Tonang Dwi Ardyanto

Pendidikan:
Dokter : S1 (UNS - 1999)
PhD : S2 leading to S3 (Tottori Univ Japan - 2006)
SpPK : PPDS PK UNS (2011)
Pengalaman : Singapore, Australia, Thailand, Perancis, Italia, Swiss, Vietnam
Pekerjaan/Afiliasi:
Dosen FK dan Pascasarjana UNS
Wakil Direktur Pelayanan dan Diklit (2015-2019) Wadir Diklit (2020-2023)
Laboratorium Klinik Prodia 2011-sekarang
Konsultan UTD PMI Surakarta 2011-sekarang
Bidang Organisasi PP PDS Patlin 2016-2019, 2020-2022
Kompartemen JKN PP PERSI 2016-2019, 2019-2022
Bidang JKN ARSADA 2016-2019
 Covid, Ct dan Viral Load
KARS, 11 Desember 2020
@ 11/12/2020 Tonang Berbincang

Menempatkan pada Tempatnya

Tonang Dwi Ardyanto
Tes Covid-19
 Paparan ini terutama terkait
screening dan diagnostik

IFCC Information Guide on COVID-19 -

Monday 28 September updates
https://www.ifcc.org/ifcc-news/2020-03-26-ifcc-
information-guide-on-covid-19/#BM
 Basis
Pemeriksaan
Antibodi Antigen
PCR

https://www.medchemexpress.com/literature/article/COVID-19.html
  Standard PCR (conventional ) : PCR
Jenis PCR  RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) : RT-PCR / rt-PCR
 Real Time PCR (qRT-PCR)
 PCR Covid itu Bukan
“Rahasia”
Sekadar penjelasan sederhana, terlalu sederhana bagi yang paham
tentang Pemeriksaan PCR
@ 17/10/2020 Tonang
Berbincang

Menempatkan pada Tempatnya

Tes Covid-19 Tonang Dwi Ardyanto
 Pengambilan sampel,
mendapat hasil swab,
kan isinya beragam?

Isi hasil swab bermacam-macam:

ada sel manusia, mungkin bakteri,
virus, jamur .... banyak lagi

Tonang Dwi Ardyanto

https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-applications/
 PEMURNIAN Kalau isinya beragam,
bagaimana tahunya
ada virus covid?

Sel-sel dipecah, RNA dalam sampel dipisahkan

dari yang lain, difiltrasi kemudian ditampung
tersendiri. Selain RNA, dibuang. Namanya RNA yang terkumpul, belum tentu virus
“purifikasi” atau Pemurnian covid. Bisa juga ada RNA virus lain,
bakteri, jamur atau sel-sel lain.
Tonang Dwi Ardyanto

https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-applications/
 PEMURNIAN RNA manusia atau
virus? Jangan-jangan
RNA manusia, RNA
orang itu sendiri

Justru seharusnya ada RNA manusia dalam sampel

yang diperoleh. Keberadaan RNA manusia itu
menjadi salah satu indikator keberhasilan swab dan
purifikasi.

Mengapa?
Karena virus covid berada di dalam sel manusia sebagai Tonang Dwi Ardyanto
inangnya.
https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-applications/
 cDNA itu bayangan
cermin utuh dari RNA.
Kok harus Ibarat pasangan sejati,
semua saling bersesuaian.
Bila ketemu cDNA
dijadikan pasangannya, berarti ada
RNA cDNA
cDNA? RNA yang dicari

Lho, ya beda
Proses awal pemeriksaan,
kan dengan
RNA yang ada dalam RNA virus
sampel diubah menjadi yang dicari?
cDNA. Karena PCR bekerja
pada DNA.
Tonang Dwi Ardyanto

https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-applications/
 PENGUJIAN Namanya kunci
identifikasi, tentu
dalam urutan yang
bersambung awal
dan akhir agar saling
mengunci, harus
unik, harus khas,
tidak salah mengenali
urutan target.

Kok tahu
kalau itu Untuk memastikan ada tidaknya RNA virus
RNA Virus Covid, digunakan PRIMER. Ini semacam kunci
identifikasi. Ada dua kunci: ujung awal
Covid?
(Forward) dan ujung akhir (Reverse).

