PCR

Troubleshooting

Disampaikan oleh :
Zakiyah Widowati. MSi

BIMBINGAN TEKNIS PEMERIKSAAN CMNV

JAKARTA, 10-11 SEPTEMBER
2019
 Definisi
• PCR troubleshooting
(TS) adalah kumpulan
kesalahan teknik yang
menyebaban reaksi
PCR tidak berjalan
sempurna sehingga
tidak menghasilkan
produk PCR yang
optimum.

http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/genetic-engin/pcr.html
•Fungsi Trouble Shooting
PCR troubleshooting digunakan untuk

– Meningkatkan spesifisitas primer

– Meningkatkan jumlah produk PCR
– Meningkatkan kualitas produk PCR
Faktor-faktor yang mempengaruhi
keberhasilan PCR

• Jenis sampel/ jaringan yang digunakan

dalam mengekstraksi DNA
• Kuantitas dan kualitas DNA
• Panjang fragmen DNA yang diamplifikasi
• Spesifisitas Primer
Aspek-aspek Trouble Shooting
• Kontrol kontaminasi
• Pencegahan kontaminasi oleh RNAse
• PCR yang optimum (Optimasi)
• Strategi Trouble shooting (TS)
Kontrol Kontaminasi
Meminimalisasi kemungkinan kontaminasi dalam
bekerja dengan PCR:
• Memisahkan ekstraksi DNA/RNA
• Persiapan sebelum kerja PCR (pre-PCR)
• Fasilitas penanganan setelah pengujiana PCR
pemisahan ruang dan peralatan pengujian (filter
tip)
• Penggunaan kontrol negatif untuk ekstraksi
DNA/RNA
Kontrol Kontaminasi RNA
Prosedur penanganan RNA untuk mencegah
kontaminasi RNA
• Menggunakan gloves dalam penangan reagen dan
sampel RNA
• Menggunakan plasticwere dan glasswere yang
bebas RNAse
• Penggunaan larutan (air dan buffer) yang telah
ditreatmen dengan 0,1% DEPC
Optimasi PCR

Faktor yang berpengaruh pada PCR

• Suhu denaturasi dan waktu (dsDNA, half time
polymerase)
• Suhu dan waktu annealing
• Suhu dan waktu elongasi
• Reaksi buffer (KCL,Mg2+)
• Jumlah siklus amplifikasi (tergantung pada konsentrasi
template)
Optimasi PCR

Determinasi suhu annealing yang optimal dengan PCR

gradient :
• Menguji suhu annealing pada satu block
eksperimen (PCR gradient)

A-H : perbedaan suhu

annealing
Troubleshooting Annealing
• Variasi suhu annealing pada optimasi
primer

Cycle Temperatures Reasoning

94o - 55o - 72o Well-matched primers
94o - 48o - 68o Poorly matched primers
94o - 45o - 65o “Fishing expedition”
94o - 40o - 65o Do these primers work?
•Troubleshooting Annealing
Memanjangkan waktu annealing

– Memungkinkan primer dapat menempel pada

DNA template yang komplemen.
– Dapat meningkatkan kuantitas produk PCR
– Tetapi dapat menurunkan spesifisitas primer dan
menyebabkan terjadinya smear
•Troubleshooting Annealing
Ramping: Peningkatan suhu annealing secara
bertahap menjadi suhu ekstensi.

– Enzim taq polymerase memerlukan waktu

tambahan untuk mencapai suhu optimum
sebelum proses amplifikasi
– Penempatan primer yang tepat pada step ekstensi
akhir
•Troubleshooting
Pengaturan parameter PCR lainnya :

– Konsentrasi Magnesium Chloride (MgCl2)

