Makalah Immunoblotting

Analisis Jurnal Imunoblotting: Uji Imunogenitas Protein

Rekombinan VP 2 Virus Infeksius Bursa pada Ayam

Oleh :
Kelompok II/2012 A
Abdul Wahid

(125130100111008)

Fransiska Ike

(125130100111009)

Nisa Tazkiyah

(125130100111010)

Markzy Brondy Laskmy

(125130100111011)

Febby Dewayanti Savitri

(125130100111012)

Bangun Dwi Yulian

(125130100111013)

Deasy Andini Ersya P.

(125130100111014)

Basofi Andra Aditama

(125130100111016)

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas
karunia dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan
Makalah Studi Kasus yang berjudul Analisis Jurnal Imunoblotting: Uji
Imunogenitas Protein Rekombinan VP 2 Virus Infeksius Bursa pada Ayam dalam
rangka memenuhi tugas terstruktur mata kuliah Immunoblotting, dengan dosen
pengampu Drh. Wawid Purwatiningsih, M.Vet,

Program Kedokteran Hewan,

Universitas Brawijaya, 2014.

Dalam penyusunan makalah ini, penulis banyak mendapatkan bantuan dan
dorongan dari teman-teman mahasiswa seangkatan tahun 2012 dan orang tua yang
selalu memberikan dukungan moral pada penulis.
Penulis menyadari bahwa penulisan makalah ini masih banyak kekurangan
dan kesalahan. Seperti pepatah tak ada gading yang tak retak. Oleh karena itu,
penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi perbaikan makalah
ini. Serta penulia berharap agar makalah ini dapat bermanfaat di masyarakat.
Malang, 17 Desember 2014
Penulis

Page ii of 22

DAFTAR ISI

HAL
HALAMAN JUDUL....................................................................................

KATA PENGANTAR ..................................................................................

DAFTAR ISI.................................................................................................

BAB I. PENDAHULUAN
1.1.

Latar Belakang................................................................................

1.2.

Tujuan ............................................................................................

1.3.

Manfaat...........................................................................................

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................

BAB III. PEMBAHASAN

3.1 Virus IBD dan Vaksin Rekombinan IBD ................................................

3.2 Isolasi Protein Rekombinan ....................................................................

3.3 Uji Imunogenitas dan Uji Tantang...........................................................

15

3.4 Analisis Hasil Penelitian..........................................................................

16

BAB IV. PENUTUP

4.1.

Kesimpulan ....................................................................................

20

4.2.

Saran ..............................................................................................

20

DAFTAR PUSTAKA...................................................................................

21

Page iii of 22

BAB I.
PENDAHULUAN
1.1

Latar Belakang
Saat ini banyak sekali vaksin yang dikembangkan untuk mencegah berbagai

macam penyakit yang spesifik. Kini vaksin banyak macamnya, antara lain adalah
vaksin live attenued yaitu

merupakan vaksin yang dibuat dengan memodifikasi

virus atau bakteri penyebab penyakit di laboratoriumdimana virus hanya dilemahkan

(Atkinson, 2000). Ada lagi vaksin innaktif yaitu pada dasarnya terbuat dari kuman,
virus atau komponennya yang dibuat tidak aktif Vaksin inaktif dihasilkan dengan
mengembangkan bakteri atau virus pada (pada umumnya dengan formalin), tanpa
menghilangkan sifat antigennya. Kemudian ada lagi vaksin polisakarida, yaitu
vaksin sub-unit yang inactivated dengan bentuknya yang unik terdiri atas rantai
panjang molekul-molekul gula yang membentuk permukaan kapsul bakteri tertentu.
Dan terakhir dan terbaru yaitu vaksin rekombinan yang merupakan vaksin yang
dibuat dengan rekayasa genetika (Atkinson, 2000).
Untuk menguji suatu vaksin, maka diperlukan adanya test imunologi pada
agen/ hewan. Test imunologi yang biasa digunakan adalah dengan pengukuran titer
antibodi dan uji ELISA. Namun uji tersebut hanya dapat mengimplementasikan
tinggi atau tidak antibodi yang terbentuk dalam hewan tersebut tanpa mengetahui
antigen apa yang spesifik sehingga bisa menaikkan titer antibodi. Maka dari itu,
perlu dilanjutkan indentifikasi melalui immunoblotting, salah satunya adalah teknik
Western Blotting.
1.2

Tujuan
1.2.1 Menjelaskan bagaimana penerapan teknik immunoblotting dalam
penelitian yang sudah ada.
1.2.2 Menjelaskan bagaimana penggunaan teknik immunoblotting khususnya
western blot dalam menguji keberhasilan vaksin.
1.2.3 Menjelaskan prinsip immunoblotting yang digunakan dalam menguji
vaksin.
1.2.4 Menjelaskan apakah immunoblotting adalah metode yang tepat untuk
mendeteksi keberhasilan vaksin.
Page 4 of 22

1.3

Manfaat Penulisan
1.3.1 Untuk mengetahui bagaimana penerapan teknik immunoblotting dalam
penelitian yang sudah ada.
1.3.2 Untuk mengetahui bagaimana penggunaan teknik immunoblotting
khususnya western blot dalam menguji keberhasilan vaksin.
1.3.3 Untuk mengetahui prinsip immunoblotting yang digunakan dalam
menguji vaksin.
1.3.4 Untuk mengetahui apakah immunoblotting adalah metode yang tepat
untuk mendeteksi keberhasilan vaksin.