Tonang Dwi Ardyanto

https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-applications/
 Penyusun RNA dan
DNA bagi semua virus
dan sel memang
hanya pola urutan
dari 4 “huruf” itu.
Ada puluhan sampai
ratusan ribu
“huruf” pada virus,
lebih banyak lagi pada
bakteri atau jamur,
apalagi pada
manusia, bisa sampai
sekian milyar.
Ini KUNCI Ini salah satu contoh Primer-nya.
nya.... Bukan Kok katanya sama dengan RNA
Rahasia manusia? Jangan-jangan keliru?

Tonang Dwi Ardyanto

https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-applications/
 Primer sebagai kunci
identifikasi, harus
ringkas, pendek, dan
berurutan tapi harus
unik, harus khas, tidak
boleh salah kenal
urutan lain

Wah, bisa
Urutan “huruf” itu bisa ada bagian yang sama
keliru SARS
dengan pada virus lain atau bahkan manusia?
Bisa saja. Pada sebagian urutan yang menyebar dari CoV kalau
pola urutan sekian juta atau milyar “huruf” tadi. begitu?
Ini KUNCI Tapi urutan keseluruhan tetap berbeda-beda. Juga
nya.... Bukan sebaran “kromosom”nya (kelompok gen). Kalau
menyebar, tidak bisa dijadikan kunci (primer awal-ujung).
Rahasia Tingkat kemiripannya juga bervariasi. Dengan manusia,
sangat sedikit kemiripannya. Dengan SARS CoV ada
Tonang Dwi Ardyanto
kemiripan sampai 78-88%.
https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-applications/
 Dalam laporan ilmiah
dan panduan dari
lembaga-lembaga
internasional atau
pemerintahan,
primer memang
dibuka untuk umum
agar semua dapat
menggunakannya.
Tapi kunci-kunci itu
harus sudah lolos uji

Ini KUNCI Ini sekadar contoh saja. Ada beberapa Diuji

nya.... Bukan contoh lain. dengan
Rahasia Kok diumumkan?
apa?
Iya, karena memang bukan rahasia.
Tonang Dwi Ardyanto

https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-applications/
 Primer yang dibuat,
harus mampu
mengidentifikasi
dengan benar virus
covid, tapi tidak
boleh SALAH KENAL
terhadap virus lain.
Maka ada uji validasi
lebih dulu sebelum
boleh digunakan
untuk pemeriksaan

Ini KUNCI Diuji dengan apa? Dengan kontrol positif.

nya.... Bukan Dapatnya dari mana? Dari genom virus
Rahasia covid.
Apakah genom virus covid itu rahasia?
Sama Tonang Dwi Ardyanto

sekali Bukan Rahasia, semua orang bisa

 Prinsip Dasar PCR Templat
e
salts DNA
 Setiap siklus (cycle) terdiri dari 3 langkah: (ions) DNA
1- Denaturation Polymer
ase
2 Primer annealing
3 Primer extension dNT
Ps Primers
 Pada RT-PCR didahului oleh Proses
Reverse Trancriptase
 Pada qRT-PCR, siklus dihitung secara real-
time

Bila RNA, didahului

Reverse Trancriptase
 Bagaimana
kunci itu
bekerja?
Primer awal (Forward) dan akhir
(Reverse), melekat pada urutan cDNA yang
sesuai.
Kemudian terjadi pemotongan pada
bagian yang terlekati primer (target DNA) Pada potongan itu terlekati Probe.
Bila Probe melekat, akan terpancar fluoresensi.
Adanya fluoresensi ini ditangkap oleh sensor.

Tonang Dwi Ardyanto

https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/real-time-polymerase-chain-reaction
 Apa nilai CT Potongan cDNA hasil perlekatan
primer, akan mengalami penggandaan
itu?
(amplifikasi) secara eksponensial.

Jumlah dari berapa kali terjadi

amplifikasi ini disebut Cycles Times
(CT) atau Cycle Number.

Nilai CT TIDAK secara langsung

menunjukkan JUMLAH VIRUS, hanya
secara relatif menunjukkan
seberapa banyaknya virus covid
pada sampel yang diperiksa.
Setiap kali terjadi amplifikasi dan menghasilkan potongan baru, Semakin tinggi nilai ct, semakin
probe kembali melekat dan memancarkan flouerensi. sedikit
Sensor terus menangkap dan menghitungnya. Terhitunglah nilai CT- virus covid pada sampel
nya, sampai melewati suatu ambang batas. Tonang Dwi Ardyanto
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/real-time-polymerase-chain-reaction
 Kok bisa
menyebut
positif?

