m.K.

Dasar Teknologi Mikrobial

TIN 232 2(2-0)

Kuliah VI.

PENYIAPAN INOKULUM & METODE KULTIVASI

Departemen Teknologi Industri Pertanian – FATETA IPB

2012
 KULTIVASI DALAM BIOPROSES

Penyiapan Inukulum Penyiapan/ formulasi media

Mikroba
Inokulasi secara Sterilisasi
aseptik

Perakitan bioreaktor dan strerilisasi

Kultivasi: Sampling dan Pemanenan

-Pengontrolan suhu
-Pengontrolan pH Analisis hasil kultivasi
-Pengontrolan aerasi
-Pengontrolan agitasi
-Pengontrolan busa
PENYIAPAN INOKULUM
 Inokulum :
kultur mikroba yang diinokulasikan ke dalam media
kultivasi  kultur mikroba aktif yang dipanen pada fase
pertumbuhan eksponensial

Kurva Pertumbuhan
(pada Kultivasi
Curah)

http://www.google.co.id/imglanding?q=batch+culture
Kriteria Inokulum :

1. Sehat & berada dalam keadaan aktif

2. Tersedia dalam jumlah cukup, sehingga memenuhi ukuran
optimum inokulum (3-10 % v/v)
3. Berada dalam morfologi yang sesuai (A. niger  pelet)
4. Bebas kontaminasi oleh mikroba lain yg tdk dikehendaki
5. Dapat mempertahankan kemampuannya untuk membentuk
produk yang diinginkan (secara genetik stabil)

Dipengaruhi oleh media kultur yang

digunakan
  Penyiapan inokulum :
 ditujukan untuk memperbanyak sel, bukan pembentukan
produk
 komposisi media untuk inokulum mungkin berbeda dengan
media kultivasi (N tinggi  C/N lebih kecil)
 untuk mempersingkat fase adaptasi, sebaiknya media kultur
untuk inokulum mirip dengan media kultivasi

 Jumlah inokulum 3 – 10 % (v/v), sehingga kultur induk (kultur

stok) yang dorman (tidak aktif) harus dikembangkan beberapa
tahap, tergantung ukuran bioreaktor yang akan digunakan

Pengembangan inokulum bertahap (multistaging)

Kultur
stok

Penyegaran Labu Labu Tangki Teraduk Tangki Teraduk

Kultur Thp I Thp II Thp I Thp II
 Media cair
Agar miring

Inokulum

Bioreaktor
Kultur Penyegaran Propagasi
Stok (reaktivasi)
(dorman)

Kultivasi
Pada Bioreaktor
• Penting diperhatikan pada Pengembangan Inokulum :
Resiko kontaminasi cukup besar  harus dilakukan secara aseptis
& dilakukan pengujian kemurnian kultur (a.l cek dg mikroskop)

• Contoh Penyiapan Inokulum

Bakteri Clostridium sp (produksi aseton-butanol)

Tahap Kondisi Kultur Media

I Rekonstitusi isolat ampul
II Inokulasi ke media 600 ml
III Inokulasikan 90 ml ke dlm 3 L
(labu erlenmeyer 4 L)
IV Inokulasi ke dalam bioreaktor
25.000 L
V Inokulasi ke dalam bioreaktor
300.000 – 2.500.000 L (0,5 – 3
%)
Potato Glucose Broth (pepton)
Gula 4 % (Molase)
(NH4)2SO4 5 %, CaCO3 6 %,
fosfat 0,2 %
Idem Thp II
Idem Thp II (6 % gula)
Idem Thp IV ditambah amonia
Penyiapan Inokulum Kapang

• Sebagian besar kapang membentuk spora aseksual  untuk

pembuatan inokulum biasanya digunakan suspensi spora
sebagai inokulum  Contoh : Penicillium chrysogenum
(penisilin), Aspergillus niger (asam organik : contoh asam
sitrat), Actynomicetes (antibiotika)

• Inokulasi spora langsung dapat mengurangi biaya produksi,

 inokulasi setelah spora bergerminasi dapat
mempersingkat waktu kultivasi

• Produksi spora dapat dilakukan dengan menggunakan media

padat (agar, biji-bijian : kedelai, bekatul, beras, jagung giling,
barley, malt dll) atau media cair

