4 Metode Parafin Hewan
4 Metode Parafin Hewan
4 Metode Parafin Hewan
Nama
: Wahyu Kurniawan
NIM
: J1C107057
Kelompok
: I (Satu)
Asisten
: Denny Gumilang
BAB I
PENDAHULUAN
(Squash), sediaan gosok, Maserasi, dan sediaan sayatan tanpa embedding maupun
dengan embedding (Parafin, seloidin, maupun resin) (Kusuma, 2008).
Pada percobaan kali ini akan digunakan pembuatan sediaan mikroskopis
dengan menggunakan metode parafin. Metode pembuatan sediaan dengan
penyelubungan parafin disebut juga sebagai metode embedding. Pembuatan
sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai
alat pemotongnya. Kelebihn metode ini adalah irisannya jauh lebih tipis dan
prosedurnya juga lebih cepat jika dibandingkan dengan metode seliondin maupun
metode beku. Alat pemotomg mikrotom yang digunakan bekerja berdasarkan
suatu ulir yang berfungsi untuk mendorong maju blok preparat atau pisau
(Pujawati, 2002).
Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya
sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan. Pertamatama organ yang
akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi minimal 24
jam, didehidrasi dengan alkohol bertingkat selama 30 menit, diclearing dengan
xilol murni juga selama 30 menit, diinfiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi
sebagai penyangga
(proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafin
akan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom,
penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya
bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringan
tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah diwarnai
lalu dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi label nama (Santoso, 2002).
1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengenal tahap-tahap pembuatan,
bahan dan alat untuk praktikum teknik pembuatan sediaan irisan jaringan hewan
dengan metode parafin.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhan
ataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialah
irisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin.
Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mkron, tapi dengan metode
parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat
seri
dapat
dikerjakan
dengan
mudah
bila
menggunakan
metode
ini.
Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah
patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan
metode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larut
dengan menggunakan metode ini (Santoso, 2002).
Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam
jaringan dapat dipotong dengan baik dengan menggunakan metode ini. Metode
parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman
jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan hewan
ataupun tumbuhan yang tipis. Preparat parafin ini dilakukan penyelubungan
karena jaringan merupakan bahan yang lunak (Nurliani, 2007).
Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya
sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan. Pertamatama organ yang
akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi minimal 24
jam, didehidrasi dengan alkohol bertingkat selama 30 menit, diclearing dengan
xilol murni juga selama 30 menit, diinfiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi
Mikrotom geser (sliding mikrotome). Pada alat ini, jaringan tetap berada
pada tempatnya, sedang pisaunya yang bergerak. Pada umumnya jaringan
yang akan dipotong dengan mikrotom geser adalah jaringan yang tanpa
penanaman (embedding) terlebih dulu. Disini tidak akan terjadi pita irisan.
Jaringan yang akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan pewarnaan
tunggal, ataupun tanpa pewarnaan terlebih dahulu. Metode ini banyak
dikerjakan untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.
2.
3.
laboratorium, maka dengan sendirinya mikrotom jenis ini lebih banyak digunakan
daripada mikrotom-mikrotom lainnya. Hal ini disebabkan karena irisan yang
diperoleh lebih tipis dibandingkan dengan metode lainnya (Rina, 2010).
Ada 2 macam metode irisan adalah sebagai berikut :
1. Metode irisan dengan tangan.
Pada beberapa macam jaringan, terutama dalam lapangan botani,
pembuatan sediaan dengan cara ini masih dapat dipakai misalnya melihat
susunan daun segar. Dengan mempelajari sediaan seperti ini dapat diperoleh
beberapa keterangan mengenai luas maupun tipe fibrosis didalam jaringan
yang patologis.
dalam
metode
ini
sediaan
didapat
dari
jaringan-jaringan
mikrotom yang telah diuraikan di atas, di mana irisan yang diperoleh saling
terpisah satu sama lain, maka pada irisan yang diperoleh dengan mikrotom jenis
ini ialah jaringan yang terjadi satu sama lain saling bergandengan, sehingga
terbentuk pita yang panjang (Santoso, 2002).
Preparat jaringan hewan dan tumbuhan dapat diperiksa dibawah
mikroskop apabila sudah terlihat warna yang kontrase baik maka diberi canada
balsam lalu ditutup dengan kaca penutup, dan terakhir diberi label preparat
permanen tersebut. Dikarenakan keterbatasan waktu dan tidak adanya mikrotom
yang baik di laboratorium maka pekerjaan tidak bisa sampai selesai. Hasil akhir
dari pekerjaan hanya sampai pada balok parafin keras. Hasil kerja hanya sampai
pada terbentuknya balok parafin. Untuk mendapatkan hal tersebut maka harus
menjalani beberapa prosedur dengan alat dan bahan tertentu (Hasan, 2010).
BAB III
METODE PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 12-21 Mei 2010
bertempat di Laboratorium Dasar Ruang Biologi I Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru.
3.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas objek, gelas
penutup, jarum preparat, pinset, cawan petri, dan mikroskop.