Setiap terjadi penggandaan, jumlah cDNA

berlipat, nilai ct bertambah.
Sampai dapat terjadi, jumlah penggandaan
melewati ambang batas tertentu.
Saat itu, nilai ct juga mencapai angka
tertentu.
Bila hasil amplifikasi bisa melewati ambang,
berarti ada RNA virus covid dalam jumlah yang
cDNA
cukup pada sampel. Disebutlah POSITIF.
Kemudian dicatat juga bahwa ambang batas
terlewati pada nilai ct tertentu.
Tonang Dwi Ardyanto
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/real-time-polymerase-chain-reaction
 Kok bisa
menyebut
negatif?

Bila sejak awal memang tidak ada RNA covid,

maka tidak terbentuk cDNA Covid.
Walau sudah digandakan berapa kali pun,
tetap saja tidak ada hasilnya, tidak bisa melewati
ambang batas.
Maka disebut hasilnya NEGATIF
cDNA

Tonang Dwi Ardyanto

https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/real-time-polymerase-chain-reaction
Apa makna klinis ct value pada
covid?

Tonang Dwi Ardyanto

 European Journal of Clinical
Microbiology & Infectious Diseases
(2020) 39:1059–1061 (27 April 2020)
Hanya virus
hidup yang Total 183 pasien, 129 kultur positif(5 dari
tumbuh pada sub-kultur). Pada ct 13-17, 100% kultur
media kultur positif; kemudian menurun progresif,
tinggal 12% pada ct 33 dan 0% pada ct >
34. Pada 5 sub-kultur, ct = 27-34, sinkron
dengan hasil pertama.

We propose that each center perform Virus could not be isolated or

Hanya virus hidup yang
d ipsoaltatmesewneurealrkobtanainecdovdi ke
No cultured aft
its own correlation between culture
fraomansamg lainples taken after day
er day 11 of illness
(NCID Positio n Singapore,

or 23/5/2020)
results and
8 in spite of ongoing high viral
viral RNA load from
pak
When the Ct value was 30 or loads .
Sampai pada nilai ct ber
Aah n ilai ct linier
S am pl es tha t irus higher
contained dan(i.e.hari
whenkeviral
berapa low), apa
load is masi
terh ad ap pe rtu m bpatients’
<10 6 c opi es pe r u han v no menular?
ml, ne ve r
samples
viable virus (based on being able
RT-PCR
h
yielde d an siol a te (Nature volume
da k utlu r ? to culture the virus) has been found
p
581, pages465–469(2020) (NCID Position Singapore, 23/5/2020)

a
• Berapa kali harus dilakukan amplikasi untuk mencapai batas minimal flouresensi tertentu (cut-off)
• Ct proporsional terhadap jumlah virus (viral load), tapi tidak secara langsung menujukkan jumlahnya
• Semakin besar ct, semakin kecil jumlah virusnya, sampai mencapai batas tertentu sebagai ct maksimal
• Setiap reagen dan mesin RT-PCR memliki spesifikasi yang tidak selalu sama, sehingga ct value berbeda (Tonang, 16/7/2020)
 WHO Singapore CDC
(27 Mei 2020) (28 Mei 2020) (29 Mei 2020)
Pasien di isolasi RS: bila
Pasien Simptomatis: Symptom-based Strategy:
klinis sehat setelah hari ke
minimal 10 hari sejak 21, dipulangkan tanpa test,
minimal 10 hari sejak onset
onset gejala PLUS 3 hari gejala dan 3 hari terakhir bebas
diteruskan isolasi mandiri
bebas gejala gejala
7 hari

Pasien Asimptomatis: Gejala ringan-sedang di

tempat isolasi luar RS: 21 Pasien tanpa gejala: minimal 10
10 hari sejak dinyatakan
hari hari sejak dinyatakan positif
positif

• Kriteria pengakhiran isolasi pada pasien konfirmasi Covid-19.