• Pada kultivasi cair (kultur terendam)  komposisi media &

konsentrasi spora akan mempengaruhi bentuk kapang (filamen
atau pelet)
konsentrasi spora : bentuk filamen  viskositas
: bentuk pelet (gumpalan)  viskositas
 METODE KULTIVASI
• Terdapat tiga metode kultivasi berdasarkan cara operasi
bioreaktor : - curah (batch)
- sinambung (continuous)
- semi sinambung (fed batch)

(Curah) (Semi sinambung)

(Sinambung)
KULTUR CURAH
Pelaksanaan kultivasi :
• Bioreaktor diisi dengan media segar steril lalu
diinokulasi kultur mikroba (inokulum)  merupakan
sistem tertutup

• Pada akhir kultivasi, isi bioreaktor dikeluarkan untuk

dilakukan pemanenan (proses hilir)

• Bioreaktor selanjutnya dibersihkan dan disterilisasi

untuk digunakan pada kultivasi berikutnya
Penyiapan/pembersihan bioreaktor
repot
Selama kultivasi kondisi “unsteady-state”
(S,P dan X berubah selama kultivasi)
KURVA PERTUMBUHAN KULTIVASI CURAH

http://www.omicson
line.org/ArchiveJM
BT/2010/May/03/J
MBT-02-064.php

(■) reducing sugar; (Δ)-lactic acid, (●) cell growth - with pH control and
(□) reducing sugar; (Δ)-lactic acid, (O) cell growth - without pH control.
(de Lima et al., 2010)
 Kultur Curah (Batch)
Neraca Biomassa
Akumulasi sel  pertumbuha n sel - pengeluara n - sel mati
dX FX
rX = dX/dt  X   sel mati
dt V
 0  0
dX
 X  rx = X
dt
dX
  dt
X
ln X  ln X 0  t  Plot ln X vs t akan memperoleh nilai 
Ln X
Keterangan : 
 : laju pertumbuhan spesifik (waktu-1)
F : laju alir (vol/waktu) t
X : konsentrasi biomassa (g/l)
Aplikasi Kultur Curah :

Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer

dan metabolit sekunder

Untuk produksi biomassa  digunakan kondisi kultivasi

yang mendukung pertumbuhan biomassa (nutrisi/O2 unt
m.o aerob mencukupi), sehingga mencapai maksimal

• Untuk prodiksi metabolit primer  kondisi kultivasi harus

dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi
dengan sintesis produk (pengaturan konsentrasi substrat)

• Untuk produksi metabolit sekunder  kondisi kultivasi

harus dapat memperpendek fase eksponensial dan
memperpanjang fase stasioner  pengaturan nutrisi
media
KULTUR SINAMBUNG
• Media segar secara kontinyu ditambahkan ke dalam
bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan
kultivasi dikeluarkan dg laju alir yanga sama (Sistem
Terbuka)
• Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi
menggunakan media segar yang masuk, dan pada
saat yang bersamaan produk, produk samping
metabolisme dan sel dikeluarkan dari bioreaktor
• Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih
sedikit pembersihan dibandingkan sistem curah.
• Dapat mengatur konsentrasi sel mikroba untuk
mengoptimalkan waktu tinggalnya (retensi), sehingga
meningkatkan produktivitasnya.
 Imobilisasi sel , contoh : melekatkan mikroba pada
carrier atau menempatkan sel dalam matriks alginat
 Ciri khas : kondisi lingkungan (suhu, pH, O2 dan
konsentrasi nutrien) dapat dipertahankan tetap (steady-
state)  kons. biomassa atau µ (laju pertumbuhan
spesifik) dapat diatur & konstan dipertahankan selama
kultivasi (dg mengatur kons. substrat umpan)