Bahan yang dipergunan antara lain organ dalam mencit (paru-paru,
jantung, hati, dan ginjal), larutan BNF, bahan untuk dehidrasi : alcohol 70 %,
80%, 95%, 100% 1 dan 2, dan xylol. Bahan untuk infiltrasi : xylol dan paraffin,
larutan pewarna hematoksilin ehrlich, pewarna eosin-Y 1% dalam aquades,
entellan, label, kotak paraffin, pinset, scalpel, kapas, seperangkat wadah untuk
proses dehidrasi-clearing, seperangkat jar untuk staining, alat untuk infiltrasi
(oven/paraffin bath), mikrotom, hot plate, waterbath, kuas kecil, gelas objek dan
penutup.
3.3
Prosedur Kerja
4. Diinfiltrasi dalam paraffin 1, paraffin 2, dan paraffin 3 didalam oven masingmasing selama 1 jam.
5. Dibloking dalam kotak-kotak paraffin hingga membeku. Blok yang sudah
beku ditempelkan kuat-kuat pada holder. Kemudian direndam pada xilol 1
dan 2 masing-masing 20 menit.
6. Untuk proses pewarnaan, gelas objek berisi jaringan direndam dalam xylol 1,
2, masing-masing selama 20 menit.
7. Dicelupkan dalam alcohol 100%, 95%, 80%, 70%, 50% dan 30% beberapa
menit celupan. Diwarnai dengan hematoksilin ehrlich selama 5 detik. Dicuci
dengan air ledeng 10 menit dan akuades 1 menit.
8. Dicelupkan ke dalam alcohol bertingkat, 30%, 50%, 70%, dan diwarnai
dengan eosin selama 1 menit.
9. Dicelupkan kedalam alkohol 70%, 80%, dan 96% masing-masing 1 menit.
Kemudian dicelupkan lagi kedalam xilol 1 dan 2 masing-masing 10 menit.
10. Ditutup dengan perekat entelan dan diberi label
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Adapun hasil yang diperoleh pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
Tabel Hasil Pengamatan Sediaan Jaringan Hewan
No.
1.
Gambar
Keterangan
Ginjal
Perbesaran 100x
2.
Hati
Perbesaran 100x
3.
Paru-paru
Perbesaran 100x
4.
Jantung
Perbesaran 100x
4.2 Pembahasan
Praktikum pembuatan sediaan irisan jaringan hewan dengan metode
parafin dapat diketahui bahwa dalam pembuatan preparat hewan lebih mudah
untuk dibuat dan tidak memakan waktu yang panjang. Organ yang digunakan
adalah organ hati, paru-paru, jantung dan ginjal. Hewan yang diambil organnya
adalah mencit. Tetapi ada sebagian organ yang gagal menjadi suatu preparat, hal
ini mungkin disebabkan kurangnya ketelitian dan keterampilan pada saat mengiris
block parafin saat menggunakan mikrotom, sehingga lembaran pita jaringan yang
didapatkan terlalu tebal dan sulit diamati di bawah mikroskop. Selain itu, sebagian
preparat tidak dapat dikenali dengan jelas bagian mana yang digunakan dari
bahan percobaan karena pada saat proses pewarnaan, pencucian dan pencelupan
sediaan ke larutan alkohol ada beberapa kertas label yang terlepas dari kaca objek.
Sehingga hanya preparat yang kertas labelnya masih utuh yang dapat dikenali
dengan benar.
Organ yang digunakan tersebut harus diisolasi terlebih dahulu sebelum
digunakan hal ini bertujuan agar organ yang dijadikan sediaan siap untuk
melakukan berbagai tahap-tahap atau proses dalam percobaan. Proses pembuatan
sediaan preparat setelah dibedah diambil organnya, kemudian dicuci dengan
garam fisiologis agar organ tersebut tidak mengalami pembekuan. Setelah itu
organ difiksasi digunakan larutan BNF selama 24 jam agar sel-sel dari organ
tersebut mati namun strukturnya tidak rusak sehingga memudahkan langkahlangkah kedepannya.
Fiksasi berfungsi untuk mempertahankan bentuk jaringan sedemikian rupa
sehingga perubahan-perubahan bentuk atau struktur sel atau jaringan yang
mungkin
meningkatkan indeks bias jaringan sehingga jaringan dapat terwarnai dengan baik.
Larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan alkohol 70 % selama 1 jam. Kemudian
sehingga perubahan yang terjadi hanya sekecil mungkin. Selain itu fiksasi berguna
untuk meningkatkan indeks bias jaringan sehingga jaringan dapat terwarnai
dengan baik. Didealkoholasi, alkohol yang tadi dibuang dan diganti larutan secara
berturut alkohol : xilol = 3 : 1, alkohol : xilol = 1 : 1 dan alkohol : xilol = 1 : 3
masing-masing selama 30 menit. Hal ini bertujuan untuk menggantikan tempat
alkohol dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu
solven atau medium penjernih menjelang proses penanaman sebelum proses
penyayatan. Fungsi dari dehidrasi itu sendiri ialah untuk mengeluarkan air dari
dalam jaringan dengan menggunakan bahan kimia tertentu.