Test-based Strategy
• Pengakhiran isolasi TIDAK otomatis berarti dipulangkan dari RS. Dapat
terjadi perpindahan ke ruang non isolasi covid untuk masalah di luar (bila tersedia):
covid. PCR negatif, minimal 2 kali
• Hanya pada kondisi kapasitas PCR masih kurang berturut-turut, berjarak >24 jam

(Tonang, 16/7/2020)
 Gejala? Dimana? Cek PCR? Sampai kapan? Yaki
aman?
n
10 hari tanpa gejala SELESAI

10 sejak timbul gejala + 3 SELESAI

hari bebas gejala

10 sejak timbul gejala + 3 SELESAI

hari bebas gejala

1x PCR negatif + minimal Lanjut Isolasi Mandiri

3 hari bebas gejala 7 hari

SEBELUMNYA
SEKARANG Pedoman
Real
: Selesai isolasi (13hasil
apabila
Kemenkes Julipemeriksaan
2020) : Rekomendasi WHO 26 Mei 2020 (penjelasan Risiko
1. Tanpa gejala: isolasi mandiri sampai 10 hari dua kali
Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pada 17 Juni 2020) dalam hal keterbatasan
berturut-turut (jeda minimal 24 jam) menunjukkan hasil
2. Ringan-sedang: minimal 10 hari sejak timbul gejala + 3
negatif (sampai Pedoman Edisi ke 4).
kapasitas pemeriksaan PCR atau waktu tunggu
terlalu lama. Bila memungkinkan, tetap lebih
minimal
hari bebas gejala Tanpa Evaluasi PCR
3. Berat/kritis: 1x PCR negatif + minimal 3 hari bebas gejala baik dengan evaluasi pemeriksaan PCR Tonang Dwi Ardyanto
Data suggest that lower Ct values may be associated with worse
outcomes and that Ct values may be useful in predicting the
clinical course and prognosis of patients with COVID-19;
however, further studies are warranted to confirm clinical
value
While reporting of qualitative SARS-CoV-2 test results as
.
positive or negative is sufficient for diagnosis, the reporting of
Ct values may offer benefit to clinicians in making clinical and
patient-management decisions for patients with COVID-19 as
well as guide infection control, public health and occupational
health decisions.
SARS-CoV-2 viral loads may aid in the risk stratification of
patients with COVID-19, and therefore its role in disease
pathogenesis should be further explored.
We segregated patients into 3 genomic load groups: low
(Cycle threshold (Ct) ≥35), intermediate (25 < Ct < 35), and
high (Ct ≤ 25) using real-time polymerase chain reaction.
a high genomic load of SARS-CoV-2 at the time of
admission is an independent predictor of adverse
outcomes, that above and beyond age, comorbidity, and
severity of illness on presentation, may be used to risk-
stratify patients
Viral Load berhubungan dengan
derajat penyakit dan stratifikasi risiko.
Masih perlu penelitian lebih lanjut

While we recognize the importance of studying laboratory
results and their relevance to care of patients with COVID-19,
we wish to inform your readers of potential caveats that must
be considered when applying published findings regarding Ct-
values to their own patients’ results
Ct values from viral RNA can vary depending on method of
specimen collection, specimen source, transport, and the time
from infection to collection to analysis
no standard exists to validate quantitative assays that produce
comparable results from labs and manufacturers
Although specimens with lower Ct-values generally have more
viral RNA than specimens with higher Ct-values, the
quantitation and precision associated with those differences in
Ct-values have not been determined
PCR Ct values may vary significantly between assays, even
those using the same gene target. During the COVID-19
pandemic, it has become common for clinical laboratories
to perform multiple real-time PCR assays to detect SARS-
CoV-2. Therefore, including the Ct value on all positive
results may be confusing and misleading to ordering
providers
Labs should not routinely report the Ct value. Instead,
they should provide it to physicians verbally on a case-by-
case basis. This approach allows for clarification of the
assay used for testing and a discussion of the limitations
associated with using the CT value while interpreting the
result.
Apakah ct value sebanding dengan jumlah
virus Covid?

Tapi belum tentu sebanding dengan

jumlah virus dalam tubuh pasien
Tonang Dwi Ardyanto
Mengapa ct value belum tentu sebanding
dengan jumlah virus Covid?