Source :
Microbial G
rowth

Kultivasi sinambung (Kemostat) : laju pertumb. dikendalikan

oleh komp. tunggal pd medium (substrat pembatas)
 X = yx/s (S – S)
  Kultur
Kultur Sinambung
Sinambung
F0 (l/jam) F (l/jam)
S0 (g/l) S (g/l) F (laju alir)
X0 (g/l) = 0 X (g/l) F0 = F
(umpan steril m.o) X
S Kultur sinambung dijalankan setelah
Neraca Biomassa : V tercapai Xmaks
Sel masuk - Sel keluar  Sel tumbuh - Sel mati  Akumulasi sel
F F dX
Xo  X  X  X 
V V dt
 0  0  0
F
 X  X  0
V
F F
X  X     D
V V
pada kondisi tunak (steady state)    D (jam-1)  S, P dan X tetap

Keterangan : D = laju dilusi = F/V (jml vol kultur yang melalui bioreaktor)
http://sbli.ls.manchester.ac.uk/fungi/21st_Century_Guid
ebook_to_Fungi/Ch17_11.htm
X,S,P

X S

Kurva Pengaruh D ( laju dilusi = F/V) pada Kultur Sinambung

(D menggambarkan lamanya umpan berada di dlm bioreaktor )

Kultur Sinambung :

1. Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi (mikroba

rekombinan kadang tidak stabil sifat genetiknya)
2. Produktivitas lebih tinggi
3. Dapat dijalankan pada waktu yang lama
4. Harus ada pasar/konsumen ang tetap terhadap produk
5. Cocok untuk proses yang resiko kontaminasinya rendah
(contohnya penanganan limbah cair) & produk yang berasosiasi
dengan pertumbuhan
6. Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana
7. Tidak ada akumulasi produk yang menghambat
 4-EG : ethyl guaicol

Immobilized glutaminase and immobilized cells of P. halophilus, Z. rouxii, and C. versatilis

http://www.nzdl.org/gsdlmod?e=d-00000-00---off-0hdl--00-0----0-10-0---0---0direct-10---4-------0-1l--11-en-50---20-about---00-0-1-00-
0-0-11-1-0utfZz-8-00&a=d&c=hdl&cl=CL1.1&d=HASH8403ef70002be1ecf3acbb.6.5
Aplikasi Kultur Sinambung :

 Merupakan ‘alat’ untuk penelitian fisiologi dan biokimia

mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju
pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir umpan (laju
pertumbuhan dikendalikan oleh konsentrasi substrat
pembatas)  dapat digunakan untuk penelitian,
contohnya pengaruh substrat pembatas thd kinerja
mikroba, untuk perbaikan sistem curah/semi sinambung

 Untuk produksi PST (protein sel tunggal)

 contoh ICI (Imperial Chemical Industries), menggunakan
substrat metanol  bioreaktor kombinasi “air-lift” dan
“loop reactor”
http://www.nzdl.org/gsdlmod?e=d-00000-00---off-0hdl--00-0----0-10-0---0---0direct-10---4-------0-1l--11-en-50---20-about---00-0-1-00-
0-0-11-1-0utfZz-8-00&a=d&c=hdl&cl=CL1.1&d=HASH8403ef70002be1ecf3acbb.6.5
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022998000982
Produki Etanol secara Sinambung dengan
Daur-ulang Sel Khamir

http://collections.infocollections.org/ukedu/en/d/Jb23ale/6.html#Jb23ale.
6
KULTUR Semi Sinambung (FED BATCH)

• Media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor secara

kontinyu/sekuensial tanpa pengeluaran isi bioreaktor
http://www.thefullwiki.org/Fed-batch

• Pada saat isi bioreaktor penuh, bioreaktor dikosongkan, baik

sebagian atau seluruhnya dan proses dimulai kembali.

• Harus disediakan ruang dalam bioreaktor (head space) untuk

penambahan media

Meskipun total biomassa meningkat terhadap waktu, namun

konsentrasi sel tetap mengingat volume juga meningkat, akibat
ada penambahan media/umpan

dX/dt = 0  μ ~ D (quasy-steady state)

http://sbli.ls.manchester.ac.uk/fungi/21st_Century_Guidebook_to
_Fungi/Ch17_10.htm
Kelebihan Kultur Semi Sinambung :

Karena dapat mempertahankan konsentrasi substrat pada

level rendah, sehingga :
- mencegah efek represi katabolit akibat konsentrasi substrat
yang tinggi (contoh glukosa)
- dapat dilakukan pengontrolan laju pertumbuhan mikroba
dan mengatur kebutuhan oksigen bagi mikroba

