BT 141094
BT 141094
Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB
pada bulan September-Desember 2006. Bahan yang digunakan adalah contoh daun muda tanaman pepaya dan jeruk
yang diperoleh dari Kebun Percobaan Sumani, Balitbu
Tropika. Bahan lain yang digunakan adalah PuRe Taq TM
Ready To-GoTM berbentuk butiran (Kit) (GE Healthcare), primer RAPD 1-6 yang mempunyai untaian nukleotida RAPD1,
RAPD2, RAPD3, RAPD4, RAPD5, RAPD6, lambda () DNA,
dan 1 kb DNA ladder. Alat yang digunakan adalah timbangan
analitik, microwave oven, lemari es dan freezer, perangkat
elektroforesis, vortex mixer, mesin PCR (Mastercycler),
waterbath, sentrifus (Prymo R), gelas ukur 100 ml, botol bufer
(Scaatt Duran), mortar dan pestel, spatula, gunting, pipet
ukur, pipet mikro, tips, pH meter, tabung mikrosentrifus, dan
sarung tangan karet.
Persiapan Sampel
Contoh daun muda tanaman pepaya dan jeruk disiapkan
mengikuti kaidah Santoso et al. (2003). Contoh daun dipetik
lalu dimasukkan ke dalam plastik berklip ukuran 10 cm x 7 cm
yang berisi 2-3 ml bufer CTAB ditambah 1% -mercaptoetanol.
Plastik berisi contoh lalu ditekan menggunakan kedua
telapak tangan untuk mengeluarkan udara sehingga seluruh
contoh terlindungi oleh bufer dan menempel pada plastik.
Plastik berisi contoh lalu diberi label dan disimpan dalam
freezer bersuhu -20C dan siap untuk digunakan.
Tahapan isolasi DNA disajikan pada Gambar 1. Teknik
isolasi DNA genom dilakukan secara berurutan sebagai
berikut.
Ekstraksi DNA Genom
Protokol yang digunakan merupakan prosedur ekstraksi
berbasis CTAB yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle
(1987) dan dimodifikasi oleh Santoso (2005), serta dilaksanakan secara preparasi mini. Contoh daun dikeluarkan dari
freezer dan ditimbang 100 mg tanpa tulang daun lalu diletakkan dalam mortar pestel dan ditambah 0,5 ml bufer ekstraksi
CTAB (CTAB: 4,1 g NaCl, 10 g CTAB, 0,5 M EDTA pH 8,0,
13
Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB
Contoh daun
Proses ekstraksi dengan bufer CTAB
t
Proses lisis
Vortex mixer
t
CIA 24:1
Pelet
Supernatan
CIA 24:1
t
Pelet
Dikeringanginkan
Pelet
Supernatan
Pelet
Dikeringanginkan
Pelet + bufer TE 50 l
Gambar 1. Skema proses isolasi DNA genom daun pepaya dan jeruk dengan menggunakan bufer CTAB,
Balitbu Tropika, Solok, 2006
14
Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB
Prosedur RAPD-PCR
Amplifikasi DNA Genom
Tabung PCR berisi PuRe Taq TM Ready To-Go TM berbentuk
butiran (Kit) (GE Healthcare) dilarutkan dengan ddH2O lalu
ditambahkan 2,5 l RAPD primer dan 1 l DNA contoh
sehingga total larutan untuk tiap reaksi menjadi 25 l.
Masing-masing tabung berisi contoh diamplifikasi dengan
pemanasan pendahuluan pada 95C selama 5 menit sebanyak
satu siklus diikuti 45 siklus yang terdiri atas pemanasan
untuk denaturasi pada 95C selama 1 menit, anealing pada
suhu 36C selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72C
selama 2 menit, dan pada siklus terakhir ditambah waktu
pemanjangan pada suhu 72 C selama 10 menit.
Gel Elektroforesis
Setelah proses PCR, campuran contoh dan loading dye
dengan perbandingan 3:1 dimasukkan dalam sumuran gel
1,2% dalam kamar elektroforesis yang sudah diisi bufer TBE
0,5x, diisikan satu sumuran pertama dengan 1 Kb DNA ladder.
Setelah itu elektroforesis dijalankan dengan daya 50 volts
sampai penanda loading dye berada sekitar 1 cm di atas batas
gel bagian bawah.
Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB
15
Gambar 2. Contoh DNA genom daun jeruk dan pepaya hasil isolasi
tanpa nitrogen cair; 1 = jeruk jemari taji, 2 = jeruk krifta,
3 = pepaya dampit, dan 4 = pepaya eksotika; L = DNA
ladder
Gambar 3 . Pola pita produk DNA tanaman jeruk hasil ekstraksi menggunakan nitrogen cair; (1) keprok kacang, (2) keprok
batu 55, (3) keprok singkarak, (4) keprok tawangmangu,
Balitbu Tropika, Solok, 2006
Penggunaan primer RAPD1 dan RAPD6 dengan kandungan G+C 70% menghasilkan pita DNA yang baik. Hal ini
Tabel 1. Kode primer, susunan basa, dan kandungan GC pada primer
Kode primer
RAPD1
RAPD2
RAPD3
RAPD4
RAPD5
RAPD6
OPW19
G+C
(%)
GGTGCGGGAA
GTTTCGCTCC
GTAGACCCGT
AAGAGCCCGT
AACGCGCAAC
CCCGTCAGCA
CAAAGCGCTC
70
60
60
60
60
70
60
Gambar 4 . Pola pita DNA tanaman jeruk hasil isolasi tanpa menggunakan nitrogen cair; lajur no (1) jeruk jemari taji, (2)
jeruk krifta dengan primer (1) RAPD 1, (2) RAPD 2, (3) RAPD
3, (4) RAPD 4, (5) RAPD 5, dan (6) RAPD 6; Balitbu Tropika,
Solok, 2006
16
Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB
DAFTAR PUSTAKA
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure
for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19:
11-15.
Jose, J. and R. Usha. 2000. Extraction of geminiviral DNA from a
highly mucilaginous plant (Abelmoschus esculentus). Plant
Mol. Biol. Rep. 18: 349-355.
Gambar 5. Pola pita DNA tanaman pepaya hasil isolasi tanpa
menggunakan nitrogen cair; lajur no (1) pepaya dampit,
(2) pepaya eksotika dengan primer ( 1) RAPD 1, (2) RAPD 2,
(3) RAPD 3, (4) RAPD 4, (5) RAPD 5, dan (6) RAPD 6; Balitbu
Tropika, Solok, 2006
Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. 1997.
Molecular Tool in Plant Genetic Resources Conservation: A
guide to the technologies. IPGRI Technical Bulletin no. 2.
Lamadji, S. 1998. Pemberdayaan sifat morfologi untuk analisis
kekerabatan plasma nutfah tebu. Bulletin P3GI 148: 17-31.