Page 5 of 22

BAB II.
TINJAUAN PUSTAKA
Vaksin telah lama dikenal sebagai suatu substansi yang digunakan untuk
memperoleh respon imun terhadap mikroorganisme patogen. Vaksin pertama kali
ditemukan pada tahun 1796 oleh Edward Jenner yaitu vaksin virus cacar. Sejak saat
itu teknologi pembuatan vaksin telah berkembang dengan pesat dan berbagai jenis
vaksin untuk mencegah penyakit infeksi telah banyak digunakan. Vaksin generasi
pertama seringkali dapat bermutasi kembali menjadi virulen sehingga menimbulkan
efek yang tidak diinginkan. Oleh sebab itu biasanya jenis vaksin yang dilemahkan ini
tidak dianjurkan diberikan kepada penderita yang mengalami imunokompromais.
Sedangkan vaksin generasi kedua adalah vaksin mengandung mikroorganisme yang
dimatikan menggunakan zat kimia tertentu, biasanya dengan mengguna kan formalin
atau fenol, dalam penggunaannya sering mengalami kegagalan atau tidak
menimbulkan respon imun tubuh. Untuk mengatasi berbagai kelemahan yang terjadi
pada penggunaan vaksin generasi pertama dan kedua mulailah dikembangkan vaksin
generasi yang ketiga yaitu vaksin rekombinan yang juga dikenal dengan vaksin sub
unit. Vaksin subunit dibuat melalui teknik rekayasa genetika untuk memperoleh
fragmen

antigenik

dari

mikroorganisme,sehingga

disebut

dengan

vaksin

rekombinan (Radji M.2009).

Vaksin rekombinan mengandung protein antigen patogen yang diproduksi
dengan teknologi DNA rekombinan. Contohnya vaksin hepatitis B yang digunakan
untuk mencegah inveksi hepatitis B. Antigen virus hepatitis B yang telah diketahui
dapat menginduksi antibodi protektif adalah HbsAg (Hepatitis B Surface Antigen).
Gen pengkode HbsAg di klon dan di ekspresikan di E. coli, ragi (Saccaromyces
cerevisiae). Protein HbsAg yang diperoleh dari ragi digunakan sebagai vaksin
rekombinan pertama utnuk perdagangan pada tahun 1986, dan harganya lebih murah
daripada vaksin Hepatitis B konvensional (Gaffar, 2007). Adapun keunggulan dan
kelemahan vaksin rekombinan di bawah ini, antara lain:

Keunggulan vaksin rekombinan:

a) Aman, hanya mengandung antigen tunggal terhadap imunitas yang diharapkan.
b) Tidak menimbulkan penyakit.
Page 6 of 22

c) Tidak ada kemungkinan terkontaminasi patogen lain.

d) Jarang menginduksi reaksi yang tidak diinginkan.
e) Menjamin penyediaan kontinu dan mudah dari sumber yang aman.
f) Harga murah
g) Mencegah transmisi penyakit dengan tidak sengaja pada pegawai produksi dan
pemakai.
(Gaffar, 2007).
Kelemahan vaksin rekombinan adalah; protein antigen dapat mempunyai
konformasi yang berbeda dibandingkan bila terletak pada sel atau virus asal. Hal ini
dapat ditanggulangi dengan mentargentkan antigen rekombinan pada permukaan
suatu sel mikroorganisme. Vaksin ini disebut disebut dengan vaksin rekombinan
hidup karier (Gaffar, 2007).
Western Blot (WB) merupakan suatu teknik untuk menandai suatu protein
pada membran nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein
tersebut terpisahkan melalui elektroforesis. Protein tersebut kemudian dapat
dideteksi melalui metode autoradiografi, pelabelan dengan senyawa-senyawa
fluoresen, pelabelan dengan antibodi terikat protein, lektin atau gen pengikat spesifik
lainnya (Attwood, et al., 2006). Berdasarkan pengertian tersebut, WB dilakukan
melalui beberapa tahap, antara lain: tahap pertama (elektroforesis), tahap kedua
(elektrotransfer), dan tahap ketiga (deteksi) (Kindt, et al., 2007). Seperti pada
gambar dibawah ini:
Gambar 1. Tahapan Western Blotting