– Konsetntrasi template DNA
– Konsentrasi dNTP
– Konsentrasi Primer
Trouble shooting : sedikit atau tidak ada produk PCR
Kemungkinan Masalah
Reagen :
• Komposisi reagen tidak tepat, konsentrasi
enzim terlalu sedikit
• Enzym inactive
• dNTP mengalami degradasi
•Konsentrasi Mg 2+ tidak optimal
Kondisi Amplifikasi :
•Suhu dan waktu denaturasi tidak tepat
• suhu dan waktu annealing tidak tepat
• Waktu ekstensi terlalu pendek
• Jumlah cycle terlalu sedikit
Saran
•Cek konsentrasi , kondisi penyimpanan,
dan ulangi proses PCR
• Ganti dengan enzim yang baru
• Ganti dengan dNTP yang baru, hindari
freeze thaw berulang ulang
• Optimasi konsentrasi(0,5 mM/step)
• optimasi suhu (0,5°C/step), tambahkan
waku pada step pre denaturasi
• Kurangi suhu (2°C/step), tingkatkan waktu
annealingnya
• tambahkan waktu (1 menit/step)
• Tambahkan jumlah cycle (5 cycle/step
Trouble shooting : sedikit atau tidak ada produk PCR
Kemungkinan Masalah
Primer :
• Desain primer tidak optimal
• Konsentrasi tidak optimal
Template
• Template awal tidak optimal
• Konsentrasi terlalu rendah
•GC konten terlalu tinggi (>50%)
Saran
• Cek primer desainnya
• Optimasi konsentrasi, dimulai dengan
konsentrasi 0,1-0,5 µM(0,1 µM/step)
• Cek konsentrasi, qualitas dan hilangkan
EtOH dr DNA. Buat pengencerannya, ulangi
proses ekstraksi dan gunakan internal
control
• Tingkatkan jumlahnya , terlalu banyak
template dapat menginhibisi reaksi PCR,
nested PCR
• Gunakan PCR enhancer
Trouble shooting : non specific bands
Kemungkinan Masalah
Reagen :
• Konsentrasi Mg2+ tidak optimal
Primer :
• Desain primer tidak tepat
• Konsentrasi primer terlalu tinggi
Kondisi Siklus PCR :
• Suhu dan waktu annealing tidak tepat
• Jumlah siklus terlalu tinggi
• Tidak ada suhu awal (hot start)
Saran
• Coba konsentrasi rendah
• Desain primer direview lagi (spesifisitas
hrs tinggi untuk mendapat target)
• Kurangi konsentrasi (0,1 µM/step)
• tingkakan suhunya (2°C/step), kurangi
waktu annealing
• Kurangi jumlah siklusnya
• Tambahkan suhu awal (hot start)
Trouble shooting : Smear (Difusi)
Kemungkinan Masalah
Reagen :
• Konsentrasi enzym terlalu tinggi
• Mg2+ tidak optimal konsentrasinya
Primer :
• desain primer tidak tepat
• Konsentrasi primer terlalu tinggi
Kondisi siklus :
•Jumlah siklus terlalu banyak
• Suhu annealing terlalu rendah
Template
• Konsentrasi terlalu tinggi
• Kontaminasi
Saran
• kurangi konsentrasi enzym
• optimasi konsentrasi (0,5 mM/step)
• Review kembali desain primer
• kurangi konsentrasi primer (0,1 µM/step)
• Kurangi jumlah siklus
• Naikkan suhu annealing (2°C/step)
•Ulangi PCR dengan pengenceran template
secara bertingkat / serial
•Cek cara kerja (reagen . Etc)
TERIMAKASIH
 Low yield or no PCR product

Possible causes Remarks/Remedie

Insufficient number of PCR cycles Replace the PCR vials and run an extra
5 cycles