Proses ekstraksi dan PCR juga

berpengaruh, maka ada internal control
untuk menilai efektivitas ekstraksi
Tonang
Dwi
Ardyanto
 Selesaiisolasi mandiri, kok
swab masih positif?
@ 26/10/2020 Tonang Berbincang

Menempatkan pada Tempatnya

Tes Covid-19 Tonang Dwi Ardyanto
 Tes Covid sesuai perjalanan Penyakit
Pasien Tanpa Gejala atau Ringan-
Inkubasi
Sedang
Penyembuhan
(Gambar sebagai Ilustrasi)

Infeksi Primer Infeksi Sekunder / Re-infeksi

Viral Load atau titer antibodi

RNA Virus
IgG

IgM IgG
Antigen

Sel Memori IgM

Level
deteksi
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 21 (hari, data median)

PCR/TCM PCR/TCM PCR/TCM

Positif Positif / Negatif Negatif (bisa positif bila terjadi reinfeksi)

RT Antigen : RT Antigen : RT Antigen :

REAKTIF Non Reaktif Non Reaktif

RT Antibodi : RT Antibodi : RT Antibodi :

Non Reaktif Reaktif Reaktif
(Tonang, 24/04/2020, revisi 11 Juni 2020)
 Selesai isolasi, kok PCR masih positif?

Dapat dinyatakan sembuh secara klinis,

tanpa pemeriksaan PCR lagi Tonang
Dwi
Ardyanto
Pergeseran paradigma ke Fase Infeksius

Tonang Dwi Ardyanto

 More than 50% of infections identified by PCR-based
surveillance had PCR cycle threshold values in the mid-
to-upper 30s, indicating low viral RNA counts.
Although such low counts could imply either an early
or a latestage infection, the long duration of the RNA
positive tail suggests that most infected people are
being identified after the infectious period has passed.

RT antigen

Michael J. Mina, et al. Rethinking Covid-19 Test Sensitivity — A Strategy for Containment. NEJM. 2020
 ... to shift our attention from a narrow focus on the
analytic sensitivity of a test (the lower limit of its
ability to correctly detect small concentrations of
molecules in a sample) to the more relevant measure
of a testing regimen’s sensitivity to detect infections
(the probability that infected persons learn they’re
infected in time to be filtered out of the population
and prevent spread to others)
RT antigen

Michael J. Mina, et al. Rethinking Covid-19 Test Sensitivity — A Strategy for Containment. NEJM. 2020
 Eur J Clin Microbiol
When the Ct value was 30 or Infect Dis 39, 1059–1061
(2020). https://doi.org/
higher (i.e. when viral load is 10.1007/s10096-020-
03913-9
low), no viable virus (based on
being able to culture the
virus) has been found (NCID Position
Singapore, 23/5/2020)

Samples that contained <106

copies per ml, never yielded
an isolate (Nature volume 581,
pages465–469(2020)
Isu yang mengemuka:
To detect patient in the
most infectious period
 RT-LAMP for
Covid-19
Reverse transcription loop-
mediated isothermal
amplification

FDA 2 November 2020

Bersifat Kualitatif,
Tidak memberikan nilai ct

Laporan Sensitivitas
bervariasi, sesuai nilai ct
sampel, antara 30-90%.
Mendekati 100% bila ct
value < 20
•
•

•
 LoD: FDA SARS-CoV-2 Reference Panel
Results

NAAT Detectable Units/ mL

PerkinElmer New Abbott RealTime SARS- CDC 2019-nCoV Real- Thermo TAQPATH Abbott ID NOW COVID-
Coronavirus Nucleic CoV-2 assay (5400) Time RT-PCR Diagnostic COVID-19 COMBO KIT 19 (300.000)
Acid Detection Kit (180 Xpert Xpress SARS- Panel (CDC) (18.000) (180.000) Lyra Direct SARS-CoV-2
NDU/mL)
CoV- BioMérieux SARS-COV- Luminex ARIES SARS- Assay (540.000)
Hologic Aptima SARS- 2 test (5400) 2 R-GENE (18.000) CoV-2 Assay (180.000)
CoV-2 assay (600) Qiagen NeuMoDx Color Genomics SARS- Qiagen QIAstat-Dx
Euroimmune SARS- CoV-2 RT-LAMP Respiratory SARS-CoV-2
EURORealTime SARS- CoV-2 Assay (5400) Diagnostic Assay Panel (180.000)
Cov-2 (1800) (18.000)
Sherlock CRISPR SARS-
Roche cobas SARS-CoV- CoV-2 Kit (6000)
2 (1800)

Higher Potential false negative

High SENSITIVITY low
FDA (2020) (available at https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-covid-19-and-medical-devices/sars-
cov-2-reference-panel-comparative-data). 22,11,2020
Tonang
Tentang
Berbincang: Tonang Dwi Ardyanto

Covid