Page 7 of 22

BAB III.
PEMBAHASAN
3.1

Virus IBD dan Vaksin Rekombinan IBD

Penyakit IBD (Infectious Bursal Disease) merupakan penyakit menular pada

ayam dengan ciri khas menyerang bagian bursa fabricius pusat kekebalan pada ayam
umur muda. Hasil survei menunjukkan 80% kasus IBD terjadi pada ayam umur 3-5
minggu, 17 % terjadi pada ayam umur antara 6-10 minggu dan bisa terjadi sepanjang
bursa fabricius masih berfungsi, yaitu antara umur 1-16 minggu. Penyakit ini sudah
meluas di seluruh negara-negara industri ayam. Sebagai akibat kerusakan bursa
fabricius

maka

ayam

penderita

akan

mengalami

penurunan

kemampuan

menghasilkan antibodi (immunocompetence) yang akan berakibat terjadinya

kegagalan vaksinasi ND, Mareks dan lain-lain. Flok yang unggas yang terserang
IBD menjadi lebih peka terhadap infeksi penyakit-penyakit lain, seperti Coccidiosis,
ND, Mareks, Salmonellosis dan Pasteurellosis (William, 2005).
Virus penyebab IBD yang dikenal saat ini terdiri dari 2 serotipe yaitu serotipe
1 dan serotipe 2 yang dapat menginfeksi ayam dan kalkun. Serotipe 1 yang pertama
kali ditemukan disebut dengan strain klasik yang bersifat patogen dan strain yang
ditemukan kemudian di daerah Amerika merupakan strain varian yang sangat ganas
yaitu very virulent IBD (vvIBD). Virus IBD tersebut merupakan hasil mutasi dari
virus klasik, sementara serotipe 2 tidak bersifat ganas (Hirai dan Shimakura, 1974).
Virus ini tergolong dalam famili Birnaviridae. Sesuai dengan namanya, virus terdiri
dari 2 segmen utas ganda RNA, yaitu segmen A mempunyai ukuran 3300 pasang
basa, yang terdiri dari 2 bagian Open Reading Frame, yaitu A1 dan A2 (Denberg,
2000). Segmen A1 merupakan penyandi protein VP2 (40 kD), VP3 (32 kD), VP4 (28
kD). Protein VP2 dan VP3 membentuk capsid virus, VP2 membentuk bagian luar
capsid, sedangkan VP3 membentuk bagian dalam capsid. Protein VP4 merupakan
protease virus. A2 merupakan penyandi protein non structural VP5 (17 kD) yang
kemungkinan terlibat dalam pelepasan virus dari sel serta berperan dalam
menghambat proses apoptosis pada tahap awal infeksi virus IBD (Meihong dan
Vakharia, 2006).

Page 8 of 22

Pencegahan dan pengendalian penyakit IBD pada ayam pedaging komersial

salah satunya adalah dengan vaksinasi. Ada tiga kategori vaksin yang digolongkan
berdasarkan patogenisitasnya yaitu; mild, intermediate dan virulent. Tipe vaksin IBD
Intermediate paling umum digunakan karena vaksin ini dapat menstimulasi ayam
pedaging dalam memproduksi antibodi lebih awal dari pada tipe vaksin mild, tanpa
menyebabkan kerusakan bursa Fabricius seperti pada tipe vaksin virulen (OIE,
2008). Beberapa faktor yang diduga berkontribusi terhadap keberhasilan vaksinasi,
salah satu diantaranya adalah potensi vaksin. Pemeriksaan terhadap potensi vaksin
impor komersial yang beredar di Indonesia menunjukkan bahwa beberapa vaksin
tidak dapat melindungi ayam dari uji tantang terhadap virus lapangan. Potensi vaksin
berkisar 0% - 80% (Soedijar dan Malole, 2004). Hal ini kemungkinan disebabkan
virus yang digunakan sebagai vaksin mempunyai perbedaan antigenik dengan virus
lapangan, karena virus IBD merupakan virus RNA sehingga mudah mengalami
mutasi. Virus yang sangat ganas terdeteksi pada ayam yang telah divaksinasi.
Dengan demikian dapat dipahami bahwa meskipun pada suatu peternakan telah rutin
dilaksanakan vaksinasi namun wabah masih dapat terjadi bila strain virus vaksin
yang digunakan tidak sesuai dengan strain virus di lapangan. Untuk vaksin
rekombinan ini sendiri merupakan vaksin dari virus yang telah di inaktifkan
sehingga virusnya sudah tidak menjadi patogen lagi. Tetapi vaksin ini akan menjadi
tidak berguna apabila virulent dari virus yang menyerang ayam lebih tinggi atau
kuat (Kabell, et al.,2005).
3.2

Isolasi Protein Rekombinan

Virus IBD dari genus Birnavirus dengan diameter 55-65 nm berbentuk

simetri ikosahedral tanpa amplop, merupakan virus dsRNA dan pada genomnya
terbagi menjadi 2 segmen. Genom A memiliki panjang 3129-3260 bp dan genom B
dengan panjang 2795-2827 bp. Virion mengandung 5 macam protein, yang dikenal
dengan VP2, VP3, VP4, dan VP5 (Segmen A) dan VP1 (Segmen B). Protein VP2
merupakan antigen tipe spesifik dan mengandung epitop yang dapat memicu
pembentukan antibodi netralisasi. Protein VP2 dengan berat molekul 41 kDa
merupakan protein yang paling berperan dalam menginduksi pembentukan antibodi
netralisasi. Protein ini menentukan tingkat virulensi virus dan pada genom penyandi
Page 9 of 22