Contoh :
•Produksi Saccharomyces cerevisiae (ragi roti) : secara
industri diproduksi dengan cara semi sinambung dengan
mempertahankan konsentrasi glukosa tetap rendah, sehingga
rendemen biomassa maksimum dan meminimumkan produksi
hasil samping etanol
• Produksi Penisilin (metabolit sekunder) : dengan kultivasi
2 tahap (thp I : glukosa unt. Prod. biomassa dan thp II :
glukosa untuk prod.penisilin)
 Silva et al. 1998 Braz. J. Chem. Eng. vol.
15 n. 4 São Paulo Dec. 1998

Concentration profiles of glucose, biomass and

cephalosporin C (CPC) during fed-batch fermentation
KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBA
Kurva Pertumbuhan
Bila sel ditumbuhkan pada kultur curah, maka sel akan tumbuh dengan
melalui : fase lag, fase eksponensial (fase log), fase stasioner dan
akhirnya fase kematian

http://www.google.co.id/imglanding?q=batch+culture
• Fase Eksponensial :

(diturunkan dari neraca massa)

• Keterangan :
X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor
(g/l bobot kering)
µ = laju pertumbuhan spesifik (1/jam)
t = waktu (jam)

• Model pertumbuhan mikrobial ini dikenal sebagai

Model Pertumbuhan Eksponensial
• Plot antara ln[Sel] terhadap waktu akan menghasilkan
hubungan garis lurus pada fase eksponensial
• Mengapa populasi sel meningkat dengan cara eksponensial ?
• Perhatikan sel tunggal (contoh bakteri) di dalam bioreaktor.
Sel ini membelah diri tiap satuan waktu.
• Populasi sel pada tiap waktu generasi dapat digambarkan sbb.

Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel  2  4  8 …. dst

1  21  22  23  24 …………..  2n = N (jumlah sel)

Pangkat (eksponen) n = jumlah generasi

Growth of Microbial Populations
 Laju spesifik pertumbuhan (µ) :
- Menggambarkan kecepatan reproduksi sel.
- Semakin tinggi nilainya, maka semakin cepat sel tumbuh.

Model Pertumb Eksponensial

 Pada saat fase eksponensial, laju spesifik pertumbuhan relatif tetap

 Hasil integrasi :

Finally:
Terakhir:

Persamaan di atas menggambarkan hubungan eksponensial

antara konsentrasi biomassa dengan waktu
• Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik :

Plot antara ln X vs t akan menghasilkan garus lurus.

Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = tD) dengan
laju spesifik pertumbuhan

• tD menggambarkan waktu yang diperlukan untuk

menggandakan populasi sel menjadi 2X jumlah(kons) semula
 menggambarkan laju pertumbuhan sel
• Selama fase eksponensial tD relatif konstan

• Hubungan antara tD dengan laju pertumbuhan spesifik

 bila konsentrasi biomassa menjadi dua kali dari X0 menjadi
X1 selama waktu penggandaan tD (= t 1- t0) :

tD = = 0.692/µ
During the exponential phase, each microorganism is dividing
at constant intervals. Thus the population doubles in number
during a specific length of time called the generation
(doubling) time .

For a given species of a bacterium, the doubling time, td, is a

kind of species-specific, unchangeable characteristic: every
bacterial species has a particular, genetically fixed doubling
time under optimal growth conditions.

The doubling time of a given bacterial species growing

optimally can thus be regarded as a fixed value.

For many common bacteria, the generation time is quite

short, 20-60 minutes under optimum conditions. For most
common pathogens in the body, the generation time is
probably closer to 5-10 hours.
The relationship between the number of bacteria in a
population at a given time (Nt), the original number of
bacterial cells in the population (No), and the number of
divisions those bacteria have undergone during that time (n) :

Nt = No X 2n

For example, Escheichia coli, under optimum conditions, has

a generation time of 20 minutes. If one started with only 10 E.
coli (No = 10) and allowed them to grow for 12 hours (n = 36;
with a generation time of 20 minutes they would divide 3
times in one hour and 36 times in 12 hours),
the number of bacteria after 12 hours (Nt )
Nt = 10 X 236 = 687,194,767,360 E. coli