Setelah tahapan fiksasi, organ didehidrasi dengan larutan alkohol bertingkat
yang bertujuan untuk mengurangi kandungan air dari organ tersebut sehingga saat
sudah menjai sediaan tidak akan cepat rusak. Selain itu untuk memudahkan
peresapan parafin. Organ selanjutnya di clearing dengan larutan campuran antara
xilol dan alkohol dengan perbandingan tertentu yaitu 3:1, 1:1, 1:3 dan xilol murni
dengan tujuan untuk membersihkan sisa-sisa alkohol dari organ dan membantu
proses penyerapan parafin. Tahapan berikutnya yaitu perendaman dalam parafin,
tahapan ini biasanya dilakukan didalam oven agar saat organ dimasukkan dalam
Kendala yang dialami pada saat pembuatan sediaan irisan jaringa hewan
dengan menggunakan metode parafin ini, salah satunya kesulitan atau kurangnya
keterampilan dalam pembuatan preparat irisan saat pemotongan dengan
menggunakan mikrotom. Ada beberapa jenis mikrotom yang dapat digunakan
sebagai alat pemotong sediaan antara lain hand microtom, rocking microtom,
rotary microtom, freezing microtom, dan sliding microtom. Sedangkan yang
digunakan pada praktikum kali ini adalah hand microtom. Hal inilah yang
menyebabkan proses pemotongan yang paling sulit dilakukan karena dengan
menggunakan mikrotom tangan seringkali praktikan sulit untuk mengukur
ketebalan dari sediaan yang akan dipotong. Sehingga ada yang terlalu tebal dan
ada yang terlalu tipis, hal ini menyebabkan irisan sediaan mudah hancur pada saat
diletakkan di atas kaca objek.
Beberapa kesukaran pada saat pemotongan sediaan parafin antara lain; pita
tidak terbentuk, hal ini kemungkinan karena pisau yang tumpul; pita melengkung
atau bengkok, hal ini kemungkinan karena tepi pisaunya yang tidak rata; sayatan
tertekan, mengerut, atau berdempet, hal ini kemungkinan karena sudut pisau yang
terlalu kecil dan mata pisau yang terlapis dengan sisa parafin; sayatan remuk dan
cenderung lepas dari parafin, hal ini kemungkinan karena proses dehidrasi dan
clering yang tidak sempurna; pita belah; sayatan terangkat dari pisau saat blok
parafin naik; dan permukaan sayatan yang bergelombang.
Hasil pengamatan yang didapatkan dari preparat atau sediaan irisan
jaringan hewan dengan metode parafin ini ada beberapa perbedaan yang nyata
antara ginjal, hati, dan paru. Preparat ginjal memmiliki warna yang paling cerah,
ini dikarenakan proses pengirisannya dilakukan dengan sangat tipis sehingga
memberikan bayangan yang terang. Preparat organ hati dengan perbesaran 100x
pada umumnya memberikan bayangan yang redup dan berwarna coklat tua
sehingga tidak bagian sel hati tidak dapat terlihat dengan jelas, terdapat
gelembung-gelembung kecil yang mengindikasikan prosesnya belum begitu
sempurna. Preparat organ paru-paru berwarna coklat tua dan bayangan yang
redup, hal ini kemungkinan dikarenakan oleh perendaman yang terlalu lama
sehingga membuat perubahan warna pada organ.
Keunggulan dari metode parafin, antara lain : irisan dapat jauh lebih tipis
dari pada menggunakan metode beku maupun seloidin, dengan metode parafin
tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron, irisan-irisan yang bersifat seri
dapat dikerjakan dengan mudah, dan prosesnya lebih cepat dari metode lain.
Sedangkan kelemahan dari metode ini adalah jaringan menjadi keras, mengerut
dan mudah patah, jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan, bila
menggunakan metode ini, dan sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan
metode ini.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan
sebagai berikut :
1. Dalam pembuatan preparat hewan lebih mudah untuk dibuat dan tidak
memakan waktu yang panjang.
2. Hasil pengamatan yang didapatkan dari preparat atau sediaan irisan jaringan
hewan dengan metode parafin ini sulit untuk dibedakan antara hati, paru-paru,
jantung dan ginjal. Selain itu, juga sulit di amati jaringan apa yang digunakan
sebagai preparat karena warna dan bentuknya sama.
3. Kelebihan-kelebihan dari metode parafin, yaitu: irisan dapat jauh lebih tipis,
tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron, irisan-irisan yang bersifat seri
dapat dikerjakan dengan mudah, dan prosesnya lebih cepat dari metode lain.
4. Kelemahan dari metode ini adalah jaringan menjadi keras, mengerut dan
mudah patah, jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan, dan
sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan metode ini.
5.2 Saran
Sebaiknya untuk praktikum yang akan datang hendaknya praktikan harus
benar-benar menyiapkan bahan terlebih dahulu agar praktikum berjalan dengan
lancar. Selain itu kebersihan ruangan juga harus tetap terjaga.
DAFTAR PUSTAKA