protein VP2 terdapat daerah hipervariabel yang peka terhadap perubahan sehingga
mudah timbul varian baru (Rahardjo, 2005).
Tahap tahap yang dilakukan untuk isolasi protein rekombinan dari virus IBD
adalah:
a. Isolasi Virus
Virus diisolasi pada telur ayam berembrio (TAB) dan sel fibroblas embrio
ayam (FEA). Bursa Fabrisius ayam penderita IBD digerus dan dibuat suspensi 10%
dengan penambahan antibiotik (Rahardjo, 2005).
Pada TAB perubahan spesifik akibat infeksi virus IBD ditandai dengan adanya
kekerdilan dan perdarahan pada embrio, sedangkan pada selaput korioalantois
terdapat bintil -bintil pock. Virus IBD menyebabkan timbulnya CPE, yaitu berupa
kerusakan sel yang makin meluas dan terjadi secara bersamaan. Virus IBD tipe ganas
(wild type) mudah replikasi di dalam sel B pada bursa Fabricius. Virus IBD tipe
ganas juga dapat berataptasi pada sel-sel selain sel limfoid, seperti sel fibroblast
embrio ayam, namun berakibat terjadinya atenuasi (Siregar, 2009).
b. Identifikasi Virus IBD dengan Indirect FAT
Sel fibroblas embrio ayam yang telah diinokulasi isolat Virus IBD atau gerusan
bursa normal atau terinfeksi dipreparasi pada gelas obyek dan diinkubasi pada suhu
37oC selama 2 jam dalam inkubator. Sel kemudian dicuci dengan PBS sebanyak 3
kali dan difiksasi dengan aseton selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah difiksasi,
slide dikeringkan selama 10 menit pada suhu 37oC dalam inkubator, kemudian
ditambahkan antibodi kelinci anti -virus IBD sebanyak 50 l. Slide diinkubasi
kembali selama 30 menit dalam inkubator 37 oC dalam suasana lembab. Pasca
inkubasi dilakukan pencucicn dengan PBS dan ditambahkan konjugat Ig G goat
anti-rabit yang berlabel FITC sebanyak 50 l dan inkubasi 30 menit dalam inkubator
37oC. Berikutnya slide dicuci dengan bufer FA rinse PH 9,0, direndam selama 10
menit dan dikeringkan. Sebelum slide kering, dilakukan mounting dengan
penambahan FA mounting fluid (gliserol/FA rinse bufer, PH 9,0 {50/50}) dan dibaca
dengan mikroskop fluoresen. Pada uji indirect-FAT, sel bursa Fabricius maupun sel
fibroblas yang terinfeksi virus IBD menunjukkan warna fluoresensi, sedangkan sel
normal tidak (Rahardjo, 2005).

Page 10 of 22

c. Analisis Protein dengan Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Sebanyak 20 l sampel virus ditambahkan 600 l buffer lisis I kemudian
ditambahkan 300 l buffer lisis II dan dicampur baik-baik kemudian dibagi 50 l
untuk setiap tabung steril. Sampel yang mengandung 2000 PFU/l kemudian
dipanaskan pada temperature 65oC selama 15 menit sebelum di -loading pada gel
atau disimpan pada 80oC sampai digunakan lebih lanjut. Sampel yang sudah
dicampur dengan buffer lisis I/II dipanaskan 65oC selama 15 menit kemudian 10 l
sampel

dimasukkan

ke

lubang dengan tip 200 l.

Setelah itu power supply distart dengan kekuatan 30
mA selama 5 jam. Jika
reaksi gel sudah sampai
bawah kemudian dimatikan
dan

plate

dibuka

dipisahkan
dicuci

dan

selanjutnya

dengan

buffer

(Rahardjo, 2005).
Hasil menunjukkan
bahwa dari hasil preparasi
protein didapatkan pita -pita
spesifik

yang

menggambarkan

protein

virus IBD. Berat molekul

(BM) berturut-turut dari atas kebawah adalah protein VP 5 91 kDa, VP2 44 kDa, VP3
34,9 kDa, VP4 28,27 kDa, dan VP1 17 kDa. Protein VP2, VP3 dan VP4 merupakan
poliprotein yang disandi oleh genome pada segmen -A pada bagian kedua dari open
reading frame (ORF). Poliprotein mengalami katalisis dengan sendirinya dan
Page 11 of 22

menghasilkan protein pVP2 (45 kDa), VP4 (29 kDa) dan VP3 (32 kDa). Selama
pematangan pVP2 diproses menjadi VP2 (43-48 kDa) (Rahardjo, 2005).
d. Identifikasi Protein dengan Western Blot
Protein

