mengandung 100 miligram diastase
per ml.
Papain 12.000 E gram. Siapkan suatu suspensi yang engandung 100 mg papain
per ml.
Asam trikloro asetat. Larutkan 45 gram asam trikloro asetat dalam aquades dan
encerkan sampai 100 ml.
Merckosorb SI 60. silika gel untuk HPLC , ukuran partikel 10 mikron.
Larutan pengelusi pH 4.6. larutan 27,2 gram sodium asetat trihidrat
(CH3COONa.3H2O) dalam akuades dan encerkan menjadi 1 liter. Larutkan 12 gram
asam asetat dalam air dan encerakan menjadi 1 liter. Campurkan kedua larutan
tersebut dalam jumlah yang sama dan encerkan lima kali.
Larutkan stok riboflavin standar, 1,5 mikrogram/ml. Timbang 15.0 mg riboflavin
dan masukkan ke dalam labu takar 500 ml yang berisi 300 ml akuades hangat.
Tambahkan 40 ml asam sulfat 0,25 N dan 4 ml asam trikloroasetat 45%. Kocok
sampai semua riboflavin larut dan encerkan sampai 500 ml dengan akuades.
Simpan dalam tempat gelap pada suhu 0-4 derajar celcius
Larutan kerjan riboflavin standar. 1,5 mikrogram/ml . Pipet dan masukan ke dalam
labu takar 200 ml sebanyak 10 ml larutan stok riboflavin standar. Encerkan sampai
tanda tera dengan aquades.

Cara kerja
1.

2.

3.

4.
5.
6.
7.

Timbang tepat sejumlah sampel yang mengandung 0.5 gram padatan

(misalnya apabila kadar air sampai 80%, timbang 2.50 gram) dan
masukan ke dalam tabung sentrifus.
Tambahkan akuades menggunakan pipet Mohr sampai jumlah air total
mejadi 2 gram.( misalkan sampel mengandung air kurang dari 10% maka
akuades yang dibutuhkan adlah 2 ml).
Pipet dan masukan 2 ml larutan kerja riboflavin standar ke dalam tabung
sentrifus lainnya ( catatn: untuk setiap 5 tabung sampel diperlukan satu
tabung standar:
Tambahkan ke dalam tabung masing-masing 10 ml asam sulfat.
Tutup tabung-tabung tersebut dengan aluminium foil.
Panaskan dalam otoklaf pada 121 derajat selama 30 menit.
Dinginkan, dan tambahkan 1,5 ml larutan buffer. Kocok sampai pH-nya
mencapai 4.6

Lanjutaan
1. Tambahkan 1 ml takadiastase dan kocok merata.
2. Letakkan tabung penangas air bergoyang pada 40-45 derajat
selama 25 menit
3. Tambahkan 1 ml papain. Kocok merata, dan lanjutkan
pemanasan selama 2 jam pada 40-45 derajat
4. Tambahkan 2 ml asam trikloro asetat kocok merata
5. Panaskan tabung selama 5 menit dalam penangas air 50-60
derajat
6. Sentrifus tabung selama 5 menit pada kecepatan 30.000 x
gram
7. Injeksikan secara manual 60 mikrogram supernatan atau
secara otomatis ke dalam kolom HPLC
8. Ukur tinggi puncak untuk sampel dan standar pada
kromatogram

perhitungan
Misalkan , tinggi puncak sampel = h
tinggi puncak standar = H
berat sampel (g) = W
Maka, kadar riboflavin dalam sampel (mg/100g)
= (3/W) X (h/H) X ( 100/1000)
= 0,3H/W x H

Terima kasih