DNA-template degenerated Check DNA quality by electrophoresis

Thermocycler programme is not correct Check temperatures and cycle time

thermocycler
Temperature is too low in some areas of Start a controle PCR at several positions
the thermocyler in the thermocyler
Thermocycler is open The lid must be closed to obtain a better
heating and cooling regulation
Reduce the volume of sample in the
Inhibitors present, which slow down the reactionmix; carry out another ethanol
PCR precipitation with the samples
 Low yield or no PCR product
Possible causes
Missing reaction component
Unsuitable reaction conditions
Problems with mineral oil
PCR vials not autoclaved
Badly defined primers
Remarks/Remedie
Check the reaction components and
carry out a new PCR
Decrease annealing temperature and/or
increase elongation time for long
Amplicons.
Cover the reaction with high quality,
nuclease-free mineral oil. DON’T use
autoclaved mineral oil
Autoclaving PCR vials prevents
contamination, while inhibitors can not
interfer with the reaction
Primers should not be self-
complementary
or each others
complement. Try longer primers.
 Low yield or no PCR product
Possible causes
Incorrect primer specificity
Primer concentration too low
No optimal reaction conditions
Nucleotides degenerated
Target is not present in DNA template
Remarks/Remedie
Check whether primers are
complementary with the right DNA
strands
Check primer concentration and
increase concentration if necessary
Optimize Mg2+ concentration, annealing
temperature and elongation time. Always
vortex PCR buffer. Primers should be
present in equal
concentrations
Store nucleotides in frozen batches,thaw
quickly and keep on ice. Prevent
frequent freeze/thaw cycles
Rewrite the experiment or try another
region in the DNA template
 Several, non-specific amplification products
Possible causes
Sub-optimal reaction conditions
Badly defined primers
Primer concentration too high
Contamination with other template
Several targets present within the same
template
Remarks/Remedie
Optimize MgSO4/MgCl2 concentration,
annealing temperature, elongation time
and number of cycles to prevent
nonspecific priming. Keep the reactions on
ice, when all reagents are mixed
Primers should not be self-complementary
or each others complement, esp. near the
3'-end. Try longer primer and prevent 3
successive G’s or C’s at the 3'-end
Check primer concentration and
decrease concentration, if necessary
Use sterilized pipets and pipettips. Work
in separate rooms when pre and post
amplifying. Wear latex gloves
Develop new primers with a higher
specificity to the distinctive DNA
sequence
 Troubleshooting for PCR and multiplex PCR
Questions Solutions
• Decrease annealing time
• Increase annealing temperature
• Decrease extenstion time
• Decrease extension temperature to 62-68/C
• Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but
keep MgCl2 concentration at 1.5-2 mM
• Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but
keep dNTP concentration constant
• Take less primer
(More) longer unspecific • Take less DNA template
products. What can I do? • Take less Taq polymerase
• If none of the above works: check the primer for
repetitive sequences
• (BLAST align the sequence with the databases) and
change the primer(s)
• Combine some/all of the above
 Troubleshooting for PCR and multiplex PCR
Questions Solutions
• Increase annealing temperature
• Increase annealing time
• Increase extension time
• Increase extension temperature to 74-78/C
• Decrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep
MgCl2 concentra-tion at 1.5-2 mM
• Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep
dNTP concentration constant
(More) shorter unspecific • Take less primer
products. What can I do? • Take less DNA template
• Take less Taq polymerase
• If none of the above works: check the primer for
repetitive sequences
• (BLAST align the sequence with the databases) and
change the primer(s)
• Combine some/all of the above
 Troubleshooting for PCR and multiplex PCR
Questions
Reaction was working before, but now I
can’t get any product.
Solutions
Make sure all PCR ingredients are taken in
the reaction (buffer, template, Taq, dNTPs,
etc.)
Change the dNTP solution (very sensitive
to cycles of thawing and freezing,
especially in multiplex PCR).
If you just bought new primers, check for
their reliability (bad primer synthesis?)
Increase primer amount
Increase template amount
Decrease annealing temperature by 6-10/C
and check if you get any product. If you
don’t, check all your PCR ingredients. If
you do get products (including unspecific
ones) reaction conditions as described
abaove.
Combine some/all of the above.
 Troubleshooting for PCR and multiplex PCR
Questions Solutions
• Gradually decrease the annealing temperature to the
lowest possible.
• Increase the amount of PCR primer
• Increase the amount of DNA template
• Increase the amount of Taq polymerase
• Change buffer (KCl) concentration (higher if product is
lower than 1000 bp or lower if product is higher than
My PCR product is weak. 1000 bp)
Is there a way to increase • Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 :g/:l final
the yield? concentration).
• You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or
glycerol.
• Check primer sequences for mismatches and/or increase
the primer length by 5 nucleotides
• Combine some/all of the above.
 Troubleshooting for PCR and multiplex PCR
Questions Solutions
My two primers have very different An easy solution is to increase the length
melting temperatures (Tm) but I cannot of the primer with low Tm.
change their locus. What can I do to If you need to keep the size of the product
improve PCR amplification? constant, add a few bases at the 3' end. If
size is not a concern, add a few bases to
either the 3' or the 5' end of that primer.
 Low yield or no PCR product

Product B
• Insufficient number of PCR • Replace the PCR vials and
run an extra
• 5 cyclesFeature 3