dari

gel

kemudian

ditransfer ke membrane nitrocellulose

(PVDF) dengan cara memotong kertas
Whatman dan PVDF sesuai dengan
besarnya gel. Enam sheets kertas
absorben pada anoda bufer I dan 3
sheets pada anoda bufer II dan 6 sheets
pada katoda bufer. Membran PVDF
diinkubasikan pada bufer II selama 5
menit kemudian disusun 6 sheets kertas
absorben dari katoda bufer. Selanjutnya
diberi aliran listrik dengan 0,8 mA/cm2
dari gel. Setelah protein ditransfer,
PVDF dicuci dengan aquadest selama 10 menit dan larutan TBS selama 10 menit
yang selanjutnya dilakukan blotting. PVDF blot diblok dengan BSA 10% selama 30
menit pada temperature ruangan kemudian dicuci dengan larutan TBS 2 kali.
Selanjutnya direaksikan dengan antibodi monoklonal dan poliklonal. Setelah itu
diinkubasikan pada temperatur ruangan selama 1 jam. Setelah dicuci dengan larutan
TBS sebanyak 3 kali direaksikan dengan konjugat alkalin fosfatase dan substrat pNPP dan diwarnai dengan fast-red. Akhirnya dikeringkan pada temperatur ruangan.
Dari hasil ini kemudian ditentukan protein spesifik, berat molekul protein dan
kemudian dilakukan isolasi protein (Rahardjo, 2005).
Hasil Western Blot menunjukkan bahwa ke-5 protein bereaksi secara spesifik
dengan antibodi anti-virus IBD. Hal ini dapat diartikan, selama terjadinya infeksi,
kelima protein dapat dikenali oleh sistem imun tubuh, sehingga antibodi yang
terbentuk dapat mengenali kelima protein tersebut. Berdasarkan reaksi masing
masing pita-pita protein terhadap antibodi, maka protein VP 2 paling reaktif bila
dibandingkan dengan protein lainnya. Kedudukan protein VP2 pada bagian luar

Page 12 of 22

virion, memudahkan direspon oleh sistem imun, sehingga merupakan protein

penting dalam pembentukan antibody (Rahardjo, 2005).

e. Identifikasi Protein VP2 dengan Dot Blot

Kertas nitroseulosa (NCM) direndam dalam TBS (0,02 M Tris-HCl; 0,5 M
NaCl; pH 7,5) selama 15 menit dan dikeringkan selama 5 menit. Setelah itu ditetesi
2 l protein VP2 (1-1000 pg/2 l) selama 5 menit pada suhu ruang, kemudian dicuci
3x5 menit dengan TBS-Tween (TBS yang mengandung 0,05% Tween-20) dan
dibloking selama 60 menit dengan bufer blocking (0,9% NaCl; 10 mM Tris-HCl; pH
7,4) yang mengandung 5% creamer. Pasca bloking, NCM dicuci 3X5 menit dengan
TBS-Tween,kemudian dikeringkan dan ditambah antibodi primer (kelinci atau ayam)
1:100 dan 1 : 200 dalam TBS -Tween yang mengandung 1% skim milk selama 1 jam
sambil digoyang di atas shaker. Berikutnya NCM dicuci dengan TBS-Tween 3 x5
menit dan ditambah antibodi sekunder (konjugat) goat anti -rabbit atau anti-chicken
1:1000 selama 1 jam dalam TBS-Tween yang mengandung 1% skim. Setelah itu
dicuci 3 x5 menit dengan TBS-Tween dan dicuci 3 x5 menit dengan TBS tanpa
Tween, untuk ditambah substrat Western blue sebanyak 25 l selama 30 menit.
Reaksi dihentikan dengan pencucian dengan aquades dan dikeringkan di udara
(Rahardjo, 2005).
Reaksi antigen-antibodi

antara

protein VP2 pada SDS-PAGE yang telah

dipotong dan dielektroelusi dengan
antibodi anti-virus IBD ayam dapat
dilihat pada teknik dot-blot. Protein VP2
dengan konsentrasi 1000, 100, 10, dan 1
pg per spot menunjukkan hasil positif,
baik dengan antibodi asal ayam pada
pengenceran 1/100 dan 1/200. Reaksi
spesifik antara protein VP2 dengan
antibodi anti-virus IBD ayam atau
kelinci, baik pada western blot maupun
Page 13 of 22

dot-blot menunjukkan bahwa protein VP2 merupakan protein antigenik (Rahardjo,

2005).
f. Kloning Protein Rekombinan
Setelah dilakukan beberapa deteksi untuk memastikan apakah isolate protein
yang diambil dari virus adalah protein VP 2, maka selanjutnya dilakukan kloning
protein rekombinan tersebut. Kloning dilakukan bertujuan agar isolat protein yang
telah diisolasi dapat disimpan dan jumlahnya diperbanyak untuk tujuan pembuatan
vaksin atau untuk tujuan penelitian lain. Kloning dilakukan dengan cara
menggabungkan protein rekombinan dari vius dengan plasmid dari bakteri yang
digunakan sebagai host, setelah protein rekombinan digabung dengan plasmid
dengan bantuan enzim maka selanjutnya plasmid akan dimasukkan ke dalam sel hos
yaitu bakteri E. coli DH5. Setelah dimasukkan ke dalam sel host maka bakteri
dikembangbiakkan dalam media pertumbuhan bakteri untuk memperbanyak jumlah
bakterinya dan sekaligus protein rekombinan yang ada pada plasmid bakteri (Siregar,
2009).
g. Isolasi Protein Rekombinan
Protein rekombinan yang akan diuji imunogenitasnya diisolasi dari koloni
rekombinan VP2 yang diperoleh dengan cara sentrifugasi 30 ml biakan bakteri
E.coli DH5 yang membawa plasmid rekombinan dengan kecepatan 3000 rpm pada
4oC selama 10 menit. Pelet dicuci dengan PBS tiga kali kemudian dipecah dengan
sonikasi. Supernatan didapat dengan sentrifugasi 3000 rpm pada 4oC selama 10
menit, kemudian dilakukan SDS-PAGE dan Immunobloting dengan menggunakan
antibodi poliklonal IBD dan conjugate Ig G anti Rabbit alkaline phosphatase. Bila
terdapat reaksi antigen antibodi maka pada membrane akan dapat diamati pita
protein yang berikatan dengan antibodi spesifik tersebut (Ernawati, 2006).
Protein rekombinan yang telah diisolasi dari biakan bakteri rekombinan ColiVP2 yaitu protein rekombinan 1, 2, dan 3 setelah direaksikan dengan antibodi
poliklonal IBD menunjukkan beberapa pita yang jelas, hal ini terjadi karena antibodi
IBD mengenal epitop dari protein rekombinan 1, 2 dan 3, sedangkan pada kontrol
koloni nontransforman, koloni biru dan protein E. coli DH5 tidak terdapat pita.
Hasil ini dapat disimpulkan bahwa protein rekombinan bersifat spesifik terhadap
IBD. Hasil imunobloting (Western blot) terlihat pita protein dengan berat molekul 41
Page 14 of 22

kDa, di samping itu terdapat pita protein dengan berat molekul 28 kDa telah
dideteksi dengan Western blot yang merupakan protein VP2 (Ernawati, 2006).
3.3

Uji Imunogenitas dan Uji Tantang

Uji imunogenitas dan uji tantang protein rekombinan dilakukan pada 15 ekor

ayam ras umur 21 hari yang dibagi menjadi tiga kelompok. Kelompok I disuntik
dengan PBS sebagai kontrol. Kelompok II disuntik protein rekombinan dengan dosis
40 g per ekor. Kelompok III disuntik dengan vaksin IBD komersial sebagai
pembanding dengan dosis 103,5 TCID50 per ekor. Penyuntikan dilakukan sebanyak
dua kali secara subkutan den gan jarak penyuntikan 2 minggu. Satu minggu pasca
penyuntikkan yang terakhir dilakukan uji tantang pada semua kelompok ayam
dengan virus lapangan sebanyak 104 TCID50 per ekor secara suntikan. Parameter
yang diamati adalah titer antibodi dan mortalitas (Wang, et al., 2002).
Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa vaksinasi dengan vaksin
aktif attenuated memerlukan booster yang berulang-kali untuk mencapai titer
antibodi yang tinggi, sedan gkan vaksinasi dengan protein rekombinan yang
dicampur dengan adjuvan hanya memerlukan booster satu kali dengan interval satu
minggu (Ernawati, 2006). Hasil ini sesuai dengan hasil beberapa peneliti terdahulu
antara lain yang dilaku - kan oleh (Wang, et al., 2002), dalam penelitiannya
mengaplikasikan vaksin DNA VP2 ditambah dengan adjuvan sintetik oligo
deoksinukleotide atau vaksin DNA VP2 yang diikuti dengan pemberian vaksin aktif
komersial, hasilnya dapat memproteksi 70 80% ayam terhadap gejala klinis IBD
dan kematian.
3.4

Analisis Hasil Penelitian

Data hasil pemeriksaan berupa nilai optical density (OD) titer antibodi

dianalisis dengan uji Anava pola faktorial 4 x 3 yang dilanjutkan dengan uji jarak
berganda Duncan (5%) (Steel and To rrie, 1989) dilakukan untuk membandingkan
pengaruh waktu pengambilan sampel dan jenis antigen yang digunakan (kontrol,
protein dan vaksin) terhadap nilai OD titer antibodi pada uji imunogenitas,
sedangkan untuk membandingkan persentase ayam hidup atau mati pada uji tantang
dianalisis dengan uji Chi square (Ernawati, 2006).
Page 15 of 22

Isolasi dan Karakterisasi Protein Rekombinan

Protein rekombinan yang telah dii solasi dari biakan bakteri rekombinan ColiVP2 yaitu protein rekombinan 1, 2, dan 3 setelah direaksikan dengan antibodi
poliklonal IBD menunjukkan beb erapa pita yang jelas (Gambar 1), hal ini terjadi
karena antibodi IBD mengenal epitop dar i protein rekombinan 1, 2 dan 3, sedangkan
pada kontrol koloni nontransfor - man, koloni biru dan protein E. coli DH5alfa tidak
terdapat pita (Ernawati, 2006).
Hasil ini dapat disimpulkan bahwa protein rekombinan bersifat spesifik
terhadap IBD. Hasil imunobloting (Western blot) terlihat pita protein dengan berat
molekul 41 kDa, di samping itu terdapat pita protein dengan berat molekul 28 kDa
telah dideteksi dengan Western blot yang merupakan protein VP2. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa telah berhasil dilakukan isolasi dan karakterisasi protein
rekombinan VP2, selanjutnya digunakan untuk uji imunogenitas (Ernawati, 2006).
Analisis statistik terhadap uji imunogenitas protein dengan uji Anava Faktorial
dilakukan untuk mengetahui pengaruh waktu pengamatan, perlakuan pemberian antigen maupun interaksi keduanya terhadap titer antibodi (nilai OD) serum ayam.
Berdasarkan uji F titer antibodi menunjukkan perbedaan sangat nyata (p<0,01) di
antara waktu pengamatan (minggu I, II, III dan IV) . Titer antibodi yang dihasilkan
pada pemberian antigen yang berbeda terdapat perbedaan sangat nyata (p<0,01) serta
terdapat pengaruh interaksi sangat nyata (p<0,01) diantara perlakuan kombinasi
(Ernawati, 2006).

Page 16 of 22

Berdasarkan uji Duncan terhadap pengaruh waktu pengamatan (minggu) dapat

diketahui bahwa titer antibodi (nilai OD) tertinggi terdapat pada minggu II dan
minggu III yang keduanya menunjukkan perbedaan nyata (p<0,05) dibanding
dengan minggu I dan minggu IV ( Tabel 1 ).

Hasil analisis statistik dengan uji Duncan (5%) terhadap pengaruh pemberian
antigen menunjukkan, bahwa titer antibodi (nilai OD) tertinggi didapatkan pada
pemberian protein yang menunjukkan perbedaan nyata (p<0,05) dengan kontrol
maupun pemberian vaksin. Titer antibodi (nilai OD) terendah didapatkan pada
kontrol yang juga menunjukkan perbedaan bermakna (p<0,05) dengan pemberian
protein maupun vaksin (Tabel 2).

Hasil analisis statistik dengan uji Duncan (5%) terhadap pengaruh kombinasi
antara waktu penga matan dan pemberian antigen menunjukkan, bahwa titer antibodi
(nilai OD) tertinggi didapatkan pada perlakuan kombinasi minggu II~Protein. Hasil
yang sama juga didapatkan pada perlakuan kombinasi minggu IV~Protein dan
minggu III~Protein. Ketiganya menunjukkan perbedaan nyata (p<0,05) dengan
perlakuan kombinasi lainnya. Titer antibodi (nilai OD) terendah didapatkan pada

Page 17 of 22

minggu I V~Kontrol yang juga tidak menunjukkan perbedaan bermakna (p>0,05)

dengan minggu II~Kontrol, minggu IV~Vaksin, dan minggu III~Kontrol (Tabel 3 ).

Penurunan titer antibodi (nilai OD) pada Kontrol mulai minggu I hingga
mencapai perbedaan bermakna (p<0,05) pada minggu IV. P erlakuan pemberian
Vaksin titer tertinggi dicapai pada minggu III dan sudah menurun kembali pada
minggu keempat, hal ini berbeda dengan pola titer antibodi (nilai OD) pada
pemberian Protein pada Minggu I sudah meningkat, mencapai puncak pada Minggu
II dan bertahan pada Minggu III hingga Minggu IV (Gambar 2).

Page 18 of 22

Perlakuan dengan antigen yang berbeda juga menimbulkan hasil titer antibodi
yang berbeda sangat nyata (p < 0,01) titer antibodi tertinggi terlihat pada perlakuan
dengan pemberian protein, diikuti pada pemberian vaksin dan terendah pada
kelompok kontrol. Ketiganya menunjukkan perbedaan yang bermakna. Protein
merupakan imunogen yang murni dan mempunyai spesifitas yang tinggi sehingga
dapat menghasilkan titer antibodi yang tinggi pula. Sedangkan vaksin selain
mengandung imunogen juga mengandung bahan-bahan lain misalnya pepton dan
skim milk yang akan mengurangi sifat imunogenitas (Ernawati, 2006).
Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa vaksinasi dengan vaksin
aktif attenuated memerlukan booster yang berulang-kali untuk mencapai titer
antibodi yang tinggi, sedan gkan vaksinasi dengan protein rekombinan yang
dicampur dengan adjuvan hanya memerlukan booster satu kali dengan interval satu
minggu. Hasil ini sesuai dengan hasil beberapa peneliti terdahulu antara lain yang
dilakukan oleh Wang, et al., (2002), dalam penelitiannya mengaplikasikan vaksin
DNA VP 2 ditambah dengan adjuvan sintetik oligo deoksinukleotide atau vaksin
DNA VP2 yang diikuti dengan pemberian vaksin aktif komersial, hasilnya dapat
memproteksi 70 80% ayam terhadap gejala klinis IBD dan kematian. Sedangkan
pemberian vaksin DNA VP 2 saja tanpa adjuvan dan pemberian vaksin aktif saja
menyebabkan gejala klinis IBD dan kematian 25 - 45% (Ernawati, 2006).
BAB IV.
PENUTUP
3.1

Kesimpulan
Vaksin rekombinan merupakan vaksin subunit yang dibuat melalui teknik

rekayasa genetika untuk memperoleh fragmen antigenik dari mikroorganisme.

Vaksin ini mengandung protein antigen patogen yang diproduksi dengan teknologi
DNA rekombinan. Adapun keunggulan dan kerugian dari vaksin ini. IBD (Infectious
Bursal Disease) adalah penyakt menular pada ayam dengan ciri khas menyerang
bursa fabricius. Penyakit IBD disebabkan oleh virus bersifat RNA yang memiliki
sifat mudah bermutasi. Pencegahan dan pengendalian yang dapat dilakukan adalah
dengan vaksinasi. Dalam penelitian ini, tahapan yang dilakukan dalam program
vaksinasi antara lain: isolasi virus, identifikasi virus IBD dengan Indirect FAT,
Page 19 of 22

analisis

protein

dengan

Polyacrylamid

Gel

Electrophoresis

(SDS-PAGE),

identifikasi protein dengan Western Blot, identifikasi protein VP2 dengan Dot Blot,
kloning protein rekombinan, dan isolasi protein rekombinan. Dari semua tahapan
tersebut dilakukan uji imunogenitas dan uji tantang. Berdasarkan hasil penelitian
diatas dapat disimpulkan bahwa protein rekombinan VP2 bersifat imunogenik dalam
menimbulkan antibodi. Respon imun yang ditimbulkan protein VP 2 virus IBD
bersifat protektif pada uji tantang. Ditemukan lesi-lesi bursa pada kelompok vaksin.
3.2

Saran
Semoga makalah ini dapat dimanfaatkan bagi para pembaca untuk menambah

wawasan serta membantu menjadi salah satu referensi dalam penulisan ataupun
penelitian selanjutnya. Penulis menerima saran dan kritik demi perbaikan
selanjutnta.

DAFTAR PUSTAKA
Atkinson W., et al. 2000. Epidemiology and Prevention of Vaccine Preventable
Disease. University Veterinary Medicine, USA.
Attwood, T.K., P.N. Campbell, J.H. Parish, A.D. Smith, J.L. Stirling dan F. Vella
(Ed), 2006. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,
Revised Edition. Oxford University Press.
Becht, H., H. Muller And H.K. Muller 1998. Comparative Studies On The Structural
And Antigenic Properties Of Two Serotypes Of Infectious Bursal Disease
Virus. J. Gen. Virol.Pp. 631 640.
Ernawati, R. 2006. Uji Imunogenitas Protein Rekombinan VP2 Virus Infeksius Bursa
pada Ayam. Media Kedokteran Hewan Vol. 22, No. 2.

Page 20 of 22

Gaffar S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Jurusan Kimia Fakultas

Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran,
Bandung.
Hirai,K, And S. Shimakura. 1974. Structure Of Infectious Bursal Disease Virus. J.
Virol. 14: 957 964
Kabell, S., K. J. Handberg, Y. Li, M. Kusk And M. Bisgard. 2005. Detection Of Ibdv
In Vaccinated Spf Chickens. Acta.Vet. Scand. 46: 219 227.
Kindt, T.J., R.A.Goldsby, B.A. Osborne, J. Kuby, 2007. Kuby Immunology.
Freeman, New York.
Meihong,L. And V.N. Vakharia. 2006. Nonstructural Protein Of Infectious Bursal
Disease Virus Inhibits Apoptosis At The Early Stage Of Virus Infection. J.
Virol. 80(7): 3369 3377
Oie (Office International Des Epizooties). 2008. Infectious Bursal Disease
(Gumboro Disease). In: Terrestrial Manual. Chapter 2.3.12.
Radji M. 2009. Vaksin DNA: Vaksin Generasi Keempat. Majalah Ilmu Kefarmasian,
Vol. VI.No. 1.
Rahardjo, A.P, Suwarno. 2005. Imunogenitas Protein VP2 Virus Infectious Bursal
Disease Isolat Lokal sebagai Dasar Pengembangan Vaksin Sub Unit. Media
Kedokteran Hewan Vol. 21, No. 1.
Siregar, C. J. 2009. Skripsi: Gambaran Respon Kebal Terhadap Infectious Bursal
Disease (IBD) pada Ayam Pedaging yang Divaksin IBD Killed Setengah
Dosis dan Ditantang dengan Virus IBD. Fakultas Kedokteran Hewan
Institut Pertanian Bogor.
Soedijar ,L.L. And M.B. Malole. 2004. Potency Test And Cross Reaction Among Ibd
Vaccines. J. Sain Vet. 22: 32 37.
Van Den Berg, T. P. 2000. Acute Infectious Bursal Disease In Poultry: Areview.
Avain Pathol. 29: 175194.
Wang, X., P. Jiang, S. Deen, J. Wu, X, Liu, and J. Xu. 2002. Efficacy of DNA
vaccines against infectious bursal disease virus in chickens enhanced by
coadministration with CpG oligodeoxynucleotide. Avian Dis. 47: 1305-1312.
William, A.E. And T.F. Davison. 2005. Enhanced Immunopathology Induced By
Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus. Avian Pathol. 34:4 14.
Page 21 of 22

Page